生物學(xué)案：課堂探究基因工程的基本操作程序

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精課堂探究探究點(diǎn)一目的基因的獲取和基因表達(dá)載體的構(gòu)建·問題導(dǎo)引·基因疫苗指的是DNA疫苗,即將編碼外源性抗原的基因插入含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi)，讓其在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答.抗原基因在一定時(shí)限內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，不斷刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，使之達(dá)到防病的目的.思考：（1）如何獲得更多數(shù)量的編碼外源性抗原的基因以用于基因工程？該過程必需的酶是什么？（2）含有目的基因和表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒在基因工程中叫什么名稱？該結(jié)構(gòu)必需的組成部分包括哪些？提示：（1）通過PCR技術(shù)能獲得更多數(shù)量的編碼外源性抗原的基因。PCR必需的酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶即Taq酶。（2）含有目的基因和表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒在基因工程中叫基因表達(dá)載體，基因表達(dá)載體必需的組成部分包括啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)等?！っ麕熅v·1．DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋場(chǎng)所細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）在PCR擴(kuò)增儀內(nèi)酶DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)溫度條件細(xì)胞內(nèi)溫和條件需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行合成的對(duì)象DNA分子DNA片段或基因聯(lián)系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進(jìn)行物質(zhì)合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進(jìn)行催化④引物:均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸特別提醒①PCR技術(shù)不需要解旋酶,但需利用90～95℃高溫使DNA分子解旋。②熱穩(wěn)定的DNA聚合酶能在高溫中保持酶的活性,具有耐高溫的特點(diǎn)，是PCR技術(shù)的關(guān)鍵工具之一.2．從基因文庫(kù)中獲取和人工合成目的基因的比較方法從基因文庫(kù)中獲取人工合成從基因組文庫(kù)中獲取從通過反轉(zhuǎn)錄法形成的cDNA文庫(kù)中獲取化學(xué)合成法反轉(zhuǎn)錄法過程優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單專一性強(qiáng)專一性強(qiáng),可產(chǎn)生自然界中不存在的新基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)缺點(diǎn)工作量大，盲目性大，專一性差操作過程較復(fù)雜，技術(shù)要求過高適用范圍小操作過程復(fù)雜，mRNA生存時(shí)間短，技術(shù)要求高3.基因表達(dá)載體的組成（見下圖）基因表達(dá)載體模式圖（1）目的基因：外源DNA分子的有效片段。(2）啟動(dòng)子:是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端,它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)。（3）終止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段.終止子相當(dāng)于一盞紅色信號(hào)燈，使轉(zhuǎn)錄到此終止。（4）標(biāo)記基因:作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來，如抗生素抗性基因就可以作為這種基因。特別提醒①啟動(dòng)子與目的基因的表達(dá)有關(guān)，復(fù)制原點(diǎn)與表達(dá)載體的復(fù)制有關(guān)。②不同的組織細(xì)胞需要的啟動(dòng)子不同即啟動(dòng)子具有組織細(xì)胞特異性.4．基因表達(dá)載體的功能(1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代。（2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用.5．基因表達(dá)載體的構(gòu)建步驟(1）用同一種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，使其產(chǎn)生相同末端.(2）將切下的目的基因片段與切開的質(zhì)?；旌?，再加入適量DNA連接酶，使目的基因插入質(zhì)粒的切口處，形成一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。構(gòu)建過程如下圖所示.特別提醒選擇限制酶處理質(zhì)粒和外源DNA時(shí),應(yīng)保證酶切位點(diǎn)不在目的基因內(nèi)部和啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因（至少一個(gè)）、復(fù)制原點(diǎn)內(nèi)部，以避免基因表達(dá)載體必需的這些結(jié)構(gòu)失去原有作用。【例題1】請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題。（1)基因工程的核心步驟是____________________。（2）利用______技術(shù)可以獲得大量的目的基因。該技術(shù)利用__________的原理，將基因的核苷酸序列不斷加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng).(3）圖中a______位于基因的首端,是__________識(shí)別和結(jié)合的部位?？股乜剐曰虻淖饔檬亲鳛開_________，用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因.解析：基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建.要得到大量的目的基因，可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增,PCR技術(shù)的原理是DNA分子復(fù)制。該基因表達(dá)載體中a表示的是啟動(dòng)子，其中有與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位?？股乜剐曰虻淖饔檬亲鳛闃?biāo)記基因，用于鑒別受體細(xì)胞是否導(dǎo)入了目的基因。答案：（1）基因表達(dá)載體的構(gòu)建(2)PCRDNA雙鏈復(fù)制（3）啟動(dòng)子RNA聚合酶標(biāo)記基因典型方法識(shí)記基因表達(dá)載體的應(yīng)有片段及各片段的作用是解答此類題型的關(guān)鍵。應(yīng)依據(jù)基因表達(dá)載體的作用圍繞目的基因按順序識(shí)記基因表達(dá)載體應(yīng)有的片段：變式訓(xùn)練1下列關(guān)于對(duì)基因表達(dá)載體構(gòu)建的一些說法，不正確的是（)A．需要限制酶和DNA連接酶參與B．基因表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子和終止密碼C．通常用抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因D．基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心解析：基因表達(dá)載體的構(gòu)建關(guān)系到目的基因在受體細(xì)胞中能否表達(dá)，它是基因工程的核心,它的構(gòu)建需要限制酶和DNA連接酶參與,它的結(jié)構(gòu)應(yīng)由目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等組成，終止密碼是指位于mRNA上的不編碼蛋白質(zhì)的三個(gè)相鄰堿基，是翻譯結(jié)束的位點(diǎn)，而終止子是位于DNA上三個(gè)相鄰的堿基,它是轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點(diǎn)。答案：B探究點(diǎn)二將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基，，因的檢測(cè)與鑒定·問題導(dǎo)引·運(yùn)用基因工程技術(shù)，將抗菜青蟲的Bt基因轉(zhuǎn)移到優(yōu)質(zhì)油菜中,培育出轉(zhuǎn)基因抗蟲油菜。這一品種在生長(zhǎng)過程中能產(chǎn)生特異的殺蟲蛋白,對(duì)菜青蟲有顯著抗性，能大大減輕菜青蟲對(duì)油菜的危害，提高油菜產(chǎn)量，減少農(nóng)藥使用量，保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境.思考：（1）將抗菜青蟲的Bt基因轉(zhuǎn)移到優(yōu)質(zhì)油菜細(xì)胞并在其中維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程在基因工程中稱為什么？列舉將目的基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并在其中維持穩(wěn)定和表達(dá)常用的方法.(2）轉(zhuǎn)基因抗蟲油菜是否培育成功需要檢測(cè)該品種在生長(zhǎng)過程中能否產(chǎn)生特異的殺蟲蛋白,簡(jiǎn)述該過程常用的檢測(cè)方法.提示：（1）轉(zhuǎn)化.植物基因工程常用的轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法等。（2）從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，若有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品（例如殺蟲蛋白）?！っ麕熅v·目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法細(xì)胞類型方法轉(zhuǎn)化過程特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法目的基因插入到Ti質(zhì)粒的TDNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→插入到植物細(xì)胞中的染色體DNA上→目的基因表達(dá)經(jīng)濟(jì)、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物基因槍法目的基因包裹在微小的金粒子或鎢粒子表面→用基因槍高速射入受體細(xì)胞或組織中→目的基因表達(dá)成本較高，是單子葉植物中常用的轉(zhuǎn)化方法花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，滴加目的基因,使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法目的基因表達(dá)載體提純→取卵(受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物最為有效的將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的方法微生物細(xì)胞Ca2＋處理法Ca2＋處理微生物細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→將基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合在緩沖液中→一定溫度下促使感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效特別提醒①將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，受體細(xì)胞可以是體細(xì)胞和受精卵，因?yàn)橹参矬w細(xì)胞具有全能性。②將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，受體細(xì)胞是受精卵，不能用體細(xì)胞，因?yàn)楦叨确只膭?dòng)物體細(xì)胞的全能性受到限制。③微生物細(xì)胞作為受體細(xì)胞具有繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等優(yōu)點(diǎn).④將基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒）導(dǎo)入農(nóng)桿菌的常用方法是Ca2＋處理法。Ca2＋（或CaCl2溶液）對(duì)微生物細(xì)胞的作用是增加細(xì)胞壁的通透性。2．目的基因的檢測(cè)與鑒定類型步驟檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果分子檢測(cè)第一步目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞DNA分子雜交技術(shù)（DNA和DNA雜交）是否顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA雜交)是否顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交是否顯示出雜交帶個(gè)體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)，以確定是否具有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同特別提醒①不論是復(fù)制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測(cè)，都是在體外進(jìn)行的。②基因操作過程中有多個(gè)步驟需要檢測(cè)，此處只講了目的基因的檢測(cè),還有目的基因是否被整合到了運(yùn)載體上、運(yùn)載體是否進(jìn)入了受體細(xì)胞等都需要檢測(cè).③幾個(gè)檢測(cè)步驟環(huán)環(huán)相扣，從前到后依次進(jìn)行，缺一不可.【例題2】下列用于判斷目的基因是否轉(zhuǎn)移成功的方法中，不屬于分子檢測(cè)的是（）A．通過害蟲吃棉葉看其是否死亡B．轉(zhuǎn)基因生物基因組DNA與DNA探針能否形成雜交帶C．轉(zhuǎn)基因生物中提取的mRNA與DNA探針能否形成雜交帶D．轉(zhuǎn)基因生物中提取的蛋白質(zhì)能否與抗體形成雜交帶解析：分子水平的檢測(cè)包括三個(gè)方面：通過DNA雜交檢測(cè)目的基因是否插入受體細(xì)胞染色體的DNA上；通過RNA與DNA雜交，檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄;通過抗原—抗體雜交，檢測(cè)目的基因是否翻譯.通過害蟲取食棉葉看其是否死亡，屬于個(gè)體生物學(xué)水平的檢測(cè).答案：A典型方法明確目的基因檢測(cè)的水平、步驟、方法原理是解答此類題型的關(guān)鍵。DNA分子雜交、DNA與mRNA雜交的原理都是堿基互補(bǔ)配對(duì);抗原和抗體雜交的原理是抗原和抗體的特異性識(shí)別與結(jié)合；個(gè)體水平的鑒定原理是對(duì)有關(guān)轉(zhuǎn)基因性狀進(jìn)行個(gè)體水平的對(duì)照實(shí)驗(yàn).變式訓(xùn)練2目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過鑒定和檢測(cè)才能知道.下列屬于目的