基因工程復習資料

基因工程（geneticengineering）：就是在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遺傳物質（基因），在體外切割，再和一定的載體拼接重組，然后把重組的DNA分子引入細胞或生物體內，使這種外源DNA（基因）在受體細胞中進行復制與表達，按人們的需要繁殖擴增基因或生產不同的產物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并能穩(wěn)定地遺傳給下代。2、基本技術路線：分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）轉（入宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）基因工程的基本要素：目的基因、克隆載體、工具酶、受體細胞載體(vector)：基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。作為克隆載體必須具備的條件：至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。應有一個或幾個限制性內切酶的單一識別位點，以供外源DNA的插入。應有一個或多個利于檢測的遺傳表型，易于識別和篩選。如抗藥性、顯色表型等，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞。適當的拷貝數。載體的分類：按載體的來源分：質粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、植物病毒載體、動物病毒載體、人工染色體等。按用途分：克隆載體（clonevector）：主要用于擴增或保存DNA片段，是最簡單的載體，其上有復制子即可。表達載體（expressionvector）：用于一個基因的蛋白表達，是在常規(guī)載體的基礎上衍生而來，這類載體既有復制子，更要有強啟動子。穿梭載體（shottlevector）：含有兩個不同的復制子，能在兩類不同的受體細胞中復制。質粒載體的生物學特性：獨立于染色體外的，能自主復制且穩(wěn)定遺傳的雙鏈共價閉合的環(huán)狀DNA分子，依賴宿主細胞的存在。pBR322的優(yōu)點：1、具有較小的分子量，4363bp。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號：TetrAmpr插入失活效應3、具有較高的拷貝數。pBR322質粒的結構來源：來自pSCl01的四環(huán)素抗性基因Tetr；來自ColEl的衍生物pMBl的松弛復制起點ori；來自pSF2124的氨芐青霉素抗性基因Ampr。pUC18和pUC19載體的優(yōu)點：具有較小的分子量（2.685kb）和更高的拷貝數、抗氨芐青霉素、可進行藍白斑選擇、有MCS。pUC系列的質粒載體，包括以下四個部分：（1）改進的pBR322的復制起點(ori)（2）Ap基因，但DNA序列發(fā)生變化，不再含原來限制性核酸內切識別位點（3）lacZ`基因：大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼的α-肽鏈的DNA序列（4）在lacZ`基因內部靠近5`端有一段MCS區(qū)段。篩選方法：插入失活，藍白斑篩選，定向克隆。λ噬菌體的結構特點：噬菌體結構：最常見的是具尾部結構的二十面體型、無尾部結構的二十面體型、線狀體型。λ噬菌體的結構缺點：（1）基因組太大。（2）酶切點太多。如：它有5個EcoRⅠ位點，7個HindⅢ位點。（3）野生型只能接納一定長度的DNA，相當于λ噬菌體的75-105%，那么只能接納49kb×5%=2.45kb的DNA。λ噬菌體分子特點：（1）溫和噬菌體，長度為48502bp；（2）雙鏈線性DNA；（3）具有cos位點，可以環(huán)化。DNA兩端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點。λ噬菌體的包裝限制范圍：正常野生型λDNA長度的75%—105%。只能容納一定長度的DNA。36kb—51kb之間。插入的載體一定要有篩選標記。插入型載體：外源DNA直接插入已構建載體中，如gt10、gt11、Charon6等。插入型載體只能插入較小的外源DNA片段（0-11kb)。替換型載體：λDNA進一步去掉大多數的非必需片段，保留了作為載體的必需的左臂（含與包裝蛋白有關的基因）和右臂（含與裂解生長有關的基因）。在左右臂間用一段填充片段替換了與溶源循環(huán)有關的基因片段。λ-DNA載體的優(yōu)點：λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌、λ-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為23kb，遠遠大于質粒的裝載量、重組λ-DNA的篩選較為方便。柯斯質粒結構組成（5－7kb）：質粒的復制子抗藥性基因幾個限制性酶的單一位點cos序列和控制包裝的序列。柯斯質粒的優(yōu)點：1）具有噬菌體的特性：有λ噬菌體的高效感染能力2）具有質粒載體的特性：具有質粒復制子，在寄主細胞內能象質粒一樣復制；具有抗生素的抗性基因，可作為篩選標記。3）有較高容量的克隆能力，30-45kbM13結構和組成特點：外型呈絲狀，由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成。不裂解宿主細胞，但抑制其生長。DNA全長6407個核苷酸，有11個基因。在基因Ⅱ和基因Ⅳ之間有一個較長基因間隔區(qū)段，是外源基因插入的部位。M13載體的優(yōu)點：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal顯色反應，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。M13噬菌體作為載體具有幾個重要的特點：（1）閉合環(huán)狀單鏈（+DNA）。（ssDNA）（2）復制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。（3）復制型DNA（RFDNA）和ssDNA都能轉染感受態(tài)大腸桿菌，并產生噬菌斑。（4）不存在包裝限制。（5）可產生大量的含有外源DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測序。人工染色體載體：利用染色體的復制元件來驅動外源DNA片段復制的載體。其裝載外源DNA片段的容量可以與染色體的大小媲美。YAC載體應含有下列元件：酵母染色體的端粒、酵母染色體的復制起點、酵母染色體的著絲粒、酵母系統的選擇標記、大腸桿菌的復制子、大腸桿菌的選擇標記。限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）：定義：是一類能識別雙鏈DNA分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。主要從原核生物中分離純化出來。1）同裂酶（isoschizomers）：來源不同，識別位點和切割位點均相同的限制性內切酶。即同裂酶產生同樣的切割，形成同樣的末端。同裂酶對識別序列的甲基化狀態(tài)有不同的限制性反應。2）同尾酶（isocaudamer）：來源不同，識別序列也不相同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。3）同位酶：識別序列相同，但切割位點不同。限制性內切酶酶切反應的影響因素：1）酶切反應的溫度不同的限制性內切酶具有不同的最適反應溫度。大多數標準反應溫度是37℃，但也有例外。如：SmaI反應最適溫度為25℃，ApaI則為30℃。2）限制性核酸內切酶緩沖液Tris-HCl（50mM）pH7.5、MgCl2（10mM）、NaCl（0-150mM部分酶切：指選用的限制性核酸內切酶對其在DNA分子上的全部識別序列進行不完全化的切割。導致部分酶切的原因：底物DNA的純度低、酶的用量不足、反應緩沖液和溫度不適宜、反應時間不足等。星號活性：限制性內切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、PH等條件下才表現最佳切割能力和位點的專一性。當反應條件改變時，許多酶的識別位點會改變，導致識別與切割序列的非特異性，這種現象稱為星號活性。酶活性單位：1個酶活性單位就是指1min能轉化1mmol底物的酶量。DNA連接酶：能催化雙鏈DNA片段靠在一起的3′羥基末端和5′端磷酸基團末端之間形成的磷酸二酯鍵，使兩末端連接的一種核酸酶。DNA聚合酶：作用是指在引物和模板的存在下，把脫氧核糖核苷酸（dNTP）連續(xù)地加到引物鏈的3’–DNA連接酶能夠封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口，但不能封閉裂口。缺口（nick）：即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現的單鏈斷裂；常用連接酶：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶（常用）。既能進行粘性末端的連接，又能進行平末端的連接，但E.coliDNA連接酶進行平末端連接的效率低。DNA連接酶的連接條件：必須是兩條雙鏈DNA、一條鏈的3‘末端有游離的羥基（-OH），而另一條鏈的5’T4多核苷酸激酶：是一種磷酸化酶，可將ATP的磷酸基團轉移到DNA或RNA的5‘末端。1）5‘加磷酸基團。對于缺乏5‘磷酸的DNA或合成接頭進行磷酸化。2）末端標記。末端轉移酶TDT來源：小牛胸腺活性：不依賴模板的DNA聚合酶，能催化dNTP摻入DNA3′-OH末端。當反應液中只有一種脫氧核苷酸時，可形成僅有一種核苷酸組成的3′尾巴，稱之為同聚物加尾。功能：1）主要用于給外源DNA片段及載體分子加上互補的同聚物尾巴，便于連接。2）末端標記堿性磷酸酶：細菌堿性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，簡稱BAP）、小牛腸堿性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，簡稱CIP）特性：催化除去DNA或RNA5′端的磷酸基團。功能：1）DNA分子片段5′末端的去磷酸化，防止自身連接。2）可作為5′-末端標記的DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳基本原理：1、DNA分子的磷酸基團在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下DNA分子向正極泳動。2、瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用瓊脂糖的分子篩效應，遷移速度與分子量的對數值成反比關系。因而就可依據DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。3、溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據此可粗略估計樣品DNA濃度。分子雜交技術：分子雜交是用于檢測混合樣品中特定的核酸分子和蛋白質分子是否存在，以及其相對分子質量的大小的一種方法。雜交技術：是利用DNA分子的變性、復性以及堿基互補配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進行探查的技術。Southern雜交(預雜交、雜交、洗膜)分子雜交：預雜交：

將結合了DNA分子的濾膜先與特定的預雜液進行預雜交，也就是將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附。雜交：在一定的溶液條件和溫度下，將標記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的DNA分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上。洗膜：

經過一定的洗滌程序將游離的探針分子除去。探針（probe）：用作檢測的被標記的短片段特異DNA或RNA序列。探針的種類：基因組DNA探針、cDNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針標記物：同位素標記：32P、35S、3H等。非同位素標記：地高辛、生物素、熒光素等探針標記方法：1、均勻標記：切口平移法和隨機引物法2、末端標記法：KlenowDNA聚合酶3’末端補平反應、T4多核苷酸激酶：5‘末端引入標記磷酸基團、末端轉移酶3‘切口平移標記法：DnaseⅠ使DNA雙鏈產生缺口、DNA聚合酶將生物素標記的dNTP插入到缺口的3`端隨機引物法：以6~8個核苷酸長的序列隨機的寡核苷酸作為引物，在Klenow片段作用下，加入帶有標記的dNTP進行隨機擴增，即可形成放射性同位素標記的DNA探針。Northern雜交：檢測特定RNA（主要是mRNA）分子的方法。與Southern雜交的不同：靶核酸：RNARNA電泳:變性凝膠電泳應用：主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的轉錄情況Western雜交：蛋白雜交/蛋白質的免疫印跡。檢測蛋白質，即將電泳分離的蛋白質轉移到固相載體上，通過抗體以免疫反應形式檢測濾膜上是否存在被抗體識別的蛋白質，并判斷其分子量。所用的探針不是DNA或RNA，而是針對某一蛋白質制備的特異性抗體。Western雜交主要用來檢測細胞或組織樣品中是否存在能被某抗體識別的蛋白質，從而判斷在翻譯水平上某基因表達與否、表達量、分子量。菌落（或噬菌斑）原位雜交：直接以菌落或噬菌斑為對象來檢測重組子的技術。因為生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，是按照原來的位置不變的轉移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，故也稱為原位雜交。聚合酶鏈式反應PCR：是一種選擇性體外擴增DNA方法，能在短時間內大量擴增特定的ＤＮＡ片段的分子生物學技術。PCR基本原理：變性（denaturation）：將模板DNA置于94℃左右，使dsDNA在高溫下解鏈成為ssDNA；退火（annealing）：將溫度降至55℃左右，使引物與模板的互補區(qū)相結合；延伸（extension）：在72℃PCR反應基本要素：引物（primer）、酶（TaqDNApolymerase）、dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、模板（template）、緩沖液（buffer）PCR的反應條件及基本程序：1、變性溫度與時間一般94℃30s此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗2、退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結合；復性時間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結合。溫度越高，產物的特異性也就越高。3、延伸溫度與時間延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。延伸反應時間：根據待擴增片段長度而定1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min（足夠）延伸時間過長會導致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些4、循環(huán)次數循環(huán)次數：在25～30次內，DNA擴增以指數方式增加。后期會出現平臺效應，一些不利因素會產生，非特異性產物的量亦隨之增多。5、常規(guī)程序。94℃5min（預變性）94℃30s55重組質粒DNA分子導入大腸桿菌的方法——轉化。CaCl2誘導轉化、電轉化法CaCl2誘導轉化法：對細菌細胞進行轉化的關鍵是細胞處在感受態(tài)。原理及過程：將處于對數生長期的細菌置于0℃的CaCl2低滲溶液，細胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；Ca2+與DNA結合形成抗DNase的羥基-磷酸鈣復合物，黏附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，細胞吸收DNA復合物，在培養(yǎng)基中生長數小時后，球形細胞復原并增殖。該法重復性好，操作簡便快捷，每ugDNA可得到5×106～2電穿孔轉化法：亦稱為電轉化法或電擊法?；驹恚簩⑹荏w細胞置于適當的外加電場，利用高壓電脈沖使細胞表面形成暫時性的微孔，從而促進外源DNA的有效吸收，但細胞不會受到致命傷害，一旦脫離脈沖電場，被擊穿的微孔即可復原。轉化率：每ugDNA可以得到109－1010轉化子。電轉化不僅可用于大腸桿菌細胞，也可用于幾乎所有的細胞。重組子的篩選與鑒定方法：1、遺傳標記篩選（載體與目的基因本身）2、DNA片段大小檢測3、PCR檢測法4、核酸分子雜交5、目的基因表達產物檢測遺傳標記篩選（初步篩選）抗藥性標記插入失活選擇法：將外源DNA片段插在BamHI位點：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcsβ-半乳糖苷酶顯色反應選擇法將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標記基因內部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落重組子（Apr+lacZ-）根據插入基因的表型選擇法：利用插入的外源基因的表達產物特性進行直接選擇（只在特定條件下）基本原理：轉化進來的外源DNA編碼的蛋白，能夠對大腸桿菌宿主菌株所具有的突變體發(fā)生體內抑制或互補效應，從而使被轉化的宿主細胞表現出外源基因編碼的表型特征。DNA片段大小檢測：1）直接電泳檢測法根據有外源DNA片段插入的重組質粒與載體DNA之間大小的差異來區(qū)分重組子與非重組子。從轉化后的菌體克隆中分離質粒，電泳、比較其分子量。2）限制性內切酶酶解分析法不僅可以進一步篩選鑒定重組子，而且能判斷外源DNA片段的插入方向及分子質量大小等。將重組DNA分子限制性酶切點圖譜與空載體圖譜作對比，根據各種酶切所得到的DNA片段的大小及變化，即可推測有無外源DNA的插入，并確定各插入片段的相對位置。PCR擴增檢測法：利用合適的引物，從初選出來的陽性克隆中提取質粒DNA為模板進行PCR，通過對PCR產物的電泳分析來確定目的基因是否插入重組子。過程：1.從重組克隆中提取質粒（或DNA）2.用外源DNA序列設計引物或載體的通用引物作PCR3.電泳檢測是否有PCR產物核酸分子雜交：Southernblotting用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品從宿主細胞中提取質粒載體DNA，再用探針雜交。只有帶有插入片段的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。Sanger雙脫氧鏈終止法：通過DNA復制來識別四種堿基的方法，即雙脫氧鏈終止測序方法?；驹恚弘p脫氧核苷酸分子的脫氧核糖的3‘位置的-OH缺失。當它與其他正常核苷酸混合在同一個擴增反應體系中時，在DNA聚合酶的作用下，雖然它也能夠象正常核苷酸一樣參與DNA合成，但是，由于它自身3'位置-OH的缺失，至使下位核苷酸的5'磷酸基無法與之結合。利用DNA聚合酶進行引物延伸反應；其引物是帶有放射性標記的，可通過放射自顯影檢出；雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP）作為鏈終止劑；建立4個系統，在一個膠板上同時電泳，就可讀出模板鏈的互補鏈的順序。DNA序列的自動測定：基本原理：sanger雙脫氧鏈末端終止法、采用PCR測序模式核心技術：采用4種熒光染料來分別標記4種雙脫氧核糖核苷酸采用熒光替代放射性核素標記是實現DNA序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，經Sanger測序反應后，混合四種鏈終止產物，同一泳道內電泳（平板電泳或毛細管電泳）將各熒光標記片段分開，同時通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，到達檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。基因文庫(genelibrary)：在細菌中增殖來自某一生物的染色體基因組DNA（或來自某一組織所有不同的mRNA的每一種cDNA分子）所形成的全部DNA片段克隆的集合體。基因組文庫：指將某一生物基因組DNA片段化并全部克隆后所得的重組子群體的總稱。cDNA文庫(cDNAlibrary)：是指將某種生物體基因組轉錄的全部mRNA經反轉錄產生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫?；蚪MDNA文庫的構建流程：1、載體的制備2、基因組DNA的分離制