GENE-ENGINEERING基因重組與基因工程

基因重組與基因工程

GeneticRecombination&GeneticEngineering

PauI

Berg(保羅.伯格)1973年發(fā)明重組DNA技術(shù)榮獲1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

臺(tái)灣動(dòng)物科技研究所2003年

中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心陳系古教授2000年法國(guó)科學(xué)家，兔子“Alba”著譯者:黃培堂

出版者：科學(xué)出版社

出版時(shí)間：2002.09

原著：J.薩姆布魯克

D.W.拉塞爾定價(jià)：￥168.00

字?jǐn)?shù)：2917千字

頁(yè)數(shù)：1949頁(yè)

中譯本序/譯者的話/第三版前言上冊(cè)第1章質(zhì)粒及其在分子克隆中的應(yīng)用第2章λ噬菌體及其載體第3章M13噬菌體載體第4章高容量載體的應(yīng)用第5章DNA凝膠電泳和脈沖場(chǎng)瓊脂糖凝膠電泳第6章真核基因組DNA的制備和分析第7章真核mRNA的提取、純化和分析第8章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增DNA第9章放射性標(biāo)記DNA探針與RNA探針的制備第10章合成寡核苷酸探針第11章cDNA文庫(kù)制備及其基因鑒定下冊(cè)第12章DNA測(cè)序第13章誘變第14章表達(dá)文庫(kù)的篩選第15章在大腸桿菌中表達(dá)克隆化基因第16章哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中導(dǎo)入克隆化基因第17章哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的基因表達(dá)分析第18章蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)附錄1分子克隆中使用的緩沖液和試劑的配制附錄2培養(yǎng)基附錄3載體和細(xì)菌菌株附錄4分子克隆所用的酶附錄5酶的抑制物附錄6核酸附錄7密碼子和氨基酸附錄8分子克隆中的常用技術(shù)附錄9檢測(cè)系統(tǒng)附錄10DNA陳列技術(shù)附錄11生物信息學(xué)附錄12告戒附錄13供應(yīng)商附錄14商標(biāo)索引引言第一節(jié)基因工程的基本程序第二節(jié)基因工程常用的工具酶第三節(jié)基因工程常用的載體第四節(jié)基因工程在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用

目的要求：

1.掌握重組DNA和基因工程的基本概念；

2.掌握基因工程的基本程序;

3.熟悉基因工程在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用；

4.了解基因工程常用的工具酶和載體。21世紀(jì)核心的科學(xué)技術(shù)：

現(xiàn)代生物技術(shù)(生物工程)

計(jì)算器微電子技術(shù)新材料新能源航天技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)：

基因工程（核心技術(shù)）蛋白質(zhì)工程酶工程細(xì)胞工程引言分子克隆(molecularcloning)DNA克隆(DNAcloning)基因克隆(genecloning)重組DNA(recombinantDNA)分子克隆技術(shù)(molecularcloningtechnique)DNA克隆技術(shù)(DNAcloningtechnique)基因克隆技術(shù)(genecloningtechnique)重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique)

基因工程(geneengineering)引言重組DNA(recombinantDNA)：

就是對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)——目的基因，在體外使用一種工具酶，用人工的方法，進(jìn)行“剪切”、“組合”、“拼接”，使遺傳物質(zhì)按照我們的意愿重新組合，然后通過(guò)運(yùn)載物質(zhì)（質(zhì)粒、噬菌體、病毒等）轉(zhuǎn)入微生物體內(nèi)或動(dòng)、植物細(xì)胞內(nèi)（統(tǒng)稱(chēng)載體），進(jìn)行無(wú)性繁殖，并使我們需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)出來(lái)，產(chǎn)生出我們所需要的產(chǎn)物或組成新的生物類(lèi)型。引言

重組DNA是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序。基因工程(geneengineering):

是指重組DNA的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游和下游兩大組成部分。上游部分指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA）；而下游部分則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過(guò)程。

實(shí)現(xiàn)重組DNA所采用的方法及相關(guān)的工藝統(tǒng)稱(chēng)基因工程。

理論基礎(chǔ)：①不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)；②基因是可切割的；③基因是可以轉(zhuǎn)移的；④多肽和基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系；⑤遺傳密碼是通用的；⑥基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳給下一代。歷史：1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物

1982第一個(gè)基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），

中國(guó)轉(zhuǎn)基因魚(yú)

1993基因工程西紅柿在美國(guó)上市1997英國(guó)羅斯林研究所多莉羊1999.9中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類(lèi)基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測(cè)定人類(lèi)基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類(lèi)基因組工作草圖2001.2.11公布人類(lèi)基因組基本信息胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體體內(nèi)-體外第一節(jié)基因工程的基本程序獲得目的基因和載體；目的基因和載體的連接(體外重組)；連接產(chǎn)物(重組體)導(dǎo)入宿主細(xì)胞；重組體的擴(kuò)增、篩選；目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)、分離、純化、鑒定等。載體目的片斷酶切酶切重組體連接導(dǎo)入細(xì)胞篩選擴(kuò)增、表達(dá)、純化等獲得目的基因和載體——切目的基因和載體的連接(體外重組)——接連接產(chǎn)物(重組體)導(dǎo)入宿主細(xì)胞——轉(zhuǎn)重組體的擴(kuò)增、篩選——篩目的基因在細(xì)胞的表達(dá)、分離、純化、鑒定等。一、目的基因的獲得1、化學(xué)合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。

局限性：短片段、簡(jiǎn)并性、高費(fèi)用2、基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)

存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌

3、cDNA文庫(kù)：

以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)。組織或培養(yǎng)細(xì)胞載體mRNAcDNAcDNA與載體連接導(dǎo)入大腸桿菌鑒定cDNA文庫(kù)的克隆數(shù)與特征4、PCR方法獲?。憾?、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞感受態(tài)：指受體(或者宿主)處于最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。將宿主菌在LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)16-20h。挑取單菌落轉(zhuǎn)入20mlLB培養(yǎng)基錐瓶中，37℃振蕩過(guò)夜。從中取2ml菌液轉(zhuǎn)入50mlLB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)4-5h，測(cè)OD600達(dá)0.4-0.5。培養(yǎng)物于冰上10min。轉(zhuǎn)入50ml離心管，于4000rpm下4℃離心10min。棄上清，倒置離心管1min，流盡剩余殘液然后加入10ml冰預(yù)冷的0.1MCaCl2，置冰上10min。4000rpm4℃離心10min，棄上清。加入2ml，0.1MCaCl2懸浮細(xì)胞，于4℃過(guò)夜。#感受態(tài)細(xì)胞制備轉(zhuǎn)化(transformation)：在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新遺傳特性的一種方法。轉(zhuǎn)染(transfection):

指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。感染(infection):

以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過(guò)包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):

指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過(guò)程，有時(shí)也指在真核細(xì)胞之間通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞DNA的過(guò)程。

1.重組體導(dǎo)入大腸桿菌

（1）氯化鈣法（2）電穿孔法(electroporation)

（3）病毒感染法/體外包裝法#氯化鈣轉(zhuǎn)化法在1.5mlEppendorf管中加入200μl感受態(tài)細(xì)胞和10μl40ngDNA溶液，溫和混勻，于冰上30min。于42℃水浴90S。冰浴2min。加入800μlLB液體培養(yǎng)基37℃45min。取200μl涂布于含Amp(50μg/ml)瓊脂糖平皿，37℃培養(yǎng)12-16h，觀察結(jié)果。#電穿孔法DNAMovement2.重組體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞

（1）磷酸鈣共沉淀法

（2）脂質(zhì)體介導(dǎo)法：人工細(xì)胞膜（3）病毒感染法（4）顯微注射法三、

DNA重組體的篩選與鑒定1.根據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選普通抗菌素平板篩選：插入失活篩選：

α-互補(bǔ)——藍(lán)-白斑篩選：含LacZ基因（編碼β半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入后，LacZ基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來(lái)篩選重組細(xì)菌。稱(chēng)之為藍(lán)-白斑篩選。IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)

2.DNA限制酶切圖譜分析

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

3.PCR鑒定4.利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定

★基因工程的基本程序獲得目的基因和載體——切目的基因和載體的連接(體外重組)——接連接產(chǎn)物(重組體)導(dǎo)入宿主細(xì)胞——轉(zhuǎn)重組體的擴(kuò)增、篩選——篩目的基因在細(xì)胞的表達(dá)、分離、純化、鑒定等。基因工程技術(shù)策略分：

基因載體

目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒直接分離cDNA

人工合成基因文庫(kù)切：

限制性內(nèi)切酶有缺口的載體目的基因接：

連接酶粘端連接平端連接尾接法重組體轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主篩：表型篩選電泳法核酸雜交第二節(jié)基因工程常用的工具酶工具酶

活性限制性核酸內(nèi)切酶

識(shí)別特異序列，切割DNA連接酶

催化5'-磷酸與3'-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶

以DNA為模板合成DNARNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)

以RNA為模板合成DNA堿性磷酸酶

切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶

催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化3'-端合成同聚體尾一、限制性核酸內(nèi)切酶概念：是由細(xì)菌產(chǎn)生的一種能識(shí)別雙鏈DNA中的特定序列，并以內(nèi)切方式水解核酸鏈中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶，又叫切割酶或限制酶。分類(lèi)：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。以Ⅱ型為主。命名原則：常用限制性內(nèi)切酶的種類(lèi)：#識(shí)別和切割位點(diǎn)：

5‘粘性末端：

5‘-GAATTC-3’

5’-G

AATTC-3’

3‘-CTTAAG-5’

3’-CTTAA

G-5’3‘粘性末端：

平端或鈍端：EcoRⅠ+二、連接酶與連接連接方式：

三、DNA聚合酶分類(lèi)：

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶大片段（Klenow片段）

TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶：耐受高溫，70-75℃時(shí)具有最佳的生物活性。主要用于PCR。四、RNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)作用：

RT-PCR

RNADNA

第三節(jié)基因工程常用的載體載體(vector)：

裝載目的基因的工具。

本質(zhì)是DNA。分類(lèi)：克隆載體；表達(dá)載體。常用的載體：

質(zhì)粒(plasmid)；

噬菌體(phage)；

酵母載體(yeastvector)；

病毒載體(virusvector)。質(zhì)粒(plasmid)：

是細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀閉合的雙鏈DNA

質(zhì)粒(plasmid)：

基本特征：復(fù)制起點(diǎn)啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)加尾信號(hào)篩選標(biāo)記載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)(以質(zhì)粒為例)：能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)(外源DNA插入點(diǎn))，常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。作用：裝載小于2kb的目的DNA質(zhì)粒(plasmid)：

2.噬菌體(phage)：

感染細(xì)菌的病毒稱(chēng)為噬菌體。

作用：裝載大片斷DNA，從6-8kb、

10-20kb、30-45kb不等吸附吸附是噬菌體與菌體表面受體發(fā)生特異性結(jié)合的過(guò)程，其特異性取決于噬菌體蛋白與宿主菌表面受體分子結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性。毒性噬菌體的復(fù)制周期—溶菌性周期3.酵母載體(yeastvector)：

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)：可接受2Mb的外源

DNA插入，是人類(lèi)

基因組計(jì)劃物理圖

普繪制采用的主要載體。4.病毒載體(virusvector):

作用：在真核細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因。種類(lèi)：

昆蟲(chóng)桿狀病毒載體；

SV40病毒載體；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；

腺病毒載體；

痘苗病毒載體等。第四節(jié)基因工程

在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用一、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究★當(dāng)今人類(lèi)疾病的發(fā)展趨勢(shì)：

★研究疾病的分子機(jī)制：

二、基因診斷

1.基因探針——基因水平的診斷：

親子鑒定：“爆棚”現(xiàn)象

產(chǎn)前診斷：

個(gè)人基因信息身份證：

2.抗原或者抗體——蛋白質(zhì)水平：乙肝核心抗原/e抗原：三、基因治療1.基因治療的概念

狹義指將具有正常功能的基因置換或者增補(bǔ)體內(nèi)缺陷的基因，從而達(dá)到治病的目的。

廣義指將某遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)，最終達(dá)到治療某種疾病的方法，均謂之基因治療。2.基因治療的方式基因修復(fù)/矯正(genecorrection)基因置換(genereplacement)基因增補(bǔ)/修飾(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)：

RNA干擾(RNAinterference,RNAi)

基因敲除(geneknock-out)自殺基因(suicidegene)

單純皰疹病毒胸苷激酶基因HSV-

tk(丙氧鳥(niǎo)苷GCV-磷酸化GCV)1990年，美國(guó)科學(xué)家成功治愈了患有嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷疾病(SCID)(腺苷酸脫氨酶缺陷)的4歲女孩艾姍蒂。用基因治療血友病四、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

GFP

我國(guó)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因兔，轉(zhuǎn)入的乙型肝炎表面抗原基因已在基因兔體內(nèi)整合并表達(dá)。

兔研人員將乙型肝炎表面抗原基因注入兔受精卵的情形。美國(guó)通過(guò)基因工程將人的基因植入牛的體內(nèi)，由轉(zhuǎn)基因公牛受精的母牛產(chǎn)下5頭健壯的牛犢，每頭都含有一個(gè)人類(lèi)的基因。

1998年，中國(guó)人-曹誼林在美國(guó)麻省大學(xué)查里斯?文森提(CharlesVacanti)的實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)造該奇跡。

中科院水生生物研究所培育的轉(zhuǎn)基因鯉魚(yú)，表現(xiàn)出快速生長(zhǎng)效應(yīng)。五、生物制藥(包括疫苗和抗體)為什么？

隨心所欲

低成本劇增效應(yīng)等我國(guó)第一個(gè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的生物高技術(shù)產(chǎn)品，人α型基因工程干擾素。1309元/支，14支/盒，21天1個(gè)療程世界生物技術(shù)藥品市場(chǎng)：世界生物技術(shù)藥品市場(chǎng)：1——1996年；2——1997年；3——2000年；4——2003年。中國(guó)生物技術(shù)藥品市場(chǎng)：截至目前，我國(guó)