WS-T799-2022.污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標(biāo)準(zhǔn)

WS/T799—2022

污水中新型冠狀病毒富集濃縮

和核酸檢測方法標(biāo)準(zhǔn)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于生活污水、醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

WS/T697新冠肺炎疫情期間特定人群個(gè)人防護(hù)指南

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

新型冠狀病毒severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2

屬于β屬冠狀病毒，基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，全長約30kb，有包膜，呈圓形或橢圓形顆

粒狀，直徑為60nm～140nm。

Ct值cyclethreshold

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，每個(gè)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)real-timefluorescentreversetranscriptionpolymerase

chainreaction

在反轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)

物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析方法。

4檢出限

富集濃縮采用聚乙二醇沉淀法或鋁鹽混凝沉淀法時(shí)，方法檢出限為10copies/mL；富集濃縮采用離

心超濾法時(shí)，方法檢出限為100copies/mL。

5水樣的采集、運(yùn)輸及保存

根據(jù)采樣場所排水系統(tǒng)分布情況，重點(diǎn)選取污水排水口、內(nèi)部管網(wǎng)匯集處等關(guān)鍵位置對(duì)未經(jīng)消殺處

理的污水進(jìn)行采樣。用無菌聚乙烯瓶采集污水樣本，采樣體積為300mL?？筛鶕?jù)現(xiàn)場條件和檢測需求確

定水樣采集方式，如瞬時(shí)水樣（采樣點(diǎn)位某一時(shí)間隨機(jī)采集的樣本）或混合水樣（同一采樣點(diǎn)位不同時(shí)

間所采集的瞬時(shí)水樣混合后的樣本）。樣本采集后應(yīng)在現(xiàn)場使用75%酒精對(duì)采樣瓶外表面進(jìn)行消毒，然

后將采樣瓶裝入密封采樣袋中，對(duì)密封采樣袋外表面再次進(jìn)行消毒，并盡快將樣本送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過

程中確保0℃～4℃條件下冷藏運(yùn)輸。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后樣本同樣應(yīng)保存于0℃～4℃環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在

接到樣本后24h內(nèi)進(jìn)行富集濃縮處理，并在富集濃縮后24h內(nèi)完成核酸提取及實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈

式反應(yīng)（實(shí)時(shí)熒光RT-PCR）檢測。

6病毒滅活

1

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將樣本充分混勻后置于60℃水浴30min。

注：水浴鍋水位應(yīng)高于樣本液面，確保容器內(nèi)樣本達(dá)到目標(biāo)溫度。

7病毒富集濃縮

注：本部分中三種新型冠狀病毒富集濃縮方法適用條件相同，使用過程中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。

聚乙二醇沉淀法

7.1.1原理

向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定鹽濃度條件下可使病毒顆粒形成多聚體，在一定離心力下

將水溶液與病毒顆粒多聚體分開，收集病毒顆粒多聚體形成的沉淀，用于后續(xù)核酸提取和實(shí)時(shí)熒光

RT-PCR檢測。

7.1.2試劑和材料

7.1.2.1試劑

7.1.2.1.1聚乙二醇：分子生物學(xué)級(jí)，平均分子量8000。

7.1.2.1.2氯化鈉：分子生物學(xué)級(jí)。

7.1.2.1.3無核酸酶水：分子生物學(xué)級(jí)。

7.1.2.2材料

7.1.2.2.1無菌帶蓋離心管：1.5mL，無核酸酶；50mL或250mL，可承受離心力≥12000g。

7.1.2.2.2無菌移液器吸頭：1mL，帶濾芯，無核酸酶。

7.1.2.2.3無菌移液管：50mL。

7.1.3儀器設(shè)備

7.1.3.1高速冷凍離心機(jī)：4℃，50mL或250mL轉(zhuǎn)子，可承受離心力≥12000g。

7.1.3.2電子天平：分辨力不低于0.001g。

7.1.3.3生物安全柜：II級(jí)或II級(jí)以上。

7.1.3.4高壓滅菌器。

7.1.3.5移液器：1mL。

7.1.3.6大容量電動(dòng)移液器。

7.1.4富集濃縮步驟

7.1.4.1預(yù)離心

用大容量電動(dòng)移液器分別移取3份35mL污水樣本置于3個(gè)50mL離心管中，在4℃、2500g條件下離

心30min，將上清液分別轉(zhuǎn)移到另外3個(gè)50mL離心管中備用。剩余污水樣本作為備份。

注1：當(dāng)污水樣本懸浮物含量過高，可能影響病毒核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測時(shí)，應(yīng)采用預(yù)離心棄除懸浮物后再

進(jìn)行后續(xù)操作。

注2：若選用250mL離心管，可直接取105mL污水樣本于250mL離心管中，在上述條件下離心后將上清液轉(zhuǎn)移到另外

1個(gè)250mL離心管中備用。

7.1.4.2第二次離心

在3個(gè)裝有35mL污水樣本或預(yù)離心后上清液的50mL離心管中分別加入3.5g±0.1g聚乙二醇和

0.79g±0.01g氯化鈉，充分混合，直至試劑完全溶解，該溶解過程約需15min。然后在4℃、12000g

條件下離心120min，離心機(jī)降速時(shí)不應(yīng)使用制動(dòng)力。離心機(jī)停止后傾倒并棄除離心管中的上清液，至

無上清液流出。

注：若選用250mL離心管，在裝有105mL污水樣本或預(yù)離心后上清液的250mL離心管中操作時(shí)，聚乙二醇和氯化鈉

用量應(yīng)等比例增加，其他操作相同。

7.1.4.3富集濃縮

7.1.4.3.1在4℃、12000g條件下將第二次離心后剩余的樣本再次離心5min，離心機(jī)降速時(shí)不應(yīng)使

2

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用制動(dòng)力。離心機(jī)停止后用移液器從離心管中吸出并棄除剩余的上清液。

7.1.4.3.2吸取0.4mL無核酸酶水加入到其中的一個(gè)離心管中，反復(fù)吹吸沉淀，瞬時(shí)離心，使所有液

體聚集在管底，將混懸液吸出并加入到第二個(gè)離心管中。

7.1.4.3.3重復(fù)吹吸沉淀和瞬時(shí)離心的操作后，再次將混懸液吸出并加入到第三個(gè)離心管中。

7.1.4.3.4繼續(xù)重復(fù)吹吸沉淀和瞬時(shí)離心的操作，最終形成的混懸液即為該水樣的濃縮液，體積約為

0.6mL。將濃縮液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，于0℃～4℃條件下保存，并于24h內(nèi)完成核酸提取和實(shí)

時(shí)熒光RT-PCR檢測。

注：若選用250mL離心管，按照7.1.4.3.1條件再次離心并棄除剩余的上清液后，在離心管中加入0.4mL無核酸酶水，

反復(fù)吹吸沉淀，并瞬時(shí)離心后即得到濃縮液。

鋁鹽混凝沉淀法

7.2.1原理

向污水中加入鋁鹽混凝劑，鋁鹽水解產(chǎn)生的氫氧化鋁膠體可吸附和包裹病毒顆粒，通過離心作用收

集含病毒的膠體，然后通過化學(xué)溶解釋放出包裹的病毒顆粒，用于后續(xù)核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測。

7.2.2試劑和材料

7.2.2.1試劑

7.2.2.1.1實(shí)驗(yàn)用水：GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

7.2.2.1.2氯化鋁溶液[c（AlCl3）=0.3mol/L]：稱取4g無水氯化鋁（純度≥99%），置于燒杯中，

加入100mL水，攪拌溶解后轉(zhuǎn)移至試劑瓶中。

7.2.2.1.3氫氧化鈉溶液[c（NaOH）=1mol/L]：稱取4g氫氧化鈉（純度≥96%），置于燒杯中，加入

100mL水，攪拌溶解后轉(zhuǎn)移至試劑瓶中。

7.2.2.1.4鹽酸溶液[c（HCl）=1mol/L]：移取43mL鹽酸（分析純，ρ20=1.19g/mL）于燒杯中，加入

適量水，用玻璃棒攪拌混勻后轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，并定容至刻度。

7.2.2.1.5乙二胺四乙酸二鈉二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O）：純度≥98%。

7.2.2.2材料

7.2.2.2.1無菌螺口錐形瓶：100mL。

7.2.2.2.2無菌帶蓋離心管：10mL、50mL。

7.2.2.2.3無菌移液器吸頭：200μL、1mL，帶濾芯，無核酸酶。

7.2.2.2.4無菌移液管：50mL。

7.2.3儀器設(shè)備

7.2.3.1冷凍離心機(jī)：4℃，50mL轉(zhuǎn)子，可承受離心力≥2500g。

7.2.3.2恒溫振蕩培養(yǎng)箱。

7.2.3.3電子天平：分辨力不低于0.001g。

7.2.3.4pH計(jì)：精度≥0.01。

7.2.3.5水浴鍋。

7.2.3.6生物安全柜：II級(jí)或II級(jí)以上。

7.2.3.7高壓滅菌器。

7.2.3.8移液器：200μL、1mL。

7.2.3.9大容量電動(dòng)移液器。

7.2.4富集濃縮步驟

7.2.4.1預(yù)離心

取大于50mL的污水樣本在4℃、2500g條件下離心30min，留取上清液備用。剩余污水樣本作為備

份。

注：當(dāng)污水樣本懸浮物含量過高，可能影響病毒核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測時(shí)，應(yīng)采用預(yù)離心棄除懸浮物后再

進(jìn)行后續(xù)操作。

3

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7.2.4.2富集濃縮

7.2.4.2.1絮凝處理

用大容量電動(dòng)移液器將50mL污水樣本或預(yù)離心后的上清液轉(zhuǎn)移至100mL螺口錐形瓶中，加入0.5mL

0.3mol/L的氯化鋁溶液，用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)水樣pH=6.0±0.1。將螺口錐

形瓶蓋擰緊，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以150r/min的速度在室溫下混合15min。

7.2.4.2.2離心分離

將水樣轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，在4℃、1900g條件下離心5min。

7.2.4.2.3絡(luò)合溶解

傾倒棄除離心管中的上清液，在剩余膠體中加入0.20g±0.01g乙二胺四乙酸二鈉二水合物，搖晃

數(shù)十次至膠體變?yōu)橐簯B(tài)，轉(zhuǎn)移至10mL離心管中。將10mL離心管置于水浴鍋中，60℃水浴10min。水浴

后離心管中的液體即為該水樣的濃縮液，體積約為1mL，于0℃～4℃條件下保存，并于24h內(nèi)完成核酸

提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測。

離心超濾法

7.3.1原理

選用嵌有超濾膜的超濾杯，通過離心作用將分子量大于超濾膜截留分子量的病毒顆粒截留在超濾

杯內(nèi)，收集超濾杯中的病毒濃縮液，用于后續(xù)核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測。

7.3.2材料

7.3.2.1一次性超濾杯：截留分子量為30kDa，體積為70mL，可倒置離心回收樣本。

7.3.2.2無菌帶蓋離心管：2mL，無核酸酶；50mL。

7.3.2.3無菌移液器吸頭：1mL，帶濾芯，無核酸酶。

7.3.2.4無菌移液管：50mL。

7.3.3儀器和設(shè)備

7.3.3.1冷凍離心機(jī)：4℃，50mL轉(zhuǎn)子，可承受離心力≥6000g。

7.3.3.2冷凍離心機(jī)：4℃，250mL水平轉(zhuǎn)子，可承受離心力≥3000g。

7.3.3.3生物安全柜：II級(jí)或II級(jí)以上。

7.3.3.4高壓滅菌器。

7.3.3.5移液器：1mL。

7.3.3.6大容量電動(dòng)移液器。

7.3.4富集濃縮步驟

7.3.4.1預(yù)離心

7.3.4.1.1用大容量電動(dòng)移液器移取50mL污水樣本于50mL離心管中，在4℃、5000g條件下離心

30min，分別保留上清液和沉淀物。剩余污水樣本作為備份。

7.3.4.1.2取0.5mL上清液加入到保留沉淀物的離心管中，將沉淀物重懸混勻，保留待用。

7.3.4.2富集濃縮

7.3.4.2.1超濾杯前處理：取30mL無菌水加入到樣品濃縮杯中，使用水平轉(zhuǎn)子在4℃、2480g條件

下離心10min，棄除濾液收集杯中的濾出液，再將樣品濃縮杯反向倒置在濃縮液收集杯上，在4℃、

920g條件下離心3min，棄除收集液。

7.3.4.2.2將7.3.4.1.1預(yù)離心得到的上清液轉(zhuǎn)移至樣品濃縮杯中，使用水平轉(zhuǎn)子在4℃、2480g條

件下離心15min。如樣品濃縮杯中殘留液體體積較大，可適當(dāng)延長離心時(shí)間，直至濃縮杯中液體約

為0.3mL～0.6mL。

7.3.4.2.3待全部上清液濃縮完成后，將樣品濃縮杯反向倒置在濃縮液收集杯上，在4℃、920g條件

下離心3min，吸取濃縮液收集杯中的液體，轉(zhuǎn)移至2mL離心管中。

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7.3.4.2.4吸取7.3.4.1.2預(yù)離心得到的沉淀物混懸液0.5mL，與7.3.4.2.3中得到的液體混合，即

為該水樣的濃縮液，體積約為0.8mL～1.1mL，于0℃～4℃條件下保存，并于24h內(nèi)完成核酸提取和

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測。

注1：也可選用截留分子量為100kDa的超濾杯，但對(duì)應(yīng)離心濃縮時(shí)離心力不宜超過3000g；

注2：也可選用不帶倒置離心功能的超濾杯，但在完成7.3.4.2.2后，7.3.4.2.3應(yīng)改為“待全部上清液濃縮完成后，

取下樣品濃縮杯，用移液器吸取濃縮液體小心吹打膜數(shù)次后，吸取所有濃縮液并轉(zhuǎn)移至2mL離心管中”。

8核酸檢測

核酸提取

8.1.1試劑和材料

8.1.1.1試劑

8.1.1.1.1病毒核酸提取試劑盒。

8.1.1.1.2無核酸酶水：分子生物學(xué)級(jí)。

8.1.1.2材料

8.1.1.2.1無菌帶蓋離心管：1.5mL，無核酸酶。

8.1.1.2.2無菌移液器吸頭：10μL、200μL、1mL，帶濾芯，無核酸酶。

注：其他材料參照所用病毒核酸提取試劑盒。

8.1.2儀器和設(shè)備

8.1.2.1生物安全柜：II級(jí)或II級(jí)以上。

8.1.2.2高壓滅菌器。

8.1.2.3移液器：10μL、200μL、1mL。

注：其他儀器和設(shè)備參照所用病毒核酸提取試劑盒。

8.1.3核酸提取步驟

在生物安全柜中打開裝有污水樣本濃縮液的離心管，按照病毒核酸提取試劑盒說明，取適量濃縮液

進(jìn)行核酸提取，提取完成后應(yīng)立即封蓋并馬上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測。剩余的濃縮液和核酸樣本應(yīng)于

-80℃條件下凍存。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測

8.2.1試劑和材料

8.2.1.1試劑

8.2.1.1.1新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）。

8.2.1.1.2無核酸酶水：分子生物學(xué)級(jí)。

8.2.1.2材料

8.2.1.2.1無菌移液器吸頭：10μL、100μL、200μL、1mL，帶濾芯，無核酸酶。

8.2.1.2.2無菌PCR管或PCR板：無核酸酶。

8.2.2儀器和設(shè)備

8.2.2.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

8.2.2.2混勻器。

8.2.2.3生物安全柜：II級(jí)或II級(jí)以上。

8.2.2.4移液器：10μL、100μL、200μL、1mL。

注：其他儀器和設(shè)備參照所用新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。

8.2.3檢測步驟

8.2.3.1檢測靶標(biāo)選擇原則

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采用雙靶標(biāo)檢測，針對(duì)開放讀碼框1ab（openreadingframe1ab，ORF1ab）和核殼蛋白

（nucleocapsidprotein，N）。必要時(shí)可根據(jù)檢測需求和相關(guān)規(guī)定進(jìn)行調(diào)整。

8.2.3.2反應(yīng)體系

參照新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒說明書。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。

9質(zhì)量控制

富集濃縮質(zhì)量控制

9.1.1富集濃縮陽性質(zhì)量控制

9.1.1.1將采集到的污水樣本滅活后，加入污水中不存在的非人源病毒（如：鼠肝炎病毒、牛冠狀病

毒、牛呼吸道合胞病毒、新型冠狀病毒假病毒等陽性質(zhì)控），加標(biāo)濃度為1000copies/mL，作為富集濃

縮陽性質(zhì)控樣。富集濃縮陽性質(zhì)控樣檢測過程與污水樣本檢測過程完全相同，但實(shí)時(shí)熒光RT-PCR時(shí)應(yīng)

使用相應(yīng)核酸檢測試劑盒。

9.1.1.2在每一批次檢測中應(yīng)至少做一個(gè)富集濃縮陽性質(zhì)控樣。

9.1.2富集濃縮陰性質(zhì)量控制

9.1.2.1樣本采集時(shí)用無核酸酶水代替污水樣本，將其作為富集濃縮陰性質(zhì)控樣。富集濃縮陰性質(zhì)控

樣檢測過程與污水樣本檢測過程完全相同。

注：富集濃縮陰性質(zhì)控樣同時(shí)也是采樣過程空白對(duì)照樣。

9.1.2.2在每一批次檢測中應(yīng)至少做一個(gè)富集濃縮陰性質(zhì)控樣。

核酸提取質(zhì)量控制

9.2.1核酸提取陽性質(zhì)量控制

9.2.1.1使用9.1.1.1中陽性質(zhì)控作為核酸提取過程陽性質(zhì)控樣。核酸提取陽性質(zhì)控樣檢測過程與污

水樣本從核酸提取開始的檢測過程完全相同，但實(shí)時(shí)熒光RT-PCR時(shí)應(yīng)使用相應(yīng)核酸檢測試劑盒。

9.2.1.2在每一批次核酸提取過程中應(yīng)至少做一個(gè)核酸提取陽性質(zhì)控樣。

9.2.2核酸提取陰性質(zhì)量控制

9.2.2.1使用無核酸酶水作為核酸提取過程陰性質(zhì)控樣。核酸提取陰性質(zhì)控樣檢測過程與污水樣本從

核酸提取開始的檢測過程完全相同。

9.2.2.2在每一批次核酸提取過程中應(yīng)至少做一個(gè)核酸提取陰性質(zhì)控樣。

PCR檢測質(zhì)量控制

9.3.1PCR檢測陽性質(zhì)量控制

9.3.1.1使用新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒中的陽性質(zhì)控作為PCR檢測過程陽性質(zhì)控樣。制備反應(yīng)體

系時(shí)用PCR陽性質(zhì)控樣代替樣本核酸加入，其他操作與污水樣本PCR檢測過程完全相同。

9.3.1.2在每一批次實(shí)時(shí)熒光RT-PCR過程中應(yīng)至少做一個(gè)PCR檢測陽性質(zhì)控樣。

9.3.2PCR檢測陰性質(zhì)量控制

9.3.2.1使用新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒中的陰性質(zhì)控作為PCR檢測過程陰性質(zhì)控樣。制備反應(yīng)體

系時(shí)用PCR陰性質(zhì)控樣代替樣本核酸加入，其他操作與污水樣本PCR檢測過程完全相同。

9.3.2.2在每一批次實(shí)時(shí)熒光RT-PCR過程中應(yīng)至少做一個(gè)PCR檢測陰性質(zhì)控樣。

10結(jié)果與報(bào)告

實(shí)驗(yàn)有效性判斷

實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)滿足表1要求，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

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表1實(shí)驗(yàn)有效性判斷標(biāo)準(zhǔn)

質(zhì)控樣類型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

富集濃縮陽性質(zhì)控樣陽性

富集濃縮陰性質(zhì)控樣陰性

核酸提取陽性質(zhì)控樣陽性

核酸提取陰性質(zhì)控樣陰性

PCR檢測陽性質(zhì)控樣陽性

PCR檢測陰性質(zhì)控樣陰性

注：以上6項(xiàng)需在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足。

結(jié)果判定

10.2.1PCR結(jié)果判斷

10.2.1.1陰性：無Ct值、無S形擴(kuò)增曲線。

10.2.1.2陽性：Ct值小于或等于新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒說明書規(guī)定值，且有S形擴(kuò)增曲線。

注：或以產(chǎn)品說明書為準(zhǔn)。

10.2.2陽性樣本判斷

10.2.2.1雙靶標(biāo)：同一份樣本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab和N）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR均出現(xiàn)陽性

檢測結(jié)果，即2個(gè)靶標(biāo)的3個(gè)平行樣各出現(xiàn)至少1個(gè)陽性檢測結(jié)果，樣本判定為陽性，例如：ORF1ab

+/-/-，N-/+/-。

10.2.2.2單靶標(biāo)：同一份樣本中新型冠狀病毒單靶標(biāo)（ORF1ab或N）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR至少2個(gè)平行

樣出現(xiàn)陽性檢測結(jié)果，樣本判定為陽性，例如：ORF1ab+/+/-，N-/-/-或ORF1ab-/-/-，N+/+/-。

當(dāng)出現(xiàn)單個(gè)靶標(biāo)只有1個(gè)平行樣為陽性檢測結(jié)果時(shí)，需對(duì)該樣本重新進(jìn)行富集濃縮和核酸提取，并進(jìn)行

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測，若仍出現(xiàn)陽性檢測結(jié)果，則樣本判定為陽性。

結(jié)果報(bào)告

根據(jù)檢測結(jié)果，報(bào)告“檢出新型冠狀病毒核酸”或“未檢出新型冠狀病毒核酸”。

11實(shí)驗(yàn)室安全

生物安全

污水樣本采集時(shí)個(gè)人防護(hù)要求應(yīng)符合WS/T697相關(guān)規(guī)定。樣本滅活、檢測等操作應(yīng)在生物安全二級(jí)

及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用不低于生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。水樣采集后，富集濃縮、核酸提

取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測等所有操作均應(yīng)避免樣本暴露于外環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的所有廢棄物（包括

剩余水樣）均應(yīng)經(jīng)有效滅菌后再按醫(yī)療廢棄物進(jìn)行分類處理。

實(shí)驗(yàn)室設(shè)備使用安全

離心機(jī)應(yīng)裝有不平衡振動(dòng)顯示及報(bào)警裝置。

7

ICS13.060

CCSC51

WS

中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

WS/T799—2022

污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測

方法標(biāo)準(zhǔn)

MethodforenrichmentandnucleicaciddetectionofSARS-CoV-2insewage

2022-03-24發(fā)布2022-03-24實(shí)施

中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布

WS/T799—2022

污水中新型冠狀病毒富集濃縮

和核酸檢測方法標(biāo)準(zhǔn)

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于生活污水、醫(yī)療機(jī)構(gòu)污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

WS/T697新冠肺炎疫情期間特定人群個(gè)人防護(hù)指南

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

新型冠狀病毒severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2

屬于β屬冠狀病毒，基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，全長約30kb，有包膜，呈圓形或橢圓形顆

粒狀，直徑為60nm～140nm。

Ct值cyclethreshold

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，每個(gè)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)real-timefluorescentreversetranscriptionpolymerase

chainreaction

在反轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光化學(xué)物質(zhì)，通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)

物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析方法。

4檢出限

富集濃縮采用聚乙二醇沉淀法或鋁鹽混凝沉淀法時(shí)，方法檢出限為10copies/mL；富集濃縮采用離

心超濾法時(shí)，方法檢出限為100copies/mL。

5水樣的采集、運(yùn)輸及保存

根據(jù)采樣場所排水系統(tǒng)分布情況，重點(diǎn)選取污水排水口、內(nèi)部管網(wǎng)匯集處等關(guān)鍵位置對(duì)未經(jīng)消殺處

理的污水進(jìn)行采樣。用無菌聚乙烯瓶采集污水樣本，采樣體積為300mL?？筛鶕?jù)現(xiàn)場條件和檢測需求確

定水樣采集方式，如瞬時(shí)水樣（采樣點(diǎn)位某一時(shí)間隨機(jī)采集的樣本）或混合水樣（同一采樣點(diǎn)位不同時(shí)

間所采集的瞬時(shí)水樣混合后的樣本）。樣本采集后應(yīng)在現(xiàn)場使用75%酒精對(duì)采樣瓶外表面進(jìn)行消毒，然

后將采樣瓶裝入密封采樣袋中，對(duì)密封采樣袋外表面再次進(jìn)行消毒，并盡快將樣本送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過

程中確保0℃～4℃條件下冷藏運(yùn)輸。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后樣本同樣應(yīng)保存于0℃～4℃環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在

接到樣本后24h內(nèi)進(jìn)行富集濃縮處理，并在富集濃縮后24h內(nèi)完成核酸提取及實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈

式反應(yīng)（實(shí)時(shí)熒光RT-PCR）檢測。

6病毒滅活

1

WS/T799—2022

將樣本充分混勻后置于60℃水浴30m