海膽主要疾病診斷與防治技術(shù)規(guī)程

1海膽主要疾病診斷與防治技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了中間球海膽紅斑病和黑嘴病的臨床癥狀、病原鑒定方法與結(jié)果判定和防治技術(shù)規(guī)程。本文件適用于由溶珊瑚弧菌（Vibriocoralliilyticus）、錫那羅州弧菌（Vibriosinaloensis）、燦爛弧菌（Vibriosplendidus）、棘皮動物弧菌（Vibrioechinoideorum）、嗜環(huán)弧菌（Vibriocyclitrophicus）感染導(dǎo)致的中間球海膽（Strongylocentrotusintermedius）紅斑病和黑嘴病的診斷和防治。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB11607漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)SC/T7103水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范GB/T4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗GB/T4789.5食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗DB50/T1606水生動物細(xì)菌性病原鑒定技術(shù)規(guī)范SC1059漁用含氯消毒劑DB21/T1859農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全光棘球海膽增養(yǎng)殖技術(shù)規(guī)范NY5071無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則SC/T1132魚藥使用規(guī)范中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2292號公告中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2583號公告中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2638號公告3診斷3.1現(xiàn)場調(diào)查水質(zhì)情況包括水源、水色、水溫、透明度、pH、亞硝酸鹽、氨氮、溶解氧、硬度等；養(yǎng)殖情況包括養(yǎng)殖密度、苗種來源、餌料來源等。3.2臨床診斷3.2.1海膽紅斑病2患紅斑病海膽表現(xiàn)為體表出現(xiàn)大小不等的暗紅色粘性斑塊，嚴(yán)重者斑塊處破潰，體腔內(nèi)液從破口流3.2.2海膽黑嘴病患黑嘴病海膽表現(xiàn)為攝食能力下降，附著能力減弱，棘刺脫落，圍口膜顏色發(fā)黑。3.3病原檢測3.3.1試劑材料檢驗中所需試劑、染色劑、培養(yǎng)基的配制按照GB/T4789.28、GB/T4789.4和GB/T4789.5規(guī)定執(zhí)行，雙蒸水、10×PCR緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶、瓊脂糖、核酸染料、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物與核酸提取試劑盒選用專業(yè)試劑公司提供的商品化試劑，上述未提及的見附錄A。3.3.2儀器設(shè)備超凈工作臺、生物安全柜、醫(yī)用冰箱、高速離心機（100rpm～20000rpm）、高壓滅菌鍋、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、生化培養(yǎng)箱、移液器等。3.3.3采樣按照嚴(yán)格要求進行現(xiàn)場采樣，樣品采集符合SC/T7103要求。3.3.4細(xì)菌分離與純化在超凈工作臺或生物安全柜中，用滅菌接種環(huán)蘸取海膽病灶部位（紅斑病病灶多位于體表，黑嘴病病灶多位于圍口膜），常規(guī)劃線接種至2216E培養(yǎng)基。將劃線好的平板倒置在培養(yǎng)箱中，20℃±2℃培養(yǎng)24h～48h。觀察菌落生長情況，從中挑取優(yōu)勢單菌落，在超凈工作臺或生物安全柜中用無菌接種環(huán)挑取單菌落于2216E培養(yǎng)基中，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h。觀察菌液狀態(tài)，若渾濁，則于4℃保存待檢。3.3.5細(xì)菌理化指標(biāo)測定3.3.5.1革蘭氏染色按GB/T4789.28的規(guī)定執(zhí)行。3.3.5.2生理生化試驗3.3.5.2.1賴氨酸脫羧酶試驗按GB4789.5中的規(guī)定執(zhí)行。33.3.5.2.2鳥氨酸脫羧酶試驗按GB4789.5中的規(guī)定執(zhí)行。3.3.5.2.3精氨酸脫羧酶實驗按GB4789.28中的規(guī)定執(zhí)行。3.3.5.2.4蔗糖水解試驗按GB4789.28中的規(guī)定執(zhí)行。3.3.5.2.5蛋白胨水試驗按GB4789.4中的規(guī)定執(zhí)行。3.3.5.2.6甘露醇利用試驗按GB4789.28中的規(guī)定執(zhí)行。3.3.6細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定3.3.6.1細(xì)菌DNA抽提取2mL待檢菌培養(yǎng)液，12000r/min離心1min，收集菌體。菌體懸浮于500μLTE緩沖液（pH8.0的NaCl溶液，充分混勻，再加入100μLCTAB/NaCl溶液混勻，65℃溫育20min。加入等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），混勻，12000r/min離心5min。取上清液加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混離心10min；沉淀用70%酒精洗滌2次，室溫晾干。加入50mL的TE緩沖液溶解，-20℃貯存，備用。3.3.6.2PCR檢測3.3.6.2.116SrRNA引物上游引物：27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG下游引物：1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT3.3.6.2.2反應(yīng)體系表1PCR反應(yīng)體系反應(yīng)成分體積(μL）10×PCR緩沖液5.0dNTP4.04TaqDNA聚合酶50mMMgSO42.5上游引物下游引物模板雙蒸水9.5總體積25.03.3.6.2.3反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min，95℃30s；57℃30s；72℃90s；擴增30個循環(huán)；72℃10min，最后4℃保溫。3.3.6.3瓊脂糖凝膠電泳用1×TAE電泳緩沖液配置1.5%的瓊脂糖凝膠。將5μL樣品和1μL6×上樣緩沖液混勻后加入樣品孔，在電泳時設(shè)立核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照。5V/em電泳約0.5h，當(dāng)溴酚藍快到達瓊脂糖凝膠底部時，停止電泳。將瓊脂糖凝膠浸入核酸染料中進行泡染15min，于TAE緩沖液中脫色15min，將凝膠置于凝膠成像儀上觀察。結(jié)果判定：陽性對照16SrDNA的擴增產(chǎn)物在1500bp處出現(xiàn)特異性條帶，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)條清楚，陰性對照和空白對照無特異性條帶，待測樣品出現(xiàn)1500bp的特異性核酸條帶，則可進行基因測序，否則無3.3.6.4基因測序?qū)CR擴增產(chǎn)物進行序列測定，并與參考序列（附錄B）進行比對分析。3.3.7結(jié)果判定3.3.7.1菌落形態(tài)溶珊瑚弧菌在20℃培養(yǎng)24h～48h，形成表面光滑、隆起、邊緣規(guī)則、不透明、圓形的乳白色菌落。錫那羅州弧菌在20℃培養(yǎng)24h～48h，形成表面光滑、微隆起、邊緣不整齊、不透明、圓形的乳白色菌落。燦爛弧菌在20℃培養(yǎng)24h～48h，形成表面光滑、微隆起、半透明、桿狀的乳白色菌落。棘皮動物弧菌在20℃培養(yǎng)24h～48h，形成表面光滑、微隆起、不透明、短桿形的乳白色菌落。嗜環(huán)弧菌在20℃培養(yǎng)24h～48h，形成表面光滑、隆起、邊緣不整齊、不透明、短桿形的乳白色菌3.3.7.2細(xì)菌染色溶珊瑚弧菌菌株經(jīng)革蘭氏染色為陰性，呈球形。5錫那羅州弧菌菌株經(jīng)革蘭氏染色為陰性，呈球形。燦爛弧菌菌株經(jīng)革蘭氏染色為陰性，呈桿形。棘皮動物弧菌菌株經(jīng)革蘭氏染色為陰性，呈短桿形。嗜環(huán)弧菌菌株經(jīng)革蘭氏染色為陰性，呈短桿形。3.3.7.3生理生化特性生理生化反應(yīng)試驗結(jié)果見表2。表2中間球海膽主要致病菌的生理生化反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)項目溶珊瑚弧菌錫那羅州弧菌燦爛弧菌棘皮動物弧菌嗜環(huán)弧菌賴氨酸++-+精氨酸++ - 鳥氨酸++---水楊素-+--蔗糖++ ++甘露醇+----注：“+”為陽性，“-”為陰性。3.3.7.416SrRNA序列測定與同源性分析測定的溶珊瑚弧菌、錫那羅州弧菌、燦爛弧菌、棘皮動物弧菌和嗜環(huán)弧菌DNA序列與附錄所列的基因序列分別進行對比，同源性均達99%以上。3.8綜合判定3.8.1符合以下所有特征者判定為海膽紅斑病臨床癥狀與3.2.1相符；菌落形態(tài)和染色觀察與3.3.7.1和3.3.7.2相符；生理生化反應(yīng)結(jié)果與3.3.7.3（表2）相符；16SrRNA基因序列同源性分析結(jié)果與3.3.7.4相符。3.8.2符合以下所有特征者判定為海膽黑嘴病臨床癥狀與3.2.2相符；菌落形態(tài)和染色觀察與3.3.7.1和3.3.7.2相符；生理生化反應(yīng)結(jié)果與3.3.7.3（表2）相符；16SrRNA基因序列同源性分析結(jié)果與3.3.7.4相符。4.綜合防治64.1.1消毒使用含氯消毒劑徹底清潔養(yǎng)殖場地、養(yǎng)殖設(shè)施及養(yǎng)殖器具，含氯消毒劑使用應(yīng)符合SC1059要求。4.1.2苗種選擇苗種應(yīng)來自無疫區(qū)，生產(chǎn)單位為具有苗種生產(chǎn)資質(zhì)，經(jīng)水產(chǎn)苗種產(chǎn)地檢疫合格，每批具有第三方檢測單位出具的檢測報告，苗種質(zhì)量應(yīng)符合DB21/T1859要求。4.1.3養(yǎng)殖管理4.1.3.1水質(zhì)水源應(yīng)符合GB11607漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。海域無污染，無大量淡水注入，水流通暢，透明度3m以上，冬季不結(jié)冰；且應(yīng)滿足其他條件：——大潮期低潮時水深≥8m；——鹽度26～34；——pH7.5～8.5；——溶解氧≥5mg/L?！Ｋ魉?0cm/s～45cm/s?！疁?℃~26℃。注：每隔10d～15d，使用生物型底質(zhì)改良劑和水質(zhì)改良劑各1次。4.1.3.2養(yǎng)殖水層春秋季養(yǎng)殖籠（箱）最上層離水面2m～4m，高溫季節(jié)及冬季應(yīng)降低水層，養(yǎng)殖籠（箱）最上層離水面≥6米。隨著海膽的生長，應(yīng)及時增補浮漂，根據(jù)個體的大小及時調(diào)整養(yǎng)殖箱籠網(wǎng)衣的網(wǎng)目。大風(fēng)浪來臨前，及時采取避浪措施，宜將筏架進行整體適度下沉。4.1.3.3養(yǎng)殖密度養(yǎng)殖密度應(yīng)根據(jù)海膽殼徑大小決定，10mm～15mm海膽600個/m2～800個/m2、15mm～20mm海膽400個/m2～600個/m2、30mm～40mm海膽250個/m2～300個/m2。4.1.3.4餌料投喂種類以海帶、裙帶菜、石莼、馬尾藻等大型海藻為主；每次投喂量為4000g/m2～6000g/m2，4d～6d投喂一次，根據(jù)季節(jié)不同做適當(dāng)調(diào)整。4.2治療7藥物選擇和治療應(yīng)符合NY5071、SC/T1132和中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告、第2292號公告、第2583號公告、第2638號公告。a）外用藥物治療：使用1g/m3～2g/m3次氯酸鈉溶液（有效氯10%）溶于水后，濾去殘渣后全池潑灑1次～2次，每天一次，連續(xù)潑灑2d～3d。或使用0.45mL/m3～0.75mL/m3的聚維酮碘溶液（10%）全池潑灑，每天一次，連續(xù)潑灑2d～3d。b）抗生素治療：使用氯霉素類、四環(huán)素類等敏感性高的廣譜抗生素進行治療。治療時需進行藥敏試驗，選擇對病原菌敏感的抗生素，并注意輪換用藥以防止耐藥性的產(chǎn)生。8（規(guī)范性附錄）試劑配方A.12216E液體培養(yǎng)基蛋白胨5.0g酵母粉檸檬酸鐵0.1g氨化鈉19.45g氨化鎂5.98g硫酸鈉3.24g氨化鈣氯化鉀0.55g碳酸鈉0.16g溴化鉀0.08g氨化鍶0.034g硼酸0.022g硅酸鈉0.004g氟化鈉0.0024g硝酸銨0.0016g磷酸氫二鈉0.008g瓊脂15.0gpH7.6±0.225℃A.2TE緩沖液（pH8.0）將0.121gTris堿（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二鈉（分子量372.24）加入80mL雙蒸水中，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，加雙蒸水定容至100mL，室溫保存。A.310%SDS溶液將10g十二烷基硫酸鈉加入80mL雙蒸水中，加熱至68℃助溶，再加入雙蒸水定容至100mL，室溫保存。A.4蛋白酶K（20mg/mL）將蛋白酶K溶解于雙蒸水中，至終濃度20mg/mL，分裝入小管，置-20℃保存。A.575mol/L的NaCl溶液將29.22gNaCl溶解于80mL雙蒸水中，再加雙蒸水定容至100mL，室溫保存。A.6CTAB/NaCI溶液94.1gNaCl溶解于80mL雙蒸水中，緩慢加入10gCTAB，再加雙蒸水定容至100mL，室溫保存。A.7酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）將25體積的酚、24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中，上面加上TE緩沖液，4℃保存。A.8氯仿:異戊醇（24:1）將24體積的氯仿和1體積的異戊醇混合即可，室溫貯存于不透光的瓶中。A.950×TAE電泳緩沖液在400mL雙蒸水中溶解121gTris堿，加入28.55mL冰乙酸和50mL0.5/LEDTA。再加雙蒸水定容至500mL，室溫保存。使用時，配成1xTAE電泳緩沖液。A.101×TAE電泳緩沖液加入50×TAE電泳緩沖液20mL并加水定容至1000mL，配置成工作液，室溫保存。A.10溴酚藍指示劑溶液6×上樣緩沖液將溴酚藍100mg，加雙蒸水5mL，在室溫下過夜。待溶解后再稱取蔗糖25g，加雙蒸水溶解后移入溴酚藍溶液中，搖勻后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，調(diào)至藍色。（資料性附錄）溶珊瑚弧菌16SrRNA基因參考性序列（1471bp）1attgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggaaacgagttatctgaacc61ttcggggaacgataacggcgtcgagcggcggacgggtgagtaatgcctgggaaattgccc121tgatgtgggggataaccattggaaacgatggctaataccgcataatagcttcggctcaaa181gagggggaccttcgggcctctcgcgtcaggatatgcccaggtgggattagctagttggtg241aggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgatcagccacact301ggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgg361gcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtact421ttcagcagtgaggaaggtggatgtgttaatagcgcattcatttgacgttagctgcagaag481aagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcg541gaattactgggcgtaaagcgcatgcaggtggtttgttaagtcagatgtgaaagcccgggg601ctcaacctcggaattgcatttggaactggcagactagagtactgtagaggggggtagaat661ttcaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctgaaggaataccggtggcgaaggcggccc721cctggacagatactgacactcagatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccc781tggtagtccacgccgtaaacgatgtctacttggaggtagtggccgtgagccgtggctttc841ggagctaacgcgttaagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaatg901aattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaaga961accttacctactcttgacatcctcagaagagactggagacagtcttgtgccttcgggaac1021tgagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcc1081cgcaacgagcgcaacccttatccttgtttgccagcgagtcatgtcgggaactccagggag1141actgccggtgataaaccggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacga1201gtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacagagggcggccaacttgcgaaagtgag1261cgaatcccaaaaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtc1321ggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtaca1381caccgcccgtcacaccatgggagtgggctgcaaaagaagtgggtagtttaaccttcgggg1441ggacgctcaccactttgtggttcatgactgg錫那羅州弧菌16SrRNA基因參考性序列（1206bp）1ctacacatgcaagtcgagcggaaacgagttaactgaaccttcgggggacgttaacggcgt61cgagcggcggacgggtgagtaatgcctgggaaattgccctgatgtgggggataaccattg121gaaacgatggctaataccgcataatagcttcggctcaaagagggggaccttcgggcctct181cgcgtcaggatatgcccaggtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcg241acgatccctagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccaga301ctcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccat361gccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcagtgaggaaggtgga421gtcgttaatagcggcctcatttgacgttagctgcagaagaagcaccggctaactccgtgc481cagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgc541atgcaggtggtttgttaagtcagatgtgaaagcccggggctcaacctcggaattgcattt601gaaactggcaaactagagtactgtagaggggggtagaatttcaggtgtagcggtgaaatg661cgtagagatctgaaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacagatactgacactc721agatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacg781atgtctacttggaggtt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