微生物學檢驗技術 課件 9項目九：常用培養(yǎng)基制備

項目九常用培養(yǎng)基制備學習目標1.掌握細菌的生長繁殖特征、生長曲線的概念以及四個時期的特點。2.掌握條件致病菌與菌群失調的基本概念。3.熟悉消毒與滅菌的基本原理。4.了解常用培養(yǎng)基的基本配制方法。5.樹立正確的無菌操作觀念和無菌操作的能力。項目九常用培養(yǎng)基制備思維導圖項目九常用培養(yǎng)基制備一、細菌的生理項目九常用培養(yǎng)基制備概述1.細菌具有與其它生物相似的細胞結構和化學組成。2.細菌以無性二分裂方式進行繁殖，人工培養(yǎng)的細菌會出現(xiàn)典型的生長曲線。3.不同種類的細菌具有不同的酶系統(tǒng)，代謝途徑不同，一些特殊的代謝產(chǎn)物可用來鑒定細菌。4.正常菌群可對人體發(fā)揮營養(yǎng)、生物拮抗、免疫等作用。5.培養(yǎng)基按照用途可分為基礎培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。項目九常用培養(yǎng)基制備1.化學元素

化學元素是構成所有生物的物質基礎。根據(jù)各類化學元素所占比例的大小，可將其分為：一、細菌的生理（一）細菌的化學組成主要元素：碳、氫、氧、氮、磷、硫、鉀、鈣、鎂、鐵等微量元素：鈉、鋅、錳、氯、鉬、硒、鈷、銅、鎢、鎳、硼等2.化學成分及分各種化學元素主要以有機物、無機物和水的形式存在于細菌細胞內，構成細菌生命體的各種組分水：占細胞在總重量的75-90%；有機物：蛋白質、糖類、脂類等無機物：鉀、鈉、鐵、鎂、鈣、氯等；核酸：DNA、RNA特殊組分：肽聚糖、胞壁酸、磷壁酸、脂多糖等一、細菌的生理（一）細菌的化學組成1.帶電現(xiàn)象革蘭陽性菌等電點pH為2～3，革蘭陰性菌的等電點pH為4～5。細菌一般多處于弱堿性、中性或弱酸性條件，因此細菌表面一般帶負電荷。由于革蘭陽性菌細胞壁中含磷壁酸較多，因此帶負電荷更多。細菌的帶電現(xiàn)象與細菌的染色反應、凝集反應、抑菌和殺菌作用有密切關系。一、細菌的生理（二）細菌的物理性狀2.光學性質：細菌無色半透明，光線照射細菌時，一部分被吸收，一部分被折射，故菌液呈混濁狀。單位體積中的細菌數(shù)量與濁度成正比，可用比濁法或分光光度計估計細菌數(shù)。3.滲透壓：細菌體內含有高濃度的營養(yǎng)物質和無機鹽，處于高滲狀態(tài)。在純水中菌體因吸水而脹裂。在高滲透環(huán)境中，菌體水分逸出，胞漿不能生長繁殖。

4.半透性：細菌細胞壁、細胞膜均有半透性，水及小分子物質可通過，有利于吸收和排出。5.表面積：細菌體積微小，但單位體積的表面積遠比其他生物細胞要大，有利于細菌與外界進行物質交換，故細菌代謝旺盛，生長繁殖迅速。一、細菌的生理（二）細菌的物理性狀1.環(huán)境條件：（1）適宜的酸堿度：多數(shù)菌：一般為pH7.2～7.6嗜堿：霍亂弧菌pH8.4～9.2嗜酸：結核分枝桿菌pH6.5～6.8一、細菌的生理（三）細菌的生長與代謝1.環(huán)境條件：（2）合適的溫度：嗜冷菌:-5－30℃最適溫度：10～20℃嗜溫菌:10－45℃最適溫度：20～40℃嗜熱菌:25－95℃最適溫度：50～60℃一、細菌的生理（三）細菌的生長與代謝1.環(huán)境條件：（3）必要的氣體環(huán)境：

專性需氧菌：如結核桿菌專性厭氧菌：如破傷風梭菌、脆弱類桿菌兼性厭氧菌：大多數(shù)病原菌微需氧菌：如空腸彎曲、幽門螺桿菌一、細菌的生理（三）細菌的生長與代謝2.細菌生長繁殖的規(guī)律：（1）細菌的繁殖方式：無性二分裂（2）細菌的生長曲線：將一定數(shù)量的細菌接種中在適當?shù)呐囵B(yǎng)基，研究細菌生長過程的規(guī)律，以培養(yǎng)時間為橫坐標，培養(yǎng)物中活菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標，得出一條生長曲線。一、細菌的生理（三）細菌的生長與代謝2.細菌生長繁殖的規(guī)律：（2）細菌的生長曲線：1）遲緩期（A-B）2）對數(shù)生長期(B-C)3）平穩(wěn)期(C-D)4）衰亡期(D-E)一、細菌的生理（三）細菌的生長與代謝3.細菌的代謝：（1）分解代謝：

是指細胞將大分子物質降解成小分子物質，并伴隨能量釋放的過程。（2）合成代謝：是指細胞利用簡單的小分子物質合成復雜大分子的過程，是耗能過程，能量來源于分解代謝過程中產(chǎn)生的能量。

將兩者緊密結合在一起的稱為中間代謝。一、細菌的生理（三）細菌的生長與代謝3.細菌的代謝：（3）能量代謝：

根據(jù)生物代謝過程中受氫體的不同，細菌的生物氧化可分為有氧呼吸、無氧呼吸及發(fā)酵。1）有氧呼吸：此過程需要氧氣作為最終受氫體，把糖類等有機物徹底氧化分解，產(chǎn)生出二氧化碳和水，同時釋放出大量的能量。2）無氧呼吸：此過程是以除氧以外的其它無機物作為受氫體，把糖類等有機物分解成為不徹底的氧化產(chǎn)物，同時釋放出少量能量。3）發(fā)酵：將自身的某些代謝產(chǎn)物作為受氫體，同時將后者還原成發(fā)酵產(chǎn)物。一、細菌的生理（三）細菌的生長與代謝二、微生物的分布項目九常用培養(yǎng)基制備二、微生物的分布（一）陸生環(huán)境微生物的分布：土壤微生物的數(shù)量和分布主要受到營養(yǎng)物、含水量、含氧量、溫度、pH等因素的影響，集中分布于距地表10~20cm的耕作層，其中大部分為非致病菌，也有一部分來自人和動物體內的病原菌。（二）水生環(huán)境微生物的分布：水中的細菌群有水中天然的微生物群，也有來自土壤、塵埃、垃圾、人和動物排泄物中的微生物。水的來源及狀態(tài)決定了微生物分布的種類和數(shù)量。（三）空氣中微生物的分布：空氣中微生物絕大部分來源于人和動物呼吸道產(chǎn)生的飛沫、進入大氣的土壤塵粒、污水產(chǎn)生的氣溶膠等。二、微生物的分布1.正常菌群：正常人體的體表及與外界相通的腔道都有一定數(shù)量和種類的微生物寄生，這些微生物在正常情況下對機體無害，甚至有益，稱之為正常微生物群或正常菌群。（四）人體中微生物的分布二、微生物的分布（四）人體中微生物的分布?體表皮膚?與外界相通的腔道分布于二、微生物的分布正常菌群的生理意義：（1）營養(yǎng)作用：合成維生素、蛋白質、氨基酸、葉酸等物質（2）生物拮抗：阻止病原菌定居、繁殖（3）免疫作用：促進免疫器官成熟（4）生長發(fā)育作用：有利于宿主的生長、發(fā)育和長壽。（5）抗癌作用：可使致癌物質轉變?yōu)榉侵掳┪镔|。（四）人體中微生物的分布1.正常菌群：二、微生物的分布2.條件致病菌與菌群失調癥：（1）條件致病菌：指的是正常情況下不致病，但是在某些特定條件下可致病，這樣的菌群稱為條件致病菌或機會致病菌。可導致其致病的特定條件包括：①寄居部位改變。②機體抵抗力降低。③菌群失調。菌群失調（dysbacteriosis）是指機體某部位正常菌群中各菌種間的比例發(fā)生較大幅度變化，由生理性組合轉變?yōu)椴±硇越M合的狀態(tài)。（四）人體中微生物的分布二、微生物的分布2.條件致病菌與菌群失調癥：（2）菌群失調癥：由于菌群失調而導致的宿主出現(xiàn)一系列臨床癥狀，稱為菌群失調癥或菌群交替癥。菌群失調的發(fā)生多見于使用抗生素、醫(yī)療措施使用不當和慢性消耗性疾病等。（四）人體中微生物的分布二、微生物的分布3.致病菌：細菌的致病性是對特定宿主而言，致病菌(Pathogenicbacteria)是指能使宿主致病的細菌，反之則為非致病菌，但是二者并無明顯界限。有些細菌在一般情況下不致病，但是在特定情況下就致病，我們稱其為條件致病菌或機會致病菌。（四）人體中微生物的分布三、消毒與滅菌項目九常用培養(yǎng)基制備三、消毒與滅菌1.消毒（disinfection）：利用某種物理或化學方法殺死或滅活物質或物體中所有病原微生物的方法。2.滅菌（sterilization）：是指利用某種方法殺死物體中所有微生物（病原微生物、非病原微生物和細菌芽胞）的一種措施。3.防腐（antisepsis）：指應用化學或者物理的方法抑制微生物生長的一種方法。4.抑制（inhibition）：在某種藥物亞致死劑量作用下導致微生物生長停止，在去掉這種藥物之后生長仍可以恢復的生物學現(xiàn)象。5.無菌操作：無菌指的是沒有活著的微生物存在。無菌操作是指在操作的所有環(huán)節(jié)都沒有微生物的污染的方法。（一）基本概念1.兩者要求達到的處理水平不同：消毒只要求殺滅或/和清除致病微生物，使其數(shù)量減少到不再能引起人發(fā)病。滅菌不僅要求殺滅或/和清除致病微生物，還要求將所有微生物全部殺滅或/和清除掉，包括非致病微生物。2.兩者選用的處理方法不同：滅菌與消毒相比，要求更高，處理更難。滅菌必須選用能殺滅抵抗力最強的微生物(細菌芽胞)的物理方法或化學滅菌劑，而消毒只需選用具有一定殺菌效力的物理方法、化學消毒劑或生物消毒劑。3.應用的場所與處理的物品也不同：滅菌主要用于處理醫(yī)院中進入人體無菌組織器官的診療用品和需要滅菌的工業(yè)產(chǎn)品，消毒用于處理日常生活和工作場所的物品，也用于醫(yī)院中一般場所與物品的處理。（二）消毒與滅菌的區(qū)別三、消毒與滅菌1.抑菌劑(bacteriostaticagent)：能抑制微生物生長的物質。抑菌劑不能殺死細菌，但可以通過抑制細菌的生長，阻止細菌滋生過多、危害健康。2.消毒劑（disinfectant）：

通常是指能有效地控制或殺死水系統(tǒng)中的微生物--細菌、真菌和藻類的化學制劑。其作用機制通常是不可逆的與靶細胞進行緊密的結合，使其生長不可恢復。3.溶菌劑(bacteriolysis)：能通過使細胞裂解的方式殺死微生物，這類物質能通過抑制細胞壁合成或損傷細胞膜的方式使細菌溶解，將這類物質加入到生長的細胞懸液后會導致細胞數(shù)量減少、細胞懸液濁度降低、透明度增加。（三）控制微生物的化學方法三、消毒與滅菌4.抗代謝物（antimetabolite）：

微生物生長過程通常需要一些生長因子，在微生物生長液中加入生長因子的結構類似物可以競爭結合其靶位點，干擾微生物的正常代謝，以達到抑制微生物生長的目的。（三）控制微生物的化學方法葉酸的結構三、消毒與滅菌1.高溫滅菌法：

用超過微生物承受的最高溫度來殺滅微生物的方法稱為高溫滅菌法。主要包括干熱和濕熱兩種方法。（1）干熱滅菌法：

①燒灼：屬于高溫短時殺菌，利用高溫使微生物的蛋白質及酶發(fā)生凝固或變性而死亡。這是應用最廣泛而有效的滅菌方法，主要用于手術器械和物品的滅菌。②干烤：用干熱滅菌箱（多采用機械對流型烤箱）進行滅菌。滅菌條件為：160℃維持2小時；170℃維持1小時；l80℃維持30分鐘；高溫下可達滅菌要求。適用于易被濕熱損壞和在干燥條件下使用更方便的物品（如金屬、玻璃、陶瓷及凡士林紗布條等）滅菌。（四）控制微生物的物理方法三、消毒與滅菌1.高溫滅菌法（2）濕熱滅菌法：是指以高溫高壓水蒸氣為介質，用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進行滅菌的方法。由于蒸汽潛熱大，穿透力強，容易使蛋白質變性或凝固，最終導致微生物的死亡，所以該法的滅菌效率比干熱滅菌法高，是藥物制劑生產(chǎn)過程中最常用的滅菌方法。濕熱滅菌法可分為：高壓蒸汽滅菌法、間歇蒸汽滅菌法、巴氏消毒法、煮沸滅菌法和流通蒸汽滅菌法。（四）控制微生物的物理方法三、消毒與滅菌2.輻射滅菌法包括γ射線、X射線和加速電子等，對各種微生物均有致死作用，細菌繁殖體對射線比芽胞要敏感。其機制是直接或者通過產(chǎn)生游離基，破壞DNA分子的共價鍵。3.紫外滅菌法：

波長在200nm～300nm的紫外線具有殺菌作用，以250nm～260nm最強，與嘌呤和嘧啶的吸收光譜高峰一致。紫外線可使DNA鏈上相鄰的兩個胸腺嘧啶共價結合而形成二聚體，干擾DNA正常轉錄，導致微生物的變異或死亡。但是由于紫外線穿透力較弱，普通玻璃、紙張、塵埃、水蒸汽等均能阻檔紫外線，因此一般用于手術室、病房、實驗室的空氣消毒。（四）控制微生物的物理方法三、消毒與滅菌4.干燥滅菌法干燥可以使細菌脫水、鹽類物質濃縮、蛋白質變性，而產(chǎn)生抑菌和殺菌的作用。5.過濾除菌法：

過濾除菌法主要用于血清、抗生素、維生素等不耐熱也不能用化學方法除菌的生物制品及空氣的除菌，但是不能除去病毒、支原體、衣原體等微生物。6.超聲波滅菌法：超聲波滅菌法是利用超聲波的高頻振動，引起溶液內瞬時真空狀態(tài)，導致細胞裂解而達到滅菌效果的方法。（四）控制微生物的物理方法三、消毒與滅菌1.抗生素（antibiotic）：抗生素主要是由細菌、霉菌或其他微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物或人工合成的類似物，能抑制其他微生物生長或者殺死其他微生物。2.噬菌體（phage）：

噬菌體是病毒的一種，具有病毒的所有特性（個體微小；不具有完整細胞結構；只含有一種核酸）。其特別之處是專以細菌為宿主。噬菌體是感染細菌、真菌、藻類、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，因部分能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。（五）控制微生物的生物學方法三、消毒與滅菌四、培養(yǎng)基的成分與作用項目九常用培養(yǎng)基制備水既是細菌細胞的主要組成成分，又是細菌生長繁殖所必不可少的物質。水在細菌細胞中的主要生理功能有：①作為良好的溶劑，使營養(yǎng)物質溶解，利于細菌吸收；代謝產(chǎn)物的排泌也必須以水為介質才能完成。②作為良好的導體對細菌細胞溫度調節(jié)起到很重要的作用。③維持蛋白、核酸等生物大分子天然構象的穩(wěn)定和活性。④作為新陳代謝的重要媒介參與細菌細胞內一系列化學反應。（一）水四、培養(yǎng)基的成分與作用1.碳源是在細菌生長過程中為細菌提供碳元素來源的物質。碳源既是細菌合成蛋白質、糖類、脂類、核酸、酶類等菌體成分的原料，又作為重要的能源物質為細菌提供生命活動所需的能量。2.氮源是指為細菌提供氮元素來源的物質。氮源一般不提供能量，主要為細菌提供合成菌體成分的原料，但是某些厭氧菌會在厭氧條件下分解氨基酸提供能量。（二）營養(yǎng)成分四、培養(yǎng)基的成分與作用3.無機鹽細菌需要多種無機鹽以提供其生長繁殖所需的各種元素，如磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵，以及微量元素鈷、鋅、錳、銅等。無機鹽除構成菌體成分以外，其作用還有：①參與能量的儲存和轉運；②作為酶的輔基和酶激活劑，維持酶活性；③調節(jié)菌體內外滲透壓；④某些元素與細菌的致病作用有關。4.生長因子生長因子是指某些細菌生長繁殖所必需的、自身不能合成或者合成量很小且不能滿足自身生長需要的、必須由生長環(huán)境提供的有機化合物，如維生素、嘌呤、嘧啶、氨基酸等。（二）營養(yǎng)成分四、培養(yǎng)基的成分與作用5.微量元素微生物的生長過程中還需要一些微量元素。微量元素通常指的是對微生物生長起重要作用，但是需求量極其微小，通常在10-8~10-6mol/L（這里指的是在培養(yǎng)基中的濃度）。根據(jù)不同種類的細菌對營養(yǎng)物質的要求不同，可將細菌分成兩類：①非苛養(yǎng)菌②苛養(yǎng)菌（二）營養(yǎng)成分四、培養(yǎng)基的成分與作用凝固劑指的是能使液體發(fā)生凝固的物質，最常用的為瓊脂，特殊情況下還可以使用明膠、硅膠、卵蛋白及血清。一般配制液體培養(yǎng)基時不需要添加凝固劑。（三）凝固劑四、培養(yǎng)基的成分與作用（四）指示劑（五）抑制劑為觀察細菌是否充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，通常會加入一些指示劑，如酚紅、溴甲酚紫等酸堿指示劑，以及亞甲基藍等氧化還原指示劑。為促進目的菌生長，需在培養(yǎng)基中加入某種化學物質，有選擇的抑制某些非目的菌生長，如抗生素、亞硫酸鈉等物質。五、培養(yǎng)基的種類和用途項目九常用培養(yǎng)基制備1.天然培養(yǎng)基：由天然物質制成，化學成分很不恒定，也難以確定，但配制方便，營養(yǎng)豐富，培養(yǎng)效果好，常用的天然培養(yǎng)基包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、玉米粉、牛奶、血清等。2.合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是由成分完全已知的各種化學物質配制而成的培養(yǎng)基，也稱化學限定培養(yǎng)基。3.半合成培養(yǎng)基：在天然有機物的基礎上適當加入已知成分的無機鹽類，或在合成培養(yǎng)基的基礎上添加某些天然成分（一）按照培養(yǎng)基的成分來分五、培養(yǎng)基的種類和用途1.液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中不加任何凝固劑。這種培養(yǎng)基成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料，生長速度快，代謝旺盛，適于作生理等研究、增菌培養(yǎng)、純培養(yǎng)后觀察細菌的生長現(xiàn)象，也常用于發(fā)酵工業(yè)。2.固體培養(yǎng)基：是在培養(yǎng)基中加入凝固劑，如2%~3%瓊脂、明膠、硅膠等，融化待冷卻后即為固體。固體培養(yǎng)基常用于微生物分離、鑒定、計數(shù)、藥敏試驗和菌種保存等方面。3.半固體培養(yǎng)基：是在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑，通常是0.2%~0.5%瓊脂，瓊脂融化冷卻后呈半固體狀態(tài)。可用于觀察細菌的運動、菌種鑒定及噬菌體效價滴定等方面。（二）按照培養(yǎng)基的物理性狀來分五、培養(yǎng)基的種類和用途（三）按照微生物的種類來分五、培養(yǎng)基的種類和用途細菌培養(yǎng)基放線菌培養(yǎng)基酵母菌培養(yǎng)基霉菌培養(yǎng)基1.基礎培養(yǎng)基：

基礎培養(yǎng)基是