免疫學檢驗技術(shù)-酶免疫技術(shù)

教學目標知識目標1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點）、常用的酶及酶的底物、酶標記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測定的應(yīng)用、免疫印跡試驗。3.了解斑點酶免疫吸附試驗。能力目標思政-素質(zhì)目標免疫學思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實際、嚴謹求實1.酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點目錄一免疫標記技術(shù)概述二酶標志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗三其他酶免疫技術(shù)用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物（或稱示蹤物），標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)；并借助于熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定；可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應(yīng)進行定性、定量和定位研究；一免疫標記技術(shù)概述免疫標記技術(shù)的發(fā)展歷程酶免ELISA（Engvall，1971）放射免疫分析（Berson和Yalow，1960）免疫熒光分析（Coons，1941）金標免疫分析（Faulk和Taylor，1971）化學發(fā)光免疫分析（Arakawa，1977）時間分辨熒光免疫分析（Soini和Hemmila，1979）電化學發(fā)光免疫分析（Leland，1990）液相芯片（美國Luminex公司，1997）AgAb*Ag-Ab*熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)免疫組化技術(shù)特點分類酶免疫技術(shù)(ng)放射免疫技術(shù)(pg)熒光免疫技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)發(fā)光免疫測定技術(shù)高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位

酶免疫分析技術(shù)是以酶標記抗原或抗體為主要試劑，檢測樣本中相應(yīng)的抗體或抗原。將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定第一節(jié)酶標志物的制備

一、常用的酶和底物標記酶的條件：

1.活性高，純度高2.作用專一性強3.性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)4.測定方法簡便易行、敏感、精確5.酶和底物對人體無害且價廉易得1.辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值越大純度越高RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要

ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶

常用酶HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氫體DH2習慣上被稱為底物，底物有多種。H2O2為受氫體，不穩(wěn)定，需在用前臨時配置。OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

2.堿性磷酸酶

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌中提取。ALP底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。二、制備酶標記抗體(抗原）的方法制備酶標記物的方法應(yīng)符合簡單、產(chǎn)量高，避免酶、抗體（抗原）、酶標記物各自形成聚合物，標記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則。

主要方法：1.戊二醛交聯(lián)法

2.改良過碘酸鈉法

三、酶標記物的純化與鑒定純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。常用的是凝膠層析法和硫酸銨鹽析法，硫酸銨鹽析法操作簡便。酶標記物的鑒定主要有：1、酶活性和抗體（抗原）免疫活性的鑒定

2、酶標記率的測定

四、固相載體（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體或抗原的容量大；②與抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定且不易脫落；③不影響所固定的抗體或抗原的活性；④固化方法應(yīng)簡便、快速。

（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應(yīng)板、小試管和小珠三種。2．微粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。

3.膜載體是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜等。第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗一、ELISA的檢測原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度，對標本中抗原或抗體進行定性或定量。二、ELISA的方法類型（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，適用于檢測含有至少兩個抗原決定簇的較大分子抗原的測定。

E固相抗體標本（含抗原）酶標抗體EE底物如果血清標本中含有類風濕因子（RF），則可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因為類風濕因子是一種抗變性IgG的自身抗體，它可同時與固相抗體和酶標抗體的Fc段發(fā)生結(jié)合，導致假陽性的出現(xiàn)。

（二）雙位點一步法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。如果待檢標本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴重時，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時可將待檢標本適當稀釋后重新測定。

EEE底物固相抗體標本（含抗原）酶標抗體（三）間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體（亦稱為酶標二抗）來檢測已與固相結(jié)合的待測抗體。

固相抗原標本（含抗體）酶標二抗底物EEE此法由于受血清中高濃度非特異性IgG的干擾，通常要將待測標本進行一定稀釋后才能測定。（四）競爭法競爭法既可用于檢測抗原，也可用于檢測抗體。1.競爭法測抗原待測抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標抗原量與待測抗原的量呈反比，待測抗原越多，其結(jié)合特異性抗體越多，而酶標抗原與特異性抗體結(jié)合就減少，底物顯色反應(yīng)淺；顯色越深，待測抗原量則越少。酶標抗原

EEEE固相抗體標本（含抗原）底物E競爭法主要用于檢測小分子抗原，因小分子抗原只有一個抗原決定簇

。

2.競爭法檢測抗體HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區(qū)別。（1）競爭法檢測HBcAb：先將HBcAg包被在固相載體上，形成固相抗原，之后加入待測樣本和酶標的特異抗體，待測樣本的抗體將與酶標抗體競爭與固相載體上的特異抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶底物顯色，顯色的強弱與待測抗體的含量成反比

。固相抗原標本（含抗體）底物酶標抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb（2）競爭法檢測HBeAb：先將HBeAb包被在固相載體上，形成固相抗體，同時加入待測樣本和中和抗原HBeAg，待測樣本的抗體將與固相抗體競爭與中和抗原HBeAg結(jié)合。加入酶標的特異抗體，再加入酶底物，則顯色的強弱與待測樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比。固相抗體標本（含抗體）抗原酶標抗體EE底物E競爭法檢測HBeAb

(五)捕獲法固相載體上連接的是IgM的第二抗體，先將標本中的IgM類抗體捕獲，然后再分別加入特異抗原和酶標抗體（動物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特異抗原-酶標抗體的復合物，復合物含量與待測IgM成正相關(guān)。最后加入底物，依據(jù)顯色程度來確定待測血清中IgM的含量。

固相抗人lgM抗體E標本（含抗體）抗原底物EE捕獲法檢測lgM抗體在應(yīng)用此法時需注意RF(IgM類)及其他非特異IgM的干擾。RF(IgM類)既能與固相載體上的IgM第二抗體結(jié)合，又能與隨后加入的酶標抗體結(jié)合，從而導致假陽性結(jié)果。(六)雙抗原夾心法將已知抗原包被在固相載體上，待測標本中的相應(yīng)抗體可分別與固相抗原和酶標抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標抗原的復合物，加入底物后依據(jù)顯色程度來確定待測抗體的含量。

E固相抗原標本（含抗體）酶標抗原底物EE三、ELISA的關(guān)鍵技術(shù)（一）各種試劑的制備1．抗原和抗體2．包被與封閉

包被(coating)是將抗原或抗體固定在固相載體上的過程。封閉(blocking)就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。

3．酶標結(jié)合物的制備

（二）最適工作濃度的選擇各類血清抗原稀釋度1：501：1001：2001：4001：800強陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.060.05稀釋液0..080.020.020.020.04間接法測抗體中包被抗原最適工作濃度的選擇

（三）測定方法的標準化

1．加樣應(yīng)力求準確，并注意不可產(chǎn)生氣泡。2．溫育注意反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致。3．洗滌

洗滌有手工洗滌和洗板機洗滌兩種方法，若用洗板機洗滌要適當增加洗滌次數(shù)。4．顯色要控制好顯色時間。四、評價與應(yīng)用（一）評價ELISA的方法具有高度的特異性和靈敏度，操作方便快速，試劑穩(wěn)定，對環(huán)境無污染，儀器、設(shè)備要求簡單，實驗結(jié)果既可以用肉眼觀察作定性分析，也可以用酶標儀進行定性、定量分析，已經(jīng)成為臨床免疫檢驗中的常用技術(shù)。（二）應(yīng)用1.病原微生物測定2.激素測定3.藥物測定4.腫瘤標志物5.蛋白質(zhì)測定第三節(jié)其他酶免疫技術(shù)一、均相酶免疫技術(shù)

（一）酶擴大免疫分析技術(shù)（二）克隆酶供體免疫分析酶擴大免疫分析技術(shù)示意圖克隆酶供體免疫分析示意圖

液相酶免疫技術(shù)是非均相酶免疫技術(shù)的方法類型之一，因抗原抗體反應(yīng)在液相中進行而得名。其依據(jù)樣品抗原加樣順序和溫育反應(yīng)時相不同可分為平衡法和非平衡法兩種類型。

二、液相酶免疫技術(shù)三、斑點酶免疫吸附試驗屬于ELISA的一種類型，與前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白質(zhì)能力很強的硝酸纖維素膜（NC膜）代替了聚苯乙烯反應(yīng)板來作為固相載體，酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。

四、斑點酶免疫滲濾試驗將NC膜封于塑料小盒中，先在塑料小盒NC膜中滴加已知抗體，干燥后封閉，再依次加入待測標本、酶標抗體，最后加入底物，陽性時可在膜上出現(xiàn)有色斑點。

五、免疫印跡試驗是一種將蛋白質(zhì)電泳和酶免疫測定相結(jié)合的技術(shù)，綜合了凝膠電泳的高分辨力和抗原抗體檢測的高特異性和高敏感性，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種最常用的方法。（一）生物素和親和素的特點1．生物素(biotin，B)六、BAS-ELISA

2．親和素(avidin，A)

3．鏈霉親和素(streptavidin，SA)

常用的方法有三種：BA法BAB法ABC法(二）BAS-ELISA小結(jié)酶免疫技術(shù)

酶免疫組織化學技術(shù)酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定（最常用的為ELISA）液相酶免疫測定雙抗體夾心法雙位點一步法間接法競爭法捕獲法雙抗原夾心法酶擴大免疫測定技術(shù)克隆酶供體免疫分析教學目標知識目標1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點）、常用的酶及酶的底物、酶標記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測定的應(yīng)用、免疫印跡試驗。3.了解斑點酶免疫吸附試驗。能力目標思政-素質(zhì)目標免疫學思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實際、嚴謹求實1.酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點目錄一免疫標記技術(shù)概述二酶標志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗三其他酶免疫技術(shù)用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物（或稱示蹤物），標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)；并借助于熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定；可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應(yīng)進行定性、定量和定位研究；一免疫標記技術(shù)概述免疫標記技術(shù)的發(fā)展歷程酶免ELISA（Engvall，1971）放射免疫分析（Berson和Yalow，1960）免疫熒光分析（Coons，1941）金標免疫分析（Faulk和Taylor，1971）化學發(fā)光免疫分析（Arakawa，1977）時間分辨熒光免疫分析（Soini和Hemmila，1979）電化學發(fā)光免疫分析（Leland，1990）液相芯片（美國Luminex公司，1997）AgAb*Ag-Ab*熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)免疫組化技術(shù)特點分類酶免疫技術(shù)(ng)放射免疫技術(shù)(pg)熒光免疫技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)發(fā)光免疫測定技術(shù)高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位

酶免疫分析技術(shù)是以酶標記抗原或抗體為主要試劑，檢測樣本中相應(yīng)的抗體或抗原。將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定教學目標知識目標1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點）、常用的酶及酶的底物、酶標記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測定的應(yīng)用、免疫印跡試驗。3.了解斑點酶免疫吸附試驗。能力目標思政-素質(zhì)目標免疫學思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實際、嚴謹求實1.酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點目錄一免疫標記技術(shù)概述二酶標志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗三其他酶免疫技術(shù)第一節(jié)酶標志物的制備

一、常用的酶和底物標記酶的條件：

1.活性高，純度高2.作用專一性強3.性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)4.測定方法簡便易行、敏感、精確5.酶和底物對人體無害且價廉易得1.辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值越大純度越高RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要

ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶

常用酶HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氫體DH2習慣上被稱為底物，底物有多種。H2O2為受氫體，不穩(wěn)定，需在用前臨時配置。OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

2.堿性磷酸酶

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌中提取。ALP底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。二、制備酶標記抗體(抗原）的方法制備酶標記物的方法應(yīng)符合簡單、產(chǎn)量高，避免酶、抗體（抗原）、酶標記物各自形成聚合物，標記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則。

主要方法：1.戊二醛交聯(lián)法

2.改良過碘酸鈉法

三、酶標記物的純化與鑒定純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。常用的是凝膠層析法和硫酸銨鹽析法，硫酸銨鹽析法操作簡便。酶標記物的鑒定主要有：1、酶活性和抗體（抗原）免疫活性的鑒定

2、酶標記率的測定

四、固相載體（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體或抗原的容量大；②與抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定且不易脫落；③不影響所固定的抗體或抗原的活性；④固化方法應(yīng)簡便、快速。

（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應(yīng)板、小試管和小珠三種。2．微粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。

3.膜載體是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜等。教學目標知識目標1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點）、常用的酶及酶的底物、酶標記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測定的應(yīng)用、免疫印跡試驗。3.了解斑點酶免疫吸附試驗。能力目標思政-素質(zhì)目標免疫學思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實際、嚴謹求實1.酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點目錄一免疫標記技術(shù)概述二酶標志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗三其他酶免疫技術(shù)ELISA屬于免疫標記技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學者提出，由于其操作過程簡單易行并可以定量，從而使其在生物醫(yī)學領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA方法操作簡單，測定模式多，應(yīng)用方便，亦可自動化，但測定線性范圍較窄，批間變異相對較大，手工操作受影響因素較多，國內(nèi)多用在抗原和抗體的定性檢測，但也可用于定量檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗測定法和其他免疫方法一樣，都是以抗體和抗原的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，其差別在于酶聯(lián)免疫方法以酶或者輔酶作為標記物來標記抗原或抗體，用酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級免疫學反應(yīng)。其最大的特點是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板（或球）吸附抗原或者抗體使之固相化，在其中進行免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)。一、ELISA的檢測原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過酶對底物催化的顯色反應(yīng)程度，對標本中抗原或抗體進行定性或定量。待測樣品（含待測物）與酶標抗原或抗體反應(yīng)洗滌的方法將固相載體上的復合物與其他物質(zhì)分離將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性

使抗原或抗體與某種酶連接，形成酶標抗原或抗體加入酶反應(yīng)底物，復合物上的酶催化底物使其分解，氧化或還原成有色產(chǎn)物1.包被2.抗原抗體反應(yīng)3.洗滌4.顯色ELISA基本原理二、ELISA的方法類型（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，適用于檢測含有至少兩個抗原決定簇的較大分子抗原的測定。

E固相抗體標本（含抗原）酶標抗體EE底物如果血清標本中含有類風濕因子（RF），則可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因為類風濕因子是一種抗變性IgG的自身抗體，它可同時與固相抗體和酶標抗體的Fc段發(fā)生結(jié)合，導致假陽性的出現(xiàn)。

（二）雙位點一步法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。如果待檢標本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴重時，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時可將待檢標本適當稀釋后重新測定。

EEE底物固相抗體標本（含抗原）酶標抗體（三）間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體（亦稱為酶標二抗）來檢測已與固相結(jié)合的待測抗體。此法由于受血清中高濃度非特異性IgG的干擾，通常要將待測標本進行一定稀釋后才能測定。

固相抗原標本（含抗體）酶標二抗底物EEE（四）競爭法競爭法既可用于檢測抗原，也可用于檢測抗體。1.競爭法測抗原待測抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標抗原量與待測抗原的量呈反比，待測抗原越多，其結(jié)合特異性抗體越多，而酶標抗原與特異性抗體結(jié)合就減少，底物顯色反應(yīng)淺；顯色越深，待測抗原量則越少。酶標抗原

EEEE固相抗體標本（含抗原）底物E競爭法主要用于檢測小分子抗原，因小分子抗原只有一個抗原決定簇

。

2.競爭法檢測抗體HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區(qū)別。（1）競爭法檢測HBcAb：先將HBcAg包被在固相載體上，形成固相抗原，之后加入待測樣本和酶標的特異抗體，待測樣本的抗體將與酶標抗體競爭與固相載體上的特異抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶底物顯色，顯色的強弱與待測抗體的含量成反比

。固相抗原標本（含抗體）底物酶標抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb（2）競爭法檢測HBeAb：先將HBeAb包被在固相載體上，形成固相抗體，同時加入待測樣本和中和抗原HBeAg，待測樣本的抗體將與固相抗體競爭與中和抗原HBeAg結(jié)合。加入酶標的特異抗體，再加入酶底物，則顯色的強弱與待測樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比。固相抗體標本（含抗體）抗原酶標抗體EE底物E競爭法檢測HBeAb

(五)捕獲法固相載體上連接的是IgM的第二抗體，先將標本中的IgM類抗體捕獲，然后再分別加入特異抗原和酶標抗體（動物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特異抗原-酶標抗體的復合物，復合物含量與待測IgM成正相關(guān)。最后加入底物，依據(jù)顯色程度來確定待測血清中IgM的含量。

固相抗人lgM抗體E標本（含抗體）抗原底物EE捕獲法檢測lgM抗體在應(yīng)用此法時需注意RF(IgM類)及其他非特異IgM的干擾。RF(IgM類)既能與固相載體上的IgM第二抗體結(jié)合，又能與隨后加入的酶標抗體結(jié)合，從而導致假陽性結(jié)果。(六)雙抗原夾心法將已知抗原包被在固相載體上，待測標本中的相應(yīng)抗體可分別與固相抗原和酶標抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標抗原的復合物，加入底物后依據(jù)顯色程度來確定待測抗體的含量。

E固相抗原標本（含抗體）酶標抗原底物EE三、ELISA的關(guān)鍵技術(shù)（一）各種試劑的制備1．抗原和抗體2．包被與封閉

包被(coating)是將抗原或抗體固定在固相載體上的過程。封閉(blocking)就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。

3．酶標結(jié)合物的制備

（二）最適工作濃度的選擇各類血清抗原稀釋度1：501：1001：2001：4001：800強陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.060.05稀釋液0..080.020.020.020.04間接法測抗體中包被抗原最適工作濃度的選擇

（三）測定方法的標準化

1．加樣應(yīng)力求準確，并注意不可產(chǎn)生氣泡。2．溫育注意反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致。3．洗滌

洗滌有手工洗滌和洗板機洗滌兩種方法，若用洗板機洗滌要適當增加洗滌次數(shù)。4．顯色要控制好顯色時間。四、評價與應(yīng)用（一）評價ELISA的方法具有高度的特異性和靈敏度，操作方便快速，試劑穩(wěn)定，對環(huán)境無污染，儀器、設(shè)備要求