免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)-免疫細(xì)胞及其功能檢驗(yàn)技術(shù)

知識(shí)目標(biāo)1.掌握：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及其亞群的分離純化；T細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志和功能檢測(cè)方法；B細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理；NK細(xì)胞的表面標(biāo)志。2.熟悉：NK細(xì)胞功能的檢測(cè)方法和原理。3.了解：中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理。能力目標(biāo)掌握密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細(xì)胞及其亞群的操作方法。思政-素質(zhì)目標(biāo)責(zé)任心、質(zhì)控、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維教學(xué)目標(biāo)目錄免疫細(xì)胞的分離與純化一淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)二吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)三免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等。通過(guò)分離、純化免疫細(xì)胞及其亞群，并對(duì)其數(shù)量和功能測(cè)定，可以判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)，對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐和科學(xué)研究具有重要意義。前言第一節(jié)免疫細(xì)胞的分離與純化免疫細(xì)胞的分離方法很多，主要根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志、理化性狀和細(xì)胞功能等特征。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、所分離的目的細(xì)胞群種類、數(shù)量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應(yīng)力求操作簡(jiǎn)便、盡量保持細(xì)胞活性兼顧細(xì)胞純度和獲得率。一、白細(xì)胞的分離（一）自然沉降法加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結(jié)果示意圖（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結(jié)果與自然沉降法類似優(yōu)點(diǎn)：速度快、得率高不足：白細(xì)胞黏性增加二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。PBMC是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的細(xì)胞群PBMC也是T、B細(xì)胞分離純化的細(xì)胞來(lái)源。細(xì)胞種類密度紅細(xì)胞1.093白細(xì)胞1.092淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各類血細(xì)胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。（一）

Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過(guò)25℃影響細(xì)胞得率（二）

Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結(jié)果示意圖三、淋巴細(xì)胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細(xì)胞懸液成分仍然較為復(fù)雜、均一性不佳。通常需要進(jìn)一步分離純化淋巴細(xì)胞及其亞群。分離原理主要基于細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等性質(zhì)。淋巴細(xì)胞及其亞類的分離純化是免疫學(xué)檢驗(yàn)與研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)。（一）淋巴細(xì)胞的純化去除紅細(xì)胞：低滲裂解法、氯化銨裂解法。去除血小板：多次洗滌離心法、胎牛血清梯度離心法。去除單核細(xì)胞：黏附法、羧基鐵吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴細(xì)胞的分離E花環(huán)沉降法該法簡(jiǎn)便易行，主要用于T細(xì)胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細(xì)胞并低滲裂解（二）淋巴細(xì)胞的分離尼龍棉分離法該法簡(jiǎn)單快速，可分離T細(xì)胞和B細(xì)胞PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時(shí)預(yù)熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫獲得T細(xì)胞冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細(xì)胞（二）淋巴細(xì)胞的分離免疫磁珠分離法（二）淋巴細(xì)胞的分離流式細(xì)胞術(shù)分離法該法快速、細(xì)胞純度和獲得率高，可分離各種淋巴細(xì)胞及其亞群。四、吞噬細(xì)胞的分離吞噬細(xì)胞包括兩類：一類是大吞噬細(xì)胞即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（包括血液中的單核細(xì)胞以及組織器官中的巨噬細(xì)胞）；另一類是小吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。分離原理：主要根據(jù)其表面標(biāo)志和生物學(xué)特性。（一）單核細(xì)胞的分離Percoll密度梯度分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法（常用方法）免疫磁珠分離法：分選CD14+細(xì)胞（常用方法）黏附法黏附法會(huì)影響單核細(xì)胞的功能，僅適用于去除單核細(xì)胞。（二）巨噬細(xì)胞的分離斑蝥敷貼法：（用于分離人巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的濾紙?zhí)笤谇氨蹆?nèi)側(cè)皮膚，4~5小時(shí)后見(jiàn)皮膚局部充血，48小時(shí)后出現(xiàn)水泡，吸取滲出液（主要為巨噬細(xì)胞）、離心洗滌。腹腔滲出液分離法：（用于分離動(dòng)物巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：少量液體石蠟注入動(dòng)物腹腔內(nèi)，3~4天后沖洗出腹腔滲出液（70%~80%為巨噬細(xì)胞）。（三）中性粒細(xì)胞的分離右旋糖酐沉降法：

操作要點(diǎn)：抗凝靜脈血與6%右旋糖酐溶液按比例混合，室溫條件垂直靜置一定時(shí)間后，紅細(xì)胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白細(xì)胞沉降速度慢位于上層，獲取上層細(xì)胞。第二節(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能變化。數(shù)量檢測(cè)：根據(jù)淋巴細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志。功能測(cè)定：包括體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。一、T細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）T細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)根據(jù)T細(xì)胞表面CD分子檢測(cè)：（1）間接熒光免疫法（2）免疫組織化學(xué)法：①酶標(biāo)（ABC法、APAAP法）②金標(biāo)法（即IGSS法）間接熒光免疫法（二）T細(xì)胞功能檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)：形態(tài)學(xué)法、3H-TdR摻入法、MTT法CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：51Cr釋放法抗原特異性T細(xì)胞定量檢測(cè)：MHC-抗原肽四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)：流式細(xì)胞術(shù)體內(nèi)試驗(yàn)：結(jié)核菌素試驗(yàn)、PHA皮膚試驗(yàn)PBMCPHA5％CO2、

37℃培養(yǎng)72h細(xì)胞涂片染色顯微鏡檢查該法簡(jiǎn)便易行、容易在基層推廣，但主觀因素影響大。形態(tài)學(xué)法T細(xì)胞增殖試驗(yàn)未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（％）＝轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的淋巴細(xì)胞總數(shù)X100％培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞抗凝全血分離液離心過(guò)濾測(cè)量放射性3H-TdR摻入法靈敏度高客觀性好原理：外周血T細(xì)胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍(lán)色甲顆粒的T細(xì)胞

MTT

PHA有機(jī)溶劑測(cè)吸光度（A）值

計(jì)算SI判定細(xì)胞增殖結(jié)果(SI≧2具有意義)MTT法操作簡(jiǎn)便無(wú)放射污染51Cr釋放法淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測(cè)定γ射線CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)原理根據(jù)T細(xì)胞活化的雙識(shí)別原理，用生物工程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞。TMHC-抗原肽四聚體技術(shù)MHC-肽四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理:用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀測(cè)定淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，確定Th1/Th2細(xì)胞的百分率。分泌的細(xì)胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的細(xì)胞因子二、B細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）B細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)根據(jù)B細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)：（1）mIg的檢測(cè)：免疫熒光、免疫組化（2）

CD分子的檢測(cè)：檢測(cè)CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠紅細(xì)胞受體的檢測(cè)：花環(huán)試驗(yàn)（二）B細(xì)胞功能檢測(cè)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：3H-TdR摻入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黃色葡萄球菌菌體或抗IgM抗體）B細(xì)胞抗體產(chǎn)生能力檢測(cè)：溶血空斑試驗(yàn)、ELISPOT經(jīng)典溶血空斑試驗(yàn)1.SRBC致敏的B細(xì)胞與SRBC在凝膠介質(zhì)中混勻；2.抗體形成細(xì)胞(Antibodyformingcell,AFC)周圍的SRBC與AFC產(chǎn)生的抗體結(jié)合而被致敏；3.加入豚鼠新鮮補(bǔ)體，致敏SRBC激活補(bǔ)體而溶解，在AFC周圍出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的溶血空斑；4.計(jì)算溶血空斑的數(shù)目。溶血空斑試驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)抗體產(chǎn)生B細(xì)胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色可在單細(xì)胞水平上檢測(cè)B產(chǎn)生抗體和T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子三、NK細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）NK細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)根據(jù)NK細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)：

CD分子的檢測(cè)：檢測(cè)CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

（二）NK細(xì)胞功能檢測(cè)形態(tài)學(xué)法酶釋法：LDH釋放法熒光法：時(shí)間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法：51Cr釋放法、125I-UdR釋放法流式細(xì)胞術(shù)：PI染色NK靶細(xì)胞檢測(cè)熒光強(qiáng)度、cpm等K562細(xì)胞為人NK細(xì)胞殺傷功能檢測(cè)的常用靶細(xì)胞第三節(jié)吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)一、中性粒細(xì)胞功能檢測(cè)趨化功能檢測(cè)：體內(nèi)法（也稱皮膚窗口法）體外法（濾膜滲透法/

Boyden小室法、瓊脂糖平板法）吞噬功能檢測(cè)：（吞噬金黃色葡萄球菌或白色念珠菌）殺傷功能檢測(cè)：

溶菌法、硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法--皮膚窗口法在受檢者前臂屈側(cè)中央3㎜范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時(shí)各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開(kāi)始時(shí)間、聚集程度等。健康正常人一般2～3小時(shí)后開(kāi)始聚集，達(dá)50～100個(gè)，6小時(shí)可達(dá)1000個(gè)以上。（一）中性粒細(xì)胞趨化功能檢測(cè)體外法--Boyden小室法Boyden小室體外法--瓊脂糖平板法原理及技術(shù)要點(diǎn)

在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對(duì)照液，溫育4～8小時(shí)后，用顯微鏡測(cè)微器測(cè)定中性粒細(xì)胞向左孔的移動(dòng)距離A和向右孔的移動(dòng)距離B，計(jì)算趨化指數(shù)。趨化指數(shù)越大運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)將細(xì)胞懸液與金黃色葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合，溫育后涂片、固定和染色。在油鏡下觀察中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬情況，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中吞噬和未吞噬細(xì)菌的中性粒細(xì)胞數(shù)，并記錄吞噬的細(xì)菌數(shù)。（二）中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)（三）中性粒細(xì)胞殺傷功能檢測(cè)硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)

方法：1.抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑（NBT），溫育25min；2.推片染色、鏡檢（含甲臜顆粒的中性粒細(xì)胞）。正常值：NBT陽(yáng)性細(xì)胞率應(yīng)7%~15%二、巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)炭粒廓清試驗(yàn)：主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)吞噬功能檢測(cè)：（吞噬雞紅細(xì)胞或白假絲酵母等）促凝血活性測(cè)定：正常小鼠肝中庫(kù)普弗細(xì)胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10％炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測(cè)定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（一）炭粒廓清試驗(yàn)（二）巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞或白假絲酵母＋孵育涂片染色鏡檢計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)小結(jié)Ficoll單次密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)和磁珠分離法進(jìn)行細(xì)胞分離和數(shù)量檢測(cè)；淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)：常用MTT法和3H-TdR摻入法；細(xì)胞功能檢測(cè)：T細(xì)胞（增殖、殺傷、胞內(nèi)細(xì)胞因子等），B細(xì)胞（增殖、分泌抗體能力），NK（殺傷），中性粒細(xì)胞（趨化、吞噬、殺傷），巨噬細(xì)胞（吞噬功能--炭粒廓清、雞紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)）知識(shí)目標(biāo)1.掌握：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及其亞群的分離純化；T細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志和功能檢測(cè)方法；B細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理；NK細(xì)胞的表面標(biāo)志。2.熟悉：NK細(xì)胞功能的檢測(cè)方法和原理。3.了解：中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理。能力目標(biāo)掌握密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細(xì)胞及其亞群的操作方法。思政-素質(zhì)目標(biāo)責(zé)任心、質(zhì)控、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維教學(xué)目標(biāo)目錄免疫細(xì)胞的分離與純化一淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)二吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)三免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等。通過(guò)分離、純化免疫細(xì)胞及其亞群，并對(duì)其數(shù)量和功能測(cè)定，可以判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)，對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐和科學(xué)研究具有重要意義。前言免疫細(xì)胞的分離方法很多，主要根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志、理化性狀和細(xì)胞功能等特征。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、所分離的目的細(xì)胞群種類、數(shù)量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應(yīng)力求操作簡(jiǎn)便、盡量保持細(xì)胞活性兼顧細(xì)胞純度和獲得率。免疫細(xì)胞的分離與純化一一、白細(xì)胞的分離（一）自然沉降法加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結(jié)果示意圖（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結(jié)果與自然沉降法類似優(yōu)點(diǎn)：速度快、得率高不足：白細(xì)胞黏性增加二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。PBMC是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的細(xì)胞群PBMC也是T、B細(xì)胞分離純化的細(xì)胞來(lái)源。細(xì)胞種類密度紅細(xì)胞1.093白細(xì)胞1.092淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各類血細(xì)胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。（一）

Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過(guò)25℃影響細(xì)胞得率（二）

Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結(jié)果示意圖三、淋巴細(xì)胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細(xì)胞懸液成分仍然較為復(fù)雜、均一性不佳。通常需要進(jìn)一步分離純化淋巴細(xì)胞及其亞群。分離原理主要基于細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等性質(zhì)。淋巴細(xì)胞及其亞類的分離純化是免疫學(xué)檢驗(yàn)與研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)。（一）淋巴細(xì)胞的純化去除紅細(xì)胞：低滲裂解法、氯化銨裂解法。去除血小板：多次洗滌離心法、胎牛血清梯度離心法。去除單核細(xì)胞：黏附法、羧基鐵吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴細(xì)胞的分離E花環(huán)沉降法該法簡(jiǎn)便易行，主要用于T細(xì)胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細(xì)胞并低滲裂解（二）淋巴細(xì)胞的分離尼龍棉分離法該法簡(jiǎn)單快速，可分離T細(xì)胞和B細(xì)胞PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時(shí)預(yù)熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫獲得T細(xì)胞冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細(xì)胞（二）淋巴細(xì)胞的分離免疫磁珠分離法（二）淋巴細(xì)胞的分離流式細(xì)胞術(shù)分離法該法快速、細(xì)胞純度和獲得率高，可分離各種淋巴細(xì)胞及其亞群。四、吞噬細(xì)胞的分離吞噬細(xì)胞包括兩類：一類是大吞噬細(xì)胞即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（包括血液中的單核細(xì)胞以及組織器官中的巨噬細(xì)胞）；另一類是小吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。分離原理：主要根據(jù)其表面標(biāo)志和生物學(xué)特性。（一）單核細(xì)胞的分離Percoll密度梯度分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法（常用方法）免疫磁珠分離法：分選CD14+細(xì)胞（常用方法）黏附法黏附法會(huì)影響單核細(xì)胞的功能，僅適用于去除單核細(xì)胞。（二）巨噬細(xì)胞的分離斑蝥敷貼法：（用于分離人巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的濾紙?zhí)笤谇氨蹆?nèi)側(cè)皮膚，4~5小時(shí)后見(jiàn)皮膚局部充血，48小時(shí)后出現(xiàn)水泡，吸取滲出液（主要為巨噬細(xì)胞）、離心洗滌。腹腔滲出液分離法：（用于分離動(dòng)物巨噬細(xì)胞）

操作要點(diǎn)：少量液體石蠟注入動(dòng)物腹腔內(nèi)，3~4天后沖洗出腹腔滲出液（70%~80%為巨噬細(xì)胞）。（三）中性粒細(xì)胞的分離右旋糖酐沉降法：

操作要點(diǎn)：抗凝靜脈血與6%右旋糖酐溶液按比例混合，室溫條件垂直靜置一定時(shí)間后，紅細(xì)胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白細(xì)胞沉降速度慢位于上層，獲取上層細(xì)胞。知識(shí)目標(biāo)1.掌握：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及其亞群的分離純化；T細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志和功能檢測(cè)方法；B細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理；NK細(xì)胞的表面標(biāo)志。2.熟悉：NK細(xì)胞功能的檢測(cè)方法和原理。3.了解：中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理。能力目標(biāo)掌握密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細(xì)胞及其亞群的操作方法。思政-素質(zhì)目標(biāo)責(zé)任心、質(zhì)控、生物安全意識(shí)、臨床免疫學(xué)思維教學(xué)目標(biāo)目錄免疫細(xì)胞的分離與純化一淋巴細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)二吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)三許多疾病或生物及其他理化因素均可引起淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能變化。數(shù)量檢測(cè)：根據(jù)淋巴細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志。功能測(cè)定：包括體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。免疫細(xì)胞的分離與純化二一、T細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）T細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)根據(jù)T細(xì)胞表面CD分子檢測(cè)：（1）間接熒光免疫法（2）免疫組織化學(xué)法：①酶標(biāo)（ABC法、APAAP法）②金標(biāo)法（即IGSS法）間接熒光免疫法（二）T細(xì)胞功能檢測(cè)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)：形態(tài)學(xué)法、3H-TdR摻入法、MTT法CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：51Cr釋放法抗原特異性T細(xì)胞定量檢測(cè)：MHC-抗原肽四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)：流式細(xì)胞術(shù)體內(nèi)試驗(yàn)：結(jié)核菌素試驗(yàn)、PHA皮膚試驗(yàn)PBMCPHA5％CO2、

37℃培養(yǎng)72h細(xì)胞涂片染色顯微鏡檢查該法簡(jiǎn)便易行、容易在基層推廣，但主觀因素影響大。形態(tài)學(xué)法T細(xì)胞增殖試驗(yàn)未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（％）＝轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)的淋巴細(xì)胞總數(shù)X100％培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細(xì)胞抗凝全血分離液離心過(guò)濾測(cè)量放射性3H-TdR摻入法靈敏度高客觀性好原理：外周血T細(xì)胞

PHA發(fā)生增殖

MTT含藍(lán)色甲顆粒的T細(xì)胞

MTT

PHA有機(jī)溶劑測(cè)吸光度（A）值

計(jì)算SI判定細(xì)胞增殖結(jié)果(SI≧2具有意義)MTT法操作簡(jiǎn)便無(wú)放射污染51Cr釋放法淋巴細(xì)胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞破壞51Cr釋放測(cè)定γ射線CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)原理根據(jù)T細(xì)胞活化的雙識(shí)別原理，用生物工程技術(shù)將MHC分子在體外組裝，并結(jié)合抗原表位肽，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，結(jié)合流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞。TMHC-抗原肽四聚體技術(shù)MHC-肽四聚體技術(shù)淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理:用刺激劑體外激活淋巴細(xì)胞，用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑如莫能霉素阻止細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)方式被打亂，引起細(xì)胞因子向高爾基體積聚，用流式細(xì)胞儀測(cè)定淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子種類，確定Th1/Th2細(xì)胞的百分率。分泌的細(xì)胞因子ThlTh2

IL-2++-IFN-γ++-TNF-β++++IL-3+++GM-CSF+++TNF-α-++IL-4-++IL-5-++IL-6-++IL-10-++Thl和Th2分泌的細(xì)胞因子二、B細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）B細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)根據(jù)B細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)：（1）mIg的檢測(cè)：免疫熒光、免疫組化（2）

CD分子的檢測(cè)：檢測(cè)CD19、CD20、CD21、CD22、

CD29以及CD5等（3）小鼠紅細(xì)胞受體的檢測(cè)：花環(huán)試驗(yàn)（二）B細(xì)胞功能檢測(cè)B細(xì)胞增殖試驗(yàn)：3H-TdR摻入法、MTT法（刺激物：小鼠用LPS；人用SPA的金黃色葡萄球菌菌體或抗IgM抗體）B細(xì)胞抗體產(chǎn)生能力檢測(cè)：溶血空斑試驗(yàn)、ELISPOT經(jīng)典溶血空斑試驗(yàn)1.SRBC致敏的B細(xì)胞與SRBC在凝膠介質(zhì)中混勻；2.抗體形成細(xì)胞(Antibodyformingcell,AFC)周圍的SRBC與AFC產(chǎn)生的抗體結(jié)合而被致敏；3.加入豚鼠新鮮補(bǔ)體，致敏SRBC激活補(bǔ)體而溶解，在AFC周圍出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的溶血空斑；4.計(jì)算溶血空斑的數(shù)目。溶血空斑試驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)抗體產(chǎn)生B細(xì)胞抗原包被酶聯(lián)抗抗體凝膠底物顯色可在單細(xì)胞水平上檢測(cè)B產(chǎn)生抗體和T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子三、NK細(xì)胞數(shù)量及功能檢測(cè)（一）NK細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)根據(jù)NK細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)：

CD分子的檢測(cè)：檢測(cè)CD3、CD56、CD16等（CD3-CD56+CD16+）

（二）NK細(xì)胞功能檢測(cè)形態(tài)學(xué)法酶釋法：LDH釋放法熒光法：時(shí)間分辨熒光免疫分析法放射性核素釋放法：51Cr釋放法、125I-UdR釋放法流式細(xì)胞術(shù)：PI染色NK靶細(xì)胞檢測(cè)熒光強(qiáng)度、cpm等K562細(xì)胞為人NK細(xì)胞殺傷功能檢測(cè)的常用靶細(xì)胞知識(shí)目標(biāo)1.掌握：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及其亞群的分離純化；T細(xì)胞及其亞群的表面標(biāo)志和功能檢測(cè)方法；B細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理；NK細(xì)胞的表面標(biāo)志。2.熟悉：NK細(xì)胞功能的檢測(cè)方法和原理。3.了解：中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)方法和原理。能力目標(biāo)掌握密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞的操作流程；熟悉FCM和磁珠分離法分離淋巴細(xì)胞及其亞群的操作方法。思政-素質(zhì)目標(biāo)責(zé)任心、質(zhì)控、生物安全意識(shí)、臨床免疫