免疫原和抗血清的制備（免疫學檢驗課件）

免疫原的制備

抗原和抗體是免疫學檢測中的兩大基本因素，抗原的純化是制備特異性抗體的先決條件，制得的抗體又可用于抗原的純化和檢測。

前言免疫原的制備

免疫原（immunogen）就是抗原，是指能夠刺激機體產(chǎn)生抗體并能與之發(fā)生特異性反應的物質。眾多的抗原物質中絕少是單一組分的，所以必須從復雜的物質中提取出目的抗原成分，制成合格的免疫原。

一、細胞性免疫原的制備1.綿羊紅細胞抗原制備采集新鮮綿羊紅細胞注入無菌并帶有玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，充分搖動15分鐘后除去纖維蛋白，再以無菌生理鹽水洗滌3次，最后配成1×106/ml濃度的細胞懸液，即可應用。

2.細菌抗原的制備細菌抗原有菌體抗原和鞭毛抗原等，多選用典型菌株的液體或固體培養(yǎng)物經(jīng)集菌后處理。鞭毛抗原需用有動力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理，而菌體抗原則需要在100℃加溫2～2.5小時后應用。

蛋白質、酶、核酸、細菌毒素等皆為可溶性抗原，這些物質大多來源于人和動物的組織和細胞，要想獲得此類抗原，通常要先破碎組織和細胞，再進一步提取和純化。

二、可溶性抗原的制備及鑒定制備流程選材預處理細胞粉碎提取純化

鑒定冷藏保存

可溶性抗原包括蛋白質、脂多糖、核酸等，多來源于人和動物的組織或細胞，需先將組織或細胞破碎，再提取和純化，才能獲得所需的可溶性抗原。制備組織勻漿粉碎細胞蛋白質脂多糖核酸提取1.組織勻漿的制備

高速搗碎法或研磨法2.細胞破碎的方法

（1）反復凍融法（2）超聲波破碎法（3）溶菌酶處理法（4）表面活性劑處理法

3.可溶性抗原的提純

方法：

超速離心法，選擇性沉淀法，凝膠過濾，離子交換層析，親和層析，電泳法4.純化抗原的鑒定、濃縮與保存鑒定內(nèi)容：分子量、含量、純度和免疫活性。濃縮：吸收法、蒸發(fā)法與超濾法。保存：液態(tài)或干燥狀態(tài)低溫保存。

用化學合成法或基因重組法制備的抗原，稱之為人工抗原，包括人工結合抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。三、人工免疫原制備

半抗原不能直接做為免疫原，只有把這些半抗原和大分子物質結合后，才具有免疫原性。這種經(jīng)過人工修飾的半抗原稱之為人工結合抗原，用于偶聯(lián)半抗原的大分子物質稱為載體。

（一）人工結合抗原制備

半抗原是僅有抗原性而無免疫原性的物質。多肽、甾體激素、核苷、某些藥物等小分子物質均為半抗原。載體蛋白半抗原表位半抗原+載體（蛋白、合成載體）=完全抗原物理法或化學法（碳二亞胺法、戊二醛法）連接⑴蛋白質類

⑵多肽聚合物

⑶大分子聚合物人工結合免疫原的鑒定要鑒定人工結合免疫原的質量，必須要測定偶聯(lián)在載體上的半抗原量，一般要連接20個以上才具有免疫原性。常用的測定方法有吸收光譜分析法和核素標記半抗原滲入法。

用化學方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽，即人工合成抗原。

（二）人工合成抗原

將編碼免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并與適當載體DNA分子相結合，然后引入受體細胞中（如大腸桿菌或酵母菌）使之表達，能獲得免疫原性之融合蛋白，經(jīng)純化后可作為抗原，即基因工程抗原。

（三）基因工程抗原四、免疫佐劑

免疫佐劑（immunoadjuvant）是先于抗原或與抗原一起注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型的物質。免疫佐劑簡稱佐劑（adjuvant），為一類非特異性的免疫增強劑。免疫佐劑可以是無免疫原性也可以是有免疫原性的。

在進行動物免疫時最常用的佐劑是福氏（Freund）佐劑，根據(jù)有無卡介苗又可分為福氏不完全佐劑和福氏完全佐劑。福氏不完全佐劑是由油劑和乳化劑制成，在福氏不完全佐劑中加入卡介苗就成了福氏完全佐劑。

（一）佐劑的種類

福氏佐劑和抗原的比例為1:1。由于福氏佐劑是油劑，加入抗原后要充分混合成乳劑。

混合方法：研磨法攪拌注射器混合法注射器混合法1.改變抗原的物理性狀，延長抗原在體內(nèi)的存留時間，從而有效地刺激免疫系統(tǒng)；2.刺激單核-吞噬細胞系統(tǒng)，增強其抗原提呈能力；3.可加強淋巴細胞的增殖分化，促進其對抗原的處理能力。

（二）佐劑的作用機制

免疫血清的制備

抗原和抗體是免疫學檢測中的兩大基本因素，抗原的純化是制備特異性抗體的先決條件，制得的抗體又可用于抗原的純化和檢測。

前言

抗血清的制備

抗血清（亦稱免疫血清）用抗原以不同途徑免疫動物，從動物血清中獲取抗體，該類含有抗體的血清稱為抗血清。由于免疫動物的抗原往往具有多種抗原表位，可激活體內(nèi)多個B細胞克隆產(chǎn)生針對抗原多種表位的混合抗體，因而抗血清也稱為多克隆抗體（polyclonalantibody，PcAb）。多價抗原多個B細胞克?。ㄖ旅舻腂細胞）多克隆抗體抗血清的制備流程免疫動物選擇免疫方案制定動物采血抗血清分離純化及鑒定

抗血清的保存

一、免疫動物選擇

1.動物種系抗原與免疫動物種屬差異越大，免疫效果越好。2.個體個體必須適齡、健壯、無感染性疾病，體重符合要求。

3.抗原的性質

蛋白質類抗原對多數(shù)動物皆適合，常選用家兔和山羊。

4.抗血清的要求

R（rabbit）型及H（horse）型，R型等價帶較寬，適用于診斷試劑；H型等價帶較窄，一般用作免疫治療。動物種類的選擇時應考慮以下因素

二、方案制定

1.免疫原的劑量

一定范圍內(nèi)，免疫原的用量越大，免疫反應越強，產(chǎn)生的抗體效價越高。

2.免疫途徑皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、脾臟、淋巴結。初次常用皮內(nèi)，再次常用靜脈。

3.免疫時間間隔一般間隔10～20d為佳。兩次，以后的每次間隔一般為7～10d。次序日序（天）注射途徑注射劑量（ml）抗原11多點皮內(nèi)1.0沙門菌O抗原26靜脈0.5沙門菌O抗原311靜脈0.5沙門菌O抗原416靜脈1.0沙門菌O抗原519靜脈2.0沙門菌O抗原傷寒沙門菌O抗原免疫家兔的方案三、動物采血法

動物免疫3～5次后，可取少量血清檢測抗體效價與特異性，測試合格后，應在末次免疫后5～7d及時采血分離血清。1．頸動脈放血法最常用的方法，家兔、綿羊、山羊等可采用。2．心臟采血法此法多用于豚鼠、大鼠等小動物，技術要求高。3．靜脈采血法可多次進行，所以可收集到的血液量較多。家兔用耳中央靜脈；綿羊和山羊用頸靜脈。四、抗血清的分離純化及鑒定采集的血液多采用在室溫自然凝固，37℃或4℃待凝塊收縮后分離血清。前者迅速，但獲得血清較少；后者時間長，但獲得血清多，而且效價穩(wěn)定。（一）抗血清的分離1.特異性抗體的純化（單價特異性是指抗血清只與其特異性抗原發(fā)生反應。）

①親和層析法

②吸附劑方法2.IgG類抗體的純化

①鹽析

②凝膠過濾

③離子交換和親和層析法（二）抗血清的純化（三）抗血清的鑒定1.抗體效價的鑒定

一般原則是顆粒性抗原用凝集試驗，可溶性抗原用雙向瓊脂擴散試驗。

2.抗體特異性的鑒定

常用雙向免疫擴散法進行鑒定。

3.抗體純度的鑒定

可采用免疫電泳、雙向瓊脂擴散試驗、SDS等方法鑒定。4.抗體親和力的鑒定

常用ELISA、RIA和平衡透析法等進行測定。

五、抗血清的保存1.4℃保存：保存3～6個月2.-20℃～-40℃保存：保存3～5年3.冷凍真空干燥保存

：長期保存多價抗原多個B細胞克?。ㄖ旅舻腂細胞）多克隆抗體

多克隆抗體

單克隆抗體

單克隆抗體(mo