PCR擴(kuò)增uidA、rfbE和fliCH7基因檢測(cè)大腸桿菌-O157-H7特異性和靈敏性的比較

PCR擴(kuò)增uidA、rfbE和fliCH7基因檢測(cè)大腸桿菌O157:H7

特異性和靈敏性的比較

湖北檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心趙暉zhaohui@論文撰寫背景：本論文的研究?jī)?nèi)容是在澳大利亞伊麗莎白－麥克阿瑟農(nóng)業(yè)研究所訪問(wèn)研究期間所做實(shí)驗(yàn)的一部分。國(guó)外一直很重視對(duì)O157:H7的研究工作，完成論文時(shí)，剛好FDA公布了O157:H7的暴發(fā)事件。這篇論文是專門為這次征文活動(dòng)而寫的，希望能完善和建立最適合檢驗(yàn)檢疫運(yùn)用的O157:H7快速檢驗(yàn)方法。簡(jiǎn)介本文中采用的是普通PCR檢測(cè)方法，因?yàn)槟壳捌胀≒CR已經(jīng)是一種簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的方法，在國(guó)外被廣泛采用，趨于成熟和穩(wěn)定，我們將這種方法用于日常檢測(cè)應(yīng)該是可行的。本文所用的3種檢測(cè)目的基因和4種致病基因是從眾多的文獻(xiàn)中篩選出來(lái)的。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增uidA、rfbE和fliCH7基因檢測(cè)大腸桿菌O157:H7特異性和靈敏性的比較，以選擇一種用于樣品中O157:H7檢測(cè)的最佳方法。實(shí)驗(yàn)方法

用單一PCR方法分別擴(kuò)增uidA、rfbE和fliCH7基因檢測(cè)O157:H7和非O157:H7菌株31株，比較檢測(cè)的特異性。用純化的O157:H7基因組DNA以及從1.7×107

～1.7個(gè)O157:H7細(xì)菌中提取的DNA為模板這兩種方法比較分別擴(kuò)增三種基因檢測(cè)的靈敏度。菌株本試驗(yàn)所用菌株均為澳大利亞伊麗莎白－麥克阿瑟農(nóng)業(yè)研究所(ElizabethMacarthurAgriculturalInstitute)免疫微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌株(表1)，所有大腸桿菌血清型均經(jīng)墨爾本大學(xué)微生物系鑒定。試驗(yàn)菌株分別接種于Luria-Bertani(LB)肉湯中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（12～16h）。細(xì)菌DNA模板制備

快速加熱法：用InstaGeneMatrix試劑盒(BIO-RAD,澳大利亞)制備DNA模板。

純化的DNA模板：用Promega

的DNA純化試劑盒（Promega,澳大利亞）制備純化DNA。試驗(yàn)用引物目的基因引物序列產(chǎn)物大小(bp)參考文獻(xiàn)uidA5'-GCGAAAACTGTGGAATTGGG-3'252Cebula等[4]5'-TGATGCTCCATAACTTCCTG-3'rfbE5'-TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA-3'159Sharma等[5]5'-CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA-3'FliCH75'-GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC-3'625Gannon等[6]5'-CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC-3'PCR反應(yīng)

擴(kuò)增rfbE和fliCH7基因的反應(yīng)程序.擴(kuò)增uidA基因的反應(yīng)程序.致病基因的檢測(cè)

所有大腸桿菌菌株均采用AdrienneW.Paton

和JamesC.Paton的多重PCR方法檢測(cè)4種大腸桿菌致病基因：stx1、stx2、eaeA和ehxA[3]。

PCR檢測(cè)的特異性

以包括O157:H7等血清型的18株大腸桿菌和13株非大腸桿菌的DNA為模板（快速加熱法制備），以PCR方法分別擴(kuò)增uidA、rfbE和fliCH7基因用于PCR特異性檢測(cè)。PCR檢測(cè)的靈敏度

采用兩種方法測(cè)定（1）用純化的O157:H7的DNA為模板。（2）用快速加熱法分別提取梯度稀釋的O157:H7菌懸液的DNA作為模板，同時(shí)對(duì)每個(gè)稀釋梯度中的O157:H7進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性的比較結(jié)果：所有大腸桿菌O157菌株擴(kuò)增出了rfbE基因；O157:H7、H－、H1、HN、O75:H7和H－都擴(kuò)增出了fliCH7基因；O157:H7、H－、H1和HN均擴(kuò)增出uidA基因；其他菌株都沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。靈敏度的比較結(jié)果：（1）擴(kuò)增三種基因的檢測(cè)靈敏度均為10pg純化基因組DNA，（2）擴(kuò)增uidA和rfbE基因，PCR檢測(cè)的靈敏度均為1.7×102個(gè)細(xì)菌；擴(kuò)增fliCH7基因，PCR檢測(cè)的靈敏度為1.7×101個(gè)細(xì)菌。菌株名稱血清型來(lái)源攜帶的致病基因目的基因擴(kuò)增結(jié)果stx1stx2eaeA

ehxAuidA

rfbEfliCH7大腸桿菌O157:H7腹瀉病人+++＋+++O157:H7腹瀉病人+++＋+++O157:H-腹瀉病人+++++++O157:H-腹瀉病人+++++++O157:HNb腹瀉病人+++++++O157:H1腹瀉病人+++++++O157:K88腹瀉病豬－－－－－+－O75:H7腹瀉病人－－－－－－+O75:H-腹瀉病人－－－－－－+O111:H-腹瀉病人＋＋＋＋－－－O111:H8腹瀉病人++++－－－O26:H11腹瀉病人＋－＋＋－－－O113:H2腹瀉病人－＋－＋－－－EcoR60O4:HN腹瀉病人－－－－－－－DH5

NTc－－－－－－－O141:K85ac:H-腹瀉病豬－＋－－－－－O138:K81:HN腹瀉病豬－－－－－－－O149:K88腹瀉病豬－－－－－－－非大腸桿菌a－－－－－－－表1特異性試驗(yàn)菌株及其攜帶的致病基因以及目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

討論針對(duì)O157:H7的rfbE基因設(shè)計(jì)的引物均有很高的特異性。fliCH7基因?qū)z測(cè)O157:H7有輔助鑒定作用，但在直接對(duì)樣品進(jìn)行快速檢測(cè)時(shí)，用rfbE和fliCH7基因同時(shí)檢測(cè)O157:H7似乎沒(méi)有意義，此方法更適用于已經(jīng)分離純化菌株的鑒定。多種大腸桿菌均攜帶4種致病基因，因此用致病基因作為目的基因的多重PCR檢測(cè)方法只適用于純化菌株的致病分析，而將它們直接用于對(duì)樣品的檢測(cè)是不可靠的。討論一般待測(cè)樣品中的菌相復(fù)雜，同時(shí)存在多種細(xì)菌，用多重PCR直接對(duì)樣品中的O157:H7進(jìn)行檢測(cè)鑒定，容易出現(xiàn)不正確的結(jié)果。按常規(guī)檢測(cè)O157:H7的方法，O157:H－就會(huì)漏檢，用PCR方法結(jié)合血清學(xué)和生化鑒定方法將可以解決這些問(wèn)題。用PCR擴(kuò)增uidA、rfbE和fliCH7基因檢測(cè)O157:H7，都必須結(jié)合血清學(xué)等鑒定方法才能區(qū)別H7、H－、H1和