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文檔簡介
生物學(xué)基本技能基本技能
Ⅻ生物人工雜交CONTENTS目
錄01Part01實驗?zāi)康?3Part03植物人工雜交技術(shù)02Part02雜交相關(guān)術(shù)語04Part04動物人工雜交技術(shù)05Part05微生物人工雜交技術(shù)06Part06實驗操作實訓(xùn)1.了解各種生物人工雜交技術(shù)的基本原理和操作流程。2.掌握動物、植物和微生物的人工雜交技術(shù)。一、實驗?zāi)康碾s交技術(shù)是遺傳分析和遺傳育種常用的最基本的實驗方法,通過雜交可以獲得雜種或新的種質(zhì)資源,繼而選擇培育出新品種。根據(jù)雜種產(chǎn)生的方式,雜交技術(shù)可分為自然雜交和人工雜交。自然雜交亦稱為“天然雜交”,是遺傳基礎(chǔ)不同的親本在自然狀態(tài)下的交配,產(chǎn)生的雜種具有雙親遺傳性或超親本性狀,易于定向培育,是常規(guī)育種的重要原始材料。人工雜交是指在人工控制的條件下,按照預(yù)定的目標(biāo)、計劃,遵循一定的程序,采用一定的方法,使遺傳性不同的親本進(jìn)行交配或結(jié)合,產(chǎn)生的雜種具有雙親遺傳性或超親本性狀。一般情況下,雜交都要經(jīng)過個體間的接觸即交配,這種雜交稱為有性雜交;如果沒有交配的過程,則稱為無性雜交。把體細(xì)胞相互融合的過程稱為體細(xì)胞雜交。雜交可以發(fā)生在不同的水平上,有個體水平上的雜交、細(xì)胞水平上的雜交和分子水平上的雜交。按生物的種類又可分為植物雜交、動物雜交、微生物雜交、噬菌體雜交等。二、雜交相關(guān)術(shù)語植物有性雜交是利用遺傳性狀不同的親本進(jìn)行交配,以組合兩個或多個親本的優(yōu)良性狀于雜種體中,并經(jīng)過基因的分離和重組,產(chǎn)生各種性狀的變異類型,從中選出需要的基因型,進(jìn)而創(chuàng)造出對人類有利的優(yōu)良品種。(一)水稻雜交技術(shù)1)調(diào)節(jié)開花期。水稻母本和父本花期的調(diào)整,可用分期播種的方法,使二者的花期相遇。2)選株。選株主要指選擇母本植株。要選擇具有本品種典型性狀、生長健壯和沒有病蟲害的植株作母本。3)選穗。用鑷子輕輕撬開稻穗中部的小穗,若中部的小穗在當(dāng)天或次日能夠開花,則雌稻穗可以作為母本。當(dāng)天能夠開花的標(biāo)志是花絲已經(jīng)伸長,花藥即將頂?shù)絻?nèi)稃上端;次日開花的標(biāo)志是雄蕊的長度已達(dá)內(nèi)稃長度的2/3??梢詫⑿∷雽χ栍^看,從外表能隱約看到雄蕊在花里的位置。4)整穗。先用剪刀剪去母本稻穗上部和下部枝梗上的小穗,留下中部枝梗上的20~30個小穗,其他小穗統(tǒng)統(tǒng)剪去。三、植物人工雜交技術(shù)(一)水稻雜交技術(shù)5)去雄(1)常規(guī)去雄法:常規(guī)去雄法包括溫水殺雄、剪穎去雄、化學(xué)殺雄等,水稻育種多采用前兩種方法。溫水殺雄去雄較徹底,但操作不便、效率低,不能滿足高效育種工作的需要。剪穎去雄是水稻育種應(yīng)用最多的方法,操作簡便、實用,但將一朵穎花中的花藥完全剪去的同時,很容易傷及雌蕊柱頭。一般情況下雌蕊柱頭在穎殼中低于雄蕊花藥,但很多水稻品種也存在柱頭與花藥齊平或者微低的情況,常規(guī)剪穎去雄難以保證不傷及柱頭,容易導(dǎo)致柱頭被傷,雜交失敗。(2)改良的剪穎去雄法:將水稻穎殼中的雄蕊花藥完全剪去改為剪去一半或更少,即要將花藥剪破,然后馬上向剪雄后的穎殼內(nèi)澆水,將花藥打濕。由于雄蕊被打濕,濕度增加,花絲很快就會伸長,干癟的花藥伸出穎殼,此時用手指輕彈幾下,干癟的花藥就會被彈掉,然后套上紙袋,等待授粉。此剪穎法,傷及雌蕊柱頭的可能性大大降低,從而大大提高了雜交的成功率。為提高工作效率,可在授粉的前一天下午等花完全開過后剪穎澆水,然后第二天上午開花之前套袋。三、植物人工雜交技術(shù)(一)水稻雜交技術(shù)6)套袋掛牌。不管是采用哪一種方法去雄,去雄后都要及時在母本的稻穗上套上白色硫酸紙制作的袋子,以防發(fā)生自然雜交,并在母本稻穗下方掛上特制的小紙牌,用鉛筆在小紙牌上注明母本名稱、去雄日期、操作者姓名等內(nèi)容。7)采粉和授粉。去雄的母本稻穗應(yīng)在當(dāng)天或次日進(jìn)行人工授粉。(1)常規(guī)授粉:打開母本稻穗上的袋子,利用盛花期的父本稻穗在剪穎的母穗上抖動,使花粉掉落在母穗花的柱頭上,從而達(dá)到授粉的目的。通常情況下,此法很實用,但在大風(fēng)等惡劣天氣下,此法效果并不好。因為盛花期的父本穗經(jīng)大風(fēng)一吹,所剩的花粉已很少,在人工取穗時碰撞又使花粉散落,花粉所剩無幾,雜交成功率大打折扣。(2)新技術(shù)授粉:在父本穗盛花期來到之前(少數(shù)穎殼開始開花),將父本穗剪下,剪去已開過花的穗子,將剩下的穗用水打濕,然后甩干放入套紙袋的母穗上,將紙袋口封住,等父本穗大量開花時,抖動父本穗,父本穗上的花粉就不會有任何損失。將父本穗事先都剪好放入母穗中,等開花時逐一授粉,大大提高了工作效率和雜交成功率。三、植物人工雜交技術(shù)(一)水稻雜交技術(shù)8)檢查。花粉被授到柱頭以后,經(jīng)過2~3min就可萌發(fā)形成花粉管,30min后花粉管進(jìn)入胚囊,受精過程在開花后1.5~4h內(nèi)完成。授粉10天以后,摘去雜交穗上的紙袋,如果授粉小花內(nèi)的子房已經(jīng)膨大,表示已經(jīng)受精,說明雜交成功。為了使雜交種子正常進(jìn)行生長發(fā)育,可暫時不套紙袋,待籽粒長大時再套紙袋,以防鳥類啄食。9)收獲。雜交籽粒成熟后,將每個雜交稻穗單獨脫粒、保存,供來年播種觀察。三、植物人工雜交技術(shù)(二)小麥雜交技術(shù)1)確定組合、種植親本。根據(jù)育種目標(biāo),確定雜交組合。根據(jù)雙親生育期調(diào)整播期,晚熟的早播,早熟的遲播或分2~3期播種,每期相隔10~15天,以確?;ㄆ谙嘤觥?)選穗。根據(jù)雜交組合,在母本種植區(qū)內(nèi),選擇具有該親本典型性狀且健壯無病蟲害的植株作為雜交母本株,選取抽穗但未開花、中部小穗的花藥呈黃綠色的麥穗作為雜交母穗。3)整穗。用剪刀剪去上下部發(fā)育不良或過嫩的小穗,有芒品種剪去芒,每穗留中部小穗8~10個;用鑷子夾去小穗上部的小花,每小穗只保留基部外側(cè)兩朵小花供去雄。4)去雄。從穗的一側(cè)上部小穗開始順序而下,用剪刀剪去小花上部1/3左右的穎殼,用鑷子輕輕取出每朵小花中的3枚花藥。如花藥破裂或傷及柱頭,則將該小花除去,并將鑷子浸入乙醇以殺死所沾花粉。三、植物人工雜交技術(shù)(二)小麥雜交技術(shù)5)套袋。將麥穗上全部小花去雄后,立即套上透明硫酸紙袋,并將其下端斜折,用大頭針別好。在麥穗和劍葉葉鞘間掛上小紙牌,注明母本名稱、去雄日期和操作者姓名等,并在工作簿上逐一記錄。6)授粉。在去雄后第2~3天內(nèi)授粉,通常在上午開花盛期進(jìn)行,陰雨天可略推遲。普通授粉法;捻穗授粉法。授粉后在小紙牌上注明父本名稱和授粉日期,并在工作簿上逐一記錄。7)收獲。待種子成熟后,及時按雜交組合將雜交穗收回,曬干脫粒,調(diào)查結(jié)實率,并按雜交組合或代號進(jìn)行登記、編號,以備下季種植。三、植物人工雜交技術(shù)(三)棉花雜交技術(shù)1)母本選株和定蕾。在棉花開花的前一天16:00以后,在擬定組合的母本行中選擇具有母本典型性狀的生長健壯、無病優(yōu)良的植株。第二天早晨必開的花的外觀是:花冠呈螺旋形折疊,但花瓣已經(jīng)長大露出苞葉。2)去雄。授粉前一天下午,先檢查和摘除田間已自花授過粉的棉鈴,再對第二天將要開放的花朵實施剪雄去雄。用剪刀在花萼基部或花冠兩側(cè)剪開一條縫,然后把縫撥開,使雄蕊和雌蕊露出(也可剪去一部分花冠),再用剪刀或鑷子除去花藥。3)父本隔離。在母本去雄的同時,選父本植株上次日可以開花的花蕾,用線或回形針或麥管隔離,注意用線扎花冠頂端時不要太松,以免次日花冠上張開的小孔讓昆蟲進(jìn)入,使父本花粉混雜;也不要過緊,以免扎破花冠和扎住柱頭。三、植物人工雜交技術(shù)(三)棉花雜交技術(shù)4)授粉。在去雄后第2~3天內(nèi)授粉,棉花絕大部分花在天氣晴朗的上午8時左右開放。當(dāng)露水退后,即可在父本行中采集花粉或摘花,給母本的花授粉。采集花粉,可用毛筆蘸取花粉涂抹在不育花的柱頭上。如果摘下父本的花,可直接在母本的柱頭上涂抹。5)掛牌。授粉后在塑料牌上寫明組合名稱或代號、授粉日期和操作者姓名,掛在鈴柄上。6)檢查受精情況。授粉3~4天后,若子房膨大,柱頭失去光澤說明雜交成功。7)管理收獲和保存。對雜交株要注意摘老葉、整枝、摘去亮度心和果枝上多余的花蕾,改善通風(fēng)透光條件,注意防治病蟲,以提高結(jié)鈴率和雜交種子數(shù)。吐絮后及時將雜交鈴連同塑料牌一起收摘,放入種子袋中,曬干后可按組合剝出棉籽,妥善保存,以供下季種植。三、植物人工雜交技術(shù)(三)棉花雜交技術(shù)三、植物人工雜交技術(shù)(四)玉米雜交技術(shù)1)調(diào)節(jié)開花期。由于玉米是單性花,在調(diào)節(jié)開花期方面,必須使母本的雌穗和父本的雄穗的花期一致。可用分期播種的方法調(diào)節(jié)父、母本的花期。2)選株。父、母本均應(yīng)選擇生長健壯、無病蟲害和具有本品種典型性狀的植株,作為雜交對象。3)套袋隔離。當(dāng)母本植株的雌穗已經(jīng)露出而沒有伸出柱頭以前,用牛皮紙袋套好雌穗。當(dāng)母本雌穗開始抽出柱頭時,要在當(dāng)天用牛皮紙袋套在父本植株的雄穗上。雌、雄穗的紙袋,要用細(xì)繩或回形針扎緊,以免脫落。4)采粉。根據(jù)玉米的開花習(xí)性,其雄穗在始花后的第2~4天內(nèi)開花最多,進(jìn)入盛花期;一天中開花最多的時間是上午8~10時,而此時花粉的生活力也最強。雌穗在始花后的第2~4天處于盛花期,柱頭已基本抽齊。采集花粉時,將父本雄穗稍稍下彎,輕輕抖動,用人工輔助授粉器(用光滑的厚紙制成1個圓錐形的紙筒,用厚紙作紙蓋蓋住下口。三、植物人工雜交技術(shù)(四)玉米雜交技術(shù)5)授粉。授粉時,先取下雌穗上的紙袋,立即用人工輔助授粉器的下口對準(zhǔn)雌穗的柱頭,輕輕抖動授粉器,使花粉落在柱頭上。授粉后,仍用原來的紙袋將雌穗套好,但應(yīng)在袋頂和穗頂之間留出一定距離,以防止因果穗伸長而頂破紙袋。6)掛牌。紙袋套好后,應(yīng)在雌穗基部拴上紙牌(或塑料牌),寫明雜交組合、授粉日期和操作者姓名等內(nèi)容。7)收獲。母本果穗成熟后,應(yīng)連同紙牌(或塑料牌)一起收獲,并單獨保存,供來年播種以檢驗雜交是否成功。三、植物人工雜交技術(shù)(一)果蠅雜交技術(shù)1)果蠅培養(yǎng)(1)培養(yǎng)基制備:酵母菌是果蠅幼蟲和成蟲的主要食物,凡是能發(fā)酵的物質(zhì)都可成為果蠅的培養(yǎng)基。早年果蠅研究者用香蕉搗成泥糊做成培養(yǎng)基,現(xiàn)在實驗室多用玉米粉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)果蠅。果蠅培養(yǎng)基的配制方法很多,以配制1000mL為例說明配制的過程。培養(yǎng)基成分如下:四、動物人工雜交技術(shù)(一)果蠅雜交技術(shù)1)果蠅培養(yǎng)(2)果蠅培養(yǎng):溫度對果蠅的生長發(fā)育影響很大。20~25℃是果蠅的最適生長溫度;30℃以上高溫能致果蠅死亡;在20℃以下時可使果蠅的生活周期延長;低于10℃時則影響果蠅的生活力和繁殖力??梢岳眠@一特點來調(diào)節(jié)果蠅生長的速度,控制其群體的大小。如原種的培養(yǎng)旨在保種,可先將果蠅在22℃條件下培養(yǎng)一周,當(dāng)幼蟲出來后可將溫度調(diào)至18℃左右培養(yǎng);雜交實驗時需要較大的群體,可將培養(yǎng)溫度設(shè)為23℃左右。雜交時還可根據(jù)實驗的時間安排隨時調(diào)整果蠅的培養(yǎng)溫度。2)果蠅處理技術(shù)(1)雌雄鑒別:利用果蠅做雜交實驗時,必須準(zhǔn)確地識別性別。雌雄成蠅的區(qū)別表現(xiàn)在多個方面,可用放大鏡、顯微鏡(低倍)、解剖鏡或直接從外形上加以辨認(rèn)。四、動物人工雜交技術(shù)(一)果蠅雜交技術(shù)2)果蠅處理技術(shù)雌雄果蠅的主要區(qū)別如下:四、動物人工雜交技術(shù)(一)果蠅雜交技術(shù)2)果蠅處理技術(shù)(2)果蠅的麻醉及觀察:無論是進(jìn)行果蠅性狀觀察還是進(jìn)行果蠅雜交實驗分析,都必須先將果蠅麻醉使其處于靜止?fàn)顟B(tài)后方可進(jìn)行。首先,在一軟木塞上釘一圖釘,在圖釘上纏上脫脂棉,將此軟木塞蓋在一250mL的廣口瓶上,做成麻醉瓶。將一培養(yǎng)皿的底部粘一條濾紙,做成麻醉用的麻醉皿。其次,麻醉時,準(zhǔn)備好培養(yǎng)瓶、麻醉瓶和乙醚。輕拍瓶壁,讓果蠅震落到培養(yǎng)基上。如瓶塞上附著果蠅,則稍稍晃動瓶塞,并將它們拍落到培養(yǎng)基上。拔去麻醉瓶塞與培養(yǎng)瓶塞,迅速將培養(yǎng)瓶口倒扣在麻醉瓶口上。輕拍培養(yǎng)瓶讓果蠅落入麻醉瓶中(如果培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基已很稀松,則切勿倒扣,應(yīng)將麻醉瓶扣在培養(yǎng)瓶上,果蠅具有趨光性和向上性,會主動向上向有光的方向爬)。最后,把麻醉瓶中的果蠅拍落瓶底,拔出瓶塞,在塞子上滴幾滴乙醚,重新塞上麻醉瓶。麻醉約1min后果蠅便不再活動,紛紛落入瓶底,此時果蠅的翅膀呈收緊狀態(tài)。長時間麻醉、乙醚用量過多時會使果蠅死亡。四、動物人工雜交技術(shù)(一)果蠅雜交技術(shù)3)雜交操作(1)選處女蠅:將培養(yǎng)瓶內(nèi)的成蠅全部除去,12h內(nèi)培養(yǎng)瓶中將重新孵化出許多果蠅。將新孵化出來的果蠅引入麻醉瓶麻醉,根據(jù)雌雄果蠅的特征將12h內(nèi)重新孵化出的雌雄果蠅分開,即可得到處女蠅。(2)雜交:將選出的突變型處女蠅轉(zhuǎn)入雜交瓶中(內(nèi)有新配制的培養(yǎng)基)。同時麻醉選取野生型雄蠅8~10只,放入同一個雜交瓶中。在雜交瓶上貼上標(biāo)簽,注明雜交組合、雜交日期和操作者姓名等。在25℃條件下或室溫下進(jìn)行培養(yǎng)。(3)培養(yǎng):25℃條件下或室溫下培養(yǎng)7~8天后,除去親本蠅。(4)觀察F1代:11~13天后,F(xiàn)1代羽化為成蠅。(5)觀察F2代:從觀察統(tǒng)計的F1代成蠅中,各選雌雄果蠅8~10只,轉(zhuǎn)入自交瓶中,在自交瓶上貼上標(biāo)簽,注明自交日期、操作者姓名等。在25℃條件下或室溫下進(jìn)行培養(yǎng)。12天后,F(xiàn)2代羽化為成蠅,將其麻醉后于白瓷磚上用放大鏡觀察,或用解剖鏡、顯微鏡觀察各種表現(xiàn)型的果蠅。四、動物人工雜交技術(shù)(二)小鼠雜交技術(shù)1)小鼠操作方法(1)性別鑒別:成年鼠性別很容易區(qū)分,雄鼠的陰囊明顯;雌鼠可見陰道開口和五對乳頭。幼鼠或仔鼠則主要從外生殖器與肛門的距離判定,近者為雌,遠(yuǎn)者為雄。另外,雌鼠肛門和生殖器之間有一無毛小溝,而雄鼠則在肛門和生殖器之間長毛。再者,雌鼠比雄鼠明顯多很多的乳頭。(2)小鼠固定操作技術(shù):絕大多數(shù)品系的小鼠經(jīng)過長期的馴養(yǎng)和人為的挑選,性格都是很溫馴的,除了受到攻擊以外都不會咬人。小鼠實驗過程中,操作要平穩(wěn)快速,如果在操作中發(fā)現(xiàn)小鼠變得焦躁不安,應(yīng)停止對小鼠的動作,等其平靜下來后再重新開始操作。
抓頸部的動作好壞是固定小鼠的關(guān)鍵,要將小鼠固定好須用手抓住小鼠頸部背后的所有疏松的皮。四、動物人工雜交技術(shù)(二)小鼠雜交技術(shù)2)雜交繁育技術(shù)不同品系、不同種群有不同的繁殖方法,適宜的繁殖方法是保證小鼠質(zhì)量的前提。(1)種鼠:種鼠可由外單位引入,也可由本單位自己保種。引種的小鼠必須遺傳背景明確,來源清楚,有完整的資料,包括種群名稱、來源、遺傳基因特點及主要生物學(xué)特性等。進(jìn)入生產(chǎn)的種鼠要經(jīng)過挑選,也就是選種。選種在小鼠離乳時進(jìn)行初選,種鼠應(yīng)符合該品系的遺傳學(xué)特征,無變異。雙親體質(zhì)健康無疾病,活力強。初選時按健康標(biāo)準(zhǔn)一般選留2~5胎的仔鼠,適當(dāng)延長哺乳期到23天,然后雌雄分開,同時做好記錄。(2)雜交繁育方法:將種鼠按事先定的配種方案置于繁殖盒中,建立雜交繁育卡。雜交配種方案因小鼠的種類品系不同而不同。廣義的雜交繁育(如大群生產(chǎn))有兩種方法:長期同居法、定期同居法。四、動物人工雜交技術(shù)(二)小鼠雜交技術(shù)3)不同類型鼠群的繁育(1)近交系的維持和生產(chǎn):繁殖用原種小鼠必須遺傳背景明確,來源清楚,有完整的譜系資料,包括品系名稱、近交代數(shù)、遺傳基因特點及主要生物學(xué)特征等。引種小鼠應(yīng)來自近交系的基礎(chǔ)群,以2~5對同窩個體為宜。小鼠近交系一旦育成,應(yīng)按保種的有關(guān)規(guī)定,維持其特定的生物學(xué)特征的穩(wěn)定,保持其基因同一性和基因純合性。近交系小鼠的維持和生產(chǎn)包括4個群。生產(chǎn)過程一般是從基礎(chǔ)群移出種鼠,經(jīng)擴大群擴增后,建立生產(chǎn)群,由生產(chǎn)群繁殖仔鼠進(jìn)入供應(yīng)群。(2)封閉群小鼠的維持和生產(chǎn)①維持。小鼠保種時應(yīng)盡可能多的保留繁殖個體。②生產(chǎn)。常用的方法有一雄多雌同居交配法和雌雄1:1同居交配法。四、動物人工雜交技術(shù)(一)大腸桿菌雜交技術(shù)1)培養(yǎng)基制備LB培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其成分為:蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L。若制備固體培養(yǎng)基,只需再加入瓊脂粉15g/L,調(diào)節(jié)pH至7.4~7.6,配好后高壓滅菌即可。2)雜交操作(1)親本選擇:親本選擇供體菌、受體菌。(2)菌種活化:分別接一環(huán)供體菌和受體菌于5mLLB培養(yǎng)液中,37℃振蕩培養(yǎng)10~12h。(3)擴大培養(yǎng):擴大培養(yǎng)需各取1mL過夜培養(yǎng)物,分別加入兩個盛有5mLLB培養(yǎng)液的250mL三角瓶內(nèi),37℃振蕩培養(yǎng)2~3h。五、微生物人工雜交技術(shù)(一)大腸桿菌雜交技術(shù)2)雜交操作(4)混合培養(yǎng)-雜交:混合培養(yǎng)-雜交需吸取0.5mL供體菌和4.5mL受體菌,加入一個無菌的250mL三角瓶中混合,置37℃搖床上培養(yǎng)100min。(5)觀察統(tǒng)計:將上述接合菌液用生理鹽水稀釋10、100倍。各吸取0.1mL稀釋液涂布在選擇培養(yǎng)基平板上,每一種稀釋液涂布兩個平板。同時將供體菌及受體菌分別吸取0.1mL涂布在選擇培養(yǎng)基上作為對照,每種菌各兩個平板,均于37℃條件下培養(yǎng)48h。最后,觀察統(tǒng)計菌落數(shù)目。
五、微生物人工雜交技術(shù)(二)放線菌雜交技術(shù)1)混合培養(yǎng)法(1)選擇性平板法:選擇性平板法所使用的兩親株必須是互補的營養(yǎng)缺陷型。將用來進(jìn)行重組的兩親株混合,接種到豐富的完全培養(yǎng)基斜面上;孢子形成后制成單孢子懸浮液。然后在選擇培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離,長出的菌落即為各種類型的重組體。(2)異核系分析法:將混合培養(yǎng)后所制得的單孢子懸浮液,分離在基本培養(yǎng)基平板上,其中長成的小而豐富的菌落即為異核系。然后將異核系再分離在完全培養(yǎng)基上,長出的菌落即為分離子。2)平板雜交法平板雜交法是先將菌落培養(yǎng)在非選擇培養(yǎng)基上,當(dāng)菌落形成孢子后,用影印培養(yǎng)法將菌落印至已鋪有試驗菌孢子的完全培養(yǎng)基平板上,再培養(yǎng)至孢子形成。然后把上面的孢子影印到一系列選擇培養(yǎng)基上,以便于各種重組體子代的生長。
五、微生物人工雜交技術(shù)(二)放線菌雜交技術(shù)3)玻璃紙轉(zhuǎn)移法使用玻璃紙轉(zhuǎn)移法必須具備兩個條件:①直接親本必須帶有兩個遺傳標(biāo)記,即一個直接親本帶有一種營養(yǎng)要求和抗藥性(如抗鏈霉素),而另一個直接親本則為對該藥物敏感(如對鏈霉素敏感)和帶有另一種營養(yǎng)缺陷型;②選擇培養(yǎng)基是帶有抗性藥物的補充培養(yǎng)基。玻璃紙轉(zhuǎn)移法是在選擇培養(yǎng)基上挑選異核系菌落,其原理是:異核體帶有鏈霉素敏感的等位基因,在含有鏈霉素的選擇培養(yǎng)基上不能生長。敏感性親本和抗藥性親本因為營養(yǎng)要求得不到滿足也不能在該選擇培養(yǎng)基上生長,而不帶鏈霉素敏感等位基因的兩直接親本的局部結(jié)合則能在該選擇培養(yǎng)基上生長、繁殖成為異核系菌叢。五、微生物人工雜交技術(shù)(三)真菌雜交技術(shù)1)選擇直接親本直接親本的遺傳標(biāo)記多種多樣,如營養(yǎng)突變型、抗藥性突變型、形態(tài)突變型等。2)異核體的形成在基本培養(yǎng)基上,強迫兩株營養(yǎng)缺陷型互補營養(yǎng),則這兩個菌株經(jīng)過菌絲細(xì)胞間的吻合形成異核體。直接親本形成異核體的方法有:完全培養(yǎng)基液體混合培養(yǎng)法、完全培養(yǎng)基斜面混合培養(yǎng)法、液體有限培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法、有限培養(yǎng)基平板異核叢形成法、基本培養(yǎng)基斜面銜接接種法、基本培養(yǎng)基平板穿刺法等。五、微生物人工雜交技術(shù)(三)真菌雜交技術(shù)3)雙倍體的檢出(1)用放大鏡觀察異核體菌落的表面,如果發(fā)現(xiàn)有野生型顏色的斑點和扇面,即可用接種針將其孢子挑出,進(jìn)行分離純化,即得雜合雙倍體。(2)將異核體菌絲打碎,在基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離,經(jīng)培養(yǎng)挑出異核體菌落。個別異核體菌落上長出野生型原養(yǎng)性的斑點和扇面,將其挑出進(jìn)行分離純化即可。(3)將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上,從中長出野生型原養(yǎng)性菌落,將其挑出分離純化,即得雜合雙倍體。前兩種方法只能從每個異核體菌落上挑取一個斑點或扇面,以排除無性繁殖的干擾。五、微生物人工雜交技術(shù)(三)真菌雜交技術(shù)4)分離子的檢出(1)將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上,培養(yǎng)至菌落成熟,從每個菌落挑出一個斑點或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上,培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別即得分離子。(2)用選擇培養(yǎng)基篩選分離子。五、微生物人工雜交技術(shù)(四)酵母菌雜交技術(shù)1)培養(yǎng)基制備(1)完全液體培養(yǎng)基:蛋白胨2g、酵母浸母汁1g、葡萄糖2g、水100mL(pH為6.0)、58.8kPa高壓蒸氣滅菌30min。(2)完全固體培養(yǎng)基:在完全液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。(3)基本液體培養(yǎng)基:葡萄糖10g、(NH4)2SO41g、K2HPO40.125g、KH2PO40.875g、KI母液(10mgKI溶于100mL水中配成)1mL、MgSO4·7H2O0.5g、CaCl2·2H2O0.lg、NaCl0.1g、微量元素母液(H3PO41mg、ZnSO4·7H2O7mg、CuSO4·5H2O1mg、CoCl2·6H2O5mg、水100mL,配成溶液)1mL、維生素母液(煙堿酸40mg、維生素B140mg、肌醇200mg、核黃素20mg、對氨基苯甲酸20mg、吡哆醇40mg、泛酸40mg、生物素0.2mg、水100mL,配成溶液)1mL、水1000mL,pH為5.3,58.8kPa高壓蒸氣滅菌30min。五、微生物人工雜交技術(shù)(四)酵母菌雜交技術(shù)(4)基本固體培養(yǎng)基:在基本液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。(5)產(chǎn)孢子培養(yǎng)基:乙酸鈉8.2g、KCl1.86g、吡哆酵母液(20mg吡哆醇、100mL水)1mL、泛酸母液(20mg泛酸、100mL水)1mL、生物素母液(2mg生物素、100mL水)1mL、瓊脂20g、蒸餾水1000mL。(6)補充培養(yǎng)基:①基本固體培養(yǎng)基100mL+組氨酸3.5mg;②基本固體培養(yǎng)基100mL+腺嘌呤3mg。五、微生
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