瘧疾快速診斷技術(shù)課件

瘧疾快速診斷技術(shù)的

研究與應(yīng)用湖北CDC傳染病所袁方玉瘧疾快速診斷技術(shù)主要內(nèi)容前言顯微鏡鏡檢用于瘧疾診斷熒光顯微鏡用于瘧疾診斷PCR方法用于瘧疾診斷免疫學(xué)用于瘧疾診斷

1、瘧疾診斷試劑基于的靶抗原

2、診斷試劑基于的免疫學(xué)原理

3、瘧疾診斷的快速診斷試劑

瘧疾快速診斷技術(shù)前言

瘧疾是廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶邊緣地區(qū)的一種重要蚊媒傳染病，弓l起世界范圍內(nèi)的較高的發(fā)病率和死亡率，簡(jiǎn)便、快速和可靠的檢測(cè)手段對(duì)提高臨床療效和控制流行具有重要意義。傳統(tǒng)的厚、薄血膜姬氏染色鏡檢浩仍是當(dāng)前瘧疾診斷的主要方法，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需專業(yè)培訓(xùn)人員，且對(duì)低原蟲血癥者易漏診這些不足促進(jìn)了更敏感、簡(jiǎn)便，更快速的新技術(shù)的發(fā)展，如熒光染色鏡檢組氨酸富集蛋白和瘧原蟲乳酸脫氫酶抗原檢測(cè)及PCR技術(shù)等。瘧疾快速診斷技術(shù)

世界衛(wèi)生組織召開的專家研討會(huì)上認(rèn)為瘧疾的診斷方法應(yīng)準(zhǔn)確、敏感、低廉快速方法應(yīng)能檢出每微升100個(gè)原蟲，檢測(cè)時(shí)間應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。瘧疾快速診斷技術(shù)一、顯微鏡鏡檢用于瘧疾診斷

顯微鏡鏡檢仍是目前廣泛應(yīng)用的瘧疾診斷技術(shù)(金標(biāo)準(zhǔn)）主要優(yōu)點(diǎn)

-特異高

-能區(qū)分蟲種

-能分期

-能計(jì)數(shù)

-1小時(shí)內(nèi)能完成診斷程序瘧疾快速診斷技術(shù)缺點(diǎn)要求有較高的技術(shù)素質(zhì)容易漏檢（惡性瘧）大規(guī)模鏡檢費(fèi)時(shí)、費(fèi)力敏感性低（原蟲感染率為0.01%，厚片的敏感性是薄片的10倍）

瘧疾快速診斷技術(shù)二、熒光顯微鏡用于瘧疾診斷

研究發(fā)現(xiàn)，一些熒光素對(duì)核酸有好的親和力，經(jīng)一定波長的紫外線激活，原蟲核酸可通過熒光顯微鏡觀察到。目前常用的熒光染色劑:有吖啶橙（AO）苯并硫羥基嘌呤（bcp）若丹明-123一種紅色的熒光染料，主要作用于細(xì)胞膜，也常用于原蟲染色瘧疾快速診斷技術(shù)FIG.1.TrophozoitesofP.falciparumstainedwithAOintheQBCUVfluorescencemethod

瘧疾快速診斷技術(shù)吖啶橙（AO）優(yōu)缺點(diǎn)：染色需要較高的技術(shù)，辨認(rèn)非特異性著色因子，特別注意區(qū)分豪厄爾斯氏體同原蟲的區(qū)別，這種豪厄爾斯氏體來自溶血性貧血的病人。一般來說，吖啶橙染色法檢測(cè)原蟲的敏感性為41-93%,為﹥100原蟲/1微升血液,相當(dāng)于0.002%感染率。檢測(cè)惡性瘧的特異性為93%。檢測(cè)間日瘧和其他非惡性瘧原蟲的后期原蟲的特異性只有52%。瘧疾快速診斷技術(shù)ｂｃｐ染色優(yōu)缺點(diǎn)：ｂｃｐ染色后瘧原蟲厚血膜在４００倍熒光顯微鏡下見，瘧原蟲各發(fā)育期及滋養(yǎng)體、裂殖體和配子體呈特異性蘋果綠色熒光；胞槳瘧色素呈黃色；白細(xì)胞胞槳染成亮綠色。血膜中的異物不呈熒光色，易區(qū)別。瘧疾快速診斷技術(shù)

FIG.2.TrophozoitesofP.falciparumstainedwithBCPinthefluorescencemethod.

瘧疾快速診斷技術(shù)

ｂｃｐ染色惡性瘧與間日瘧血片，敏感性為９７．４％、９１．２％，特異性為６６．７％、５０％，陽性預(yù)測(cè)值９７．６％、８８．６％陰性預(yù)測(cè)值５０％與４０％。認(rèn)為ｂｃｐ染色法是一種有使用價(jià)值的瘧疾診斷新方法。瘧疾快速診斷技術(shù)若丹明-123：一種紅色的熒光染料，主要作用于細(xì)胞膜，也常用于原蟲染色，目前用得不多。瘧疾快速診斷技術(shù)三、PCR方法用于瘧疾診斷PCR方法嚴(yán)格來說不能算是瘧疾的快速診斷方法，他的主要特點(diǎn)是敏感性高，能檢出每微升少于5個(gè)原蟲的血液樣本。復(fù)式、多層和熒光定量PCR方法可用于瘧疾的定性和定量診斷，這對(duì)哪些形態(tài)學(xué)難以鑒別的樣本來說非常有價(jià)值。瘧疾快速診斷技術(shù)（一）瘧原蟲檢測(cè)的常用的分子標(biāo)志有環(huán)子孢子(CS)、18SrRNA片段、裂殖子表面蛋白一1(Msp一1)、裂殖子表面蛋白一2(Msp一2)及富組氨酸蛋白(m)基因等瘧疾快速診斷技術(shù)

CS是瘧原蟲子孢子表達(dá)的一種期特異性表面抗原的基因。已發(fā)現(xiàn)通過測(cè)定CS基因序列的重復(fù)結(jié)構(gòu)可進(jìn)行瘧原蟲分類．了解其遺傳特征和地理來源。自1984對(duì)CSP基因序列進(jìn)行測(cè)定以來，已積累了大量CSP基因資料，至今為止有中美洲、南美洲、東亞、東南亞、南太平洋島嶼開展間日瘧原蟲CSP基因序列分析．問日瘧原蟲CSP中央重復(fù)區(qū)由15—21個(gè)9肽重復(fù)單位組成，每單位由27個(gè)核苷酸編碼9個(gè)氨基酸，目前已發(fā)現(xiàn)兩類明顯不同的9肽重復(fù)單位，分為Pv—I型和PV一Ⅱ型．I型按9肽單位氨基酸序列變化分為溫帶族和熱帶族，兩族序列差異明顯．分布有一定局限性。瘧疾快速診斷技術(shù)（二）優(yōu)缺點(diǎn)：PCR方法也可用于研究原蟲的種群差異、突變和對(duì)藥物的抗性

敏感性高。能夠檢測(cè)到感染率為0.00001%的惡性瘧原蟲血樣，以及感染率為0.0000126%的間日瘧血樣。利用套式和逆轉(zhuǎn)錄PCR方法能鑒定4種瘧原蟲，

瘧疾快速診斷技術(shù)一般PCR方法也存在著產(chǎn)物的污染易致假陽性，不能在一次檢測(cè)中鑒別蟲種，也不能診斷混合感染。

需特殊設(shè)備，不能用于現(xiàn)場(chǎng)費(fèi)時(shí)，成本高瘧疾快速診斷技術(shù)四、免疫色譜方法（一）原理

免疫色譜技術(shù)其原理為利用硝酸纖維素膜(NC)制備免疫層析測(cè)試條，在NC上包被被檢抗原的一株單抗作為捕獲帶，同時(shí)，將另一株單抗偶聯(lián)在膠體金或乳膠上作為檢測(cè)試劑。當(dāng)樣本溶液和檢測(cè)試劑通過捕獲帶時(shí)，二者形成的復(fù)合物即被包被在膜上的抗體捕捉，如果樣品中含有被檢抗原，則捕獲帶可發(fā)生顏色反應(yīng)，顏色反應(yīng)的強(qiáng)弱與樣本中的抗原濃度成正比。這些產(chǎn)品從取血、反應(yīng)、結(jié)果判斷，只需5—10分鐘，而且多個(gè)樣本可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)不需特殊儀器，非常適合于邊遠(yuǎn)山區(qū)基層醫(yī)院、衛(wèi)生所防保醫(yī)生和村醫(yī)應(yīng)用。

瘧疾快速診斷技術(shù)FIG.3.PrincipleofimmunochromatographicRDTformalaria

瘧疾快速診斷技術(shù)（二）瘧疾診斷試劑基于的靶抗原1、水溶性蛋白HEP（histidine-richproteins）。研究表明惡性瘧原蟲感染紅細(xì)胞后，由感染的紅細(xì)胞分泌三種含有大量組氨酸組成的水溶性抗原，它們是HRP-1/HRP-2和HRP-3。HRP-2由感染瘧原蟲的紅細(xì)胞大量分泌，其含量在整個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)期隨裂殖子的分裂逐漸升高。這一抗原只由無性體中和早期配子體產(chǎn)生，量大，且較穩(wěn)定，是用于惡性瘧診斷的首選。同HRP-1和HRP-2比較，HRP-3在血液中的量很少，目前還沒有針對(duì)它的試劑盒瘧疾快速診斷技術(shù)2、乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase，LDH)

乳酸脫氫酶是糖酵解途徑的終止酶，由瘧原蟲的無性期和有性期產(chǎn)生。先前的研究揭示了pLDH同宿主動(dòng)物L(fēng)DH在理化、免疫學(xué)特性和酶學(xué)方面有很大的差異。另外四種瘧原蟲產(chǎn)生的pLDH有不同的異構(gòu)體，具有種、屬特異性，因而目前將它作為快速檢測(cè)試劑第二選擇的靶抗原。瘧疾快速診斷技術(shù)3、醛縮酶（aldolase）

醛縮酶是一種果糖二磷酸醛縮酶，可催化1，6-二磷酸果糖，生成磷酸二羥丙酮及磷酸甘油醛，由瘧原蟲的無性期和有性期產(chǎn)生。四種瘧原蟲都能檢測(cè)到。一些研究建議將此酶作為快速診斷的靶抗原，目前僅限于研究。瘧疾快速診斷技術(shù)（三）快速診斷試劑1、ParaSight-F。ParaSight-F法為世界衛(wèi)生組織推薦的應(yīng)用產(chǎn)品，檢測(cè)原蟲的靶抗原為HRP-2。和厚血膜鏡檢比較，現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估結(jié)果顯示在原蟲密度大于100個(gè)／微升，原蟲感染率0.002%時(shí)，檢測(cè)惡性瘧的敏感性平均為77～98%，特異性83～98%。當(dāng)患者HRP-2分泌少，血液中HRP-2水平低時(shí)，ParaSight-F法可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，同PCR法比較，ParaSight-F的檢測(cè)低感染率患者的敏感性低于PCR法。瘧疾快速診斷技術(shù)2、ICTpf和PATHFalciparumMalariaIC。ICTpf。

ICTpf（ICT1）診斷卡用于檢測(cè)惡性瘧，也是基于檢測(cè)HRP-2抗原。該診斷試劑由于操作簡(jiǎn)單，所需儀器少，結(jié)果易于判斷，贏得了越來越多的使用者。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)惡性瘧，如果用于檢測(cè)其他瘧疾可能造成漏檢或誤診；其次不能用于診斷混合感染；第三有報(bào)道于內(nèi)風(fēng)濕因子起交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性。瘧疾快速診斷技術(shù)FIG.4.AmradICTPfimmunochromatographictestdevicefordetectionofP.falciparumHRP-2.

瘧疾快速診斷技術(shù)3、OptiMAL。

OptiMAL診斷試劑是基于檢測(cè)原蟲代謝產(chǎn)物乳酸脫氫酶，目前OptiMAL乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒是在層析條上包被兩株LDHpf單抗，一株為惡性瘧種特異性單抗，另一株為能與四種人瘧原蟲都反應(yīng)的屬特異性單抗。此診斷方法在實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)條件下都已進(jìn)行了評(píng)估，同鏡檢法相比，惡性瘧原蟲的敏感性和特異性在分別為88％和99％，問日瘧分別為94％和100％。在評(píng)估中也發(fā)現(xiàn)，感染率小于0.002%的血樣OptiMAL檢測(cè)有3%的陰性瘧疾快速診斷技術(shù)FIG.5.OptiMALimmunochromatographictestdeviceforthedetectionofpLDH.

瘧疾快速診斷技術(shù)TABLE1.ResultsofroutinebloodsamplesexaminedformalariabymicroscopycomparedtoOptiMALrapiddipsticktestaNo.ofsamplesandspeciespresentbymicroscopy No.OptiMALpositiveSensitivity(%)

Plasmodiumfalciparum

54withparasitemiaof>1%(50,000parasites/μl) 54 100

103withparasitemiaof0.1–1%(5,000parasites/μl) 103 100

72withparasitemiaof0.01–0.09%(500parasites/μl) 72 100

32withparasitemiaof0.001–0.009%(50parasites/μl) 23 72

11withparasitemiaof0.0001–0.0009%(5parasites/μl) 8 73

5withgametocytesonly 4 80Plasmodiumvivax

110(allasexualstages) 105 96Plasmodiummalariae

17(latetrophozoites) 8 47Negative

214(nomalariaparasitesfound) 0100 瘧疾快速診斷技術(shù)TABLE2.ResultsobtainedbymicroscopyandOptiMALfromsequentialbloodsamplesfrom60patientsreceivingtherapyforP.falciparummalariaa

SamplecollectiontimeNo.ofpatientswithpositivemicroscopicparasitemiaMeanparasitemia(%)No(%)OptiMALpositiveSensitivity(%)ofOptiMALatthisparasitemiafrominitialsamplesDayofdiagnosis(Pretreatment)602.4358(98)100Day1posttreatment511.9639(76)100Day2posttreatment440.52527(61)100Day3posttreatment290.1118(62)100Day4posttreatment160.03111(68)100Day5posttreatment80.00223(38)72瘧疾快速診斷技術(shù)TABLE3.ComparisonofmethodsfordiagnosingPlasmodiuminfectioninbloodParameterMicroscopyPCRFluorescenceDipstickHRP-2DipstickpLDH,ICTPf/PvSensitivityparasites/μl)50550>100>100SpecificityAllspeciesAllspeciesP.falciparumgood,othersdifficultP.falciparumonlyP.falciparumandP.vivaxgood,andP.ovaleandP.malariaeonlywithpLDHParasitedensityorparasitemiaYesNoNoCrudeestimationCrudeestimationTimeforresult30–60min24h30–60min20min20minSkilllevelHighHighModerateLowLowEquipmentMicroscopePCRapparatusQBCapparatusordirectfluorescencemicro