梅毒實驗室診斷教學課件

梅毒實驗室診斷全國梅毒淋病流行趨勢全國梅毒流行狀況我國梅毒感染重點人群概述梅毒：蒼白螺旋體引起的一種慢性性傳播疾病。梅毒螺旋體長5～20μm，直徑<0.2μm，有6～12個規(guī)則的螺旋，折光性強，較其他螺旋體亮；因其透明一般細菌染料不易染色，故稱為蒼白螺旋體。梅毒螺旋體運動緩慢而有規(guī)律：

梅毒的臨床分期

一期梅毒早期梅毒二期梅毒后天梅毒（病期在2年以內(nèi)）早期潛伏梅毒

晚期梅毒心血管和神經(jīng)梅毒、（病期在2年以上）晚期潛伏梅毒等梅毒

先天梅毒早期胎傳梅毒（出生后2年以內(nèi)發(fā)?。┩砥谔髅范荆ǔ錾?年以后發(fā)?。┟范驹\斷標準WS273-2007診斷依據(jù)

1.流行病學史

2.臨床表現(xiàn)

3.實驗室檢查診斷原則應根據(jù)病史、臨床癥狀、體檢及實驗室檢查等進行綜合分析，作出診斷。診斷標準

1.疑似病例

2.確診病例一期梅毒診斷依據(jù)

1流行病學史：有多性伴，不安全性行為，或性伴感染史。

2臨床表現(xiàn)：

2.1硬下疳2.2腹股溝或患部近衛(wèi)淋巴結(jié)腫大一期梅毒3實驗室檢查：

3.1暗視野顯微鏡檢查

3.2非梅毒螺旋體抗原血清學試驗3.3梅毒螺旋體抗原血清學試驗診斷標準

1疑似病例：應同時符合1，2和3.2項。

2確診病例：應同時符合疑似病例的要求和3.1、3.3中的任一項。二期梅毒診斷依據(jù)

1流行病學史

2臨床表現(xiàn)

2.1皮損呈多形性

2.2全身淺表淋巴結(jié)腫大。

2.3可出現(xiàn)梅毒性骨關(guān)節(jié)損害、眼損害、內(nèi)臟及神經(jīng)系統(tǒng)損害等。

二期梅毒3實驗室檢查：

3.1暗視野顯微鏡檢查

3.2非梅毒螺旋體抗原血清學試驗

3.3梅毒螺旋體抗原血清學試驗診斷標準

1疑似病例：應同時符合1，2和3.2項。

2確診病例：應同時符合疑似病例的要求和3.1、3.3中的任一項。三期梅毒（晚期梅毒）診斷依據(jù)

1流行病學史

2臨床表現(xiàn)

2.1晚期良性梅毒

--皮膚黏膜損害

--骨梅毒，眼梅毒，其他內(nèi)臟梅毒2.2神經(jīng)梅毒2.3心血管梅毒

三期梅毒（晚期梅毒）3實驗室檢查：

3.1非梅毒螺旋體抗原血清學試驗

3.2梅毒螺旋體抗原血清學試驗

3.3腦脊液檢查

3.4組織病理檢查診斷標準

1疑似病例：應同時符合1，2中的任一項和3.1項。

2確診病例：應同時符合疑似病例的要求和3.2、3.3、3.4中的任一項。隱性梅毒（潛伏梅毒）診斷依據(jù)

1流行病學史

2臨床表現(xiàn)：

早期隱性梅毒

晚期隱性梅毒

無論早期隱性梅毒或晚期隱性梅毒，均無任何梅毒性的癥狀和體征。

隱性梅毒（潛伏梅毒）3實驗室檢查：

3.1非梅毒螺旋體抗原血清學試驗

3.2梅毒螺旋體抗原血清學試驗

3.3腦脊液檢查診斷標準

1疑似病例：應同時符合1，2和3.1項。

2確診病例：應同時符合疑似病例的要求和3.2、3.3項。

胎傳梅毒（先天梅毒）診斷依據(jù)

1流行病學史

2臨床表現(xiàn)：

2.1早期胎傳梅毒

2.2晚期胎傳梅毒

2.3胎傳隱性梅毒

胎傳梅毒（先天梅毒）3實驗室檢查：

3.1暗視野顯微鏡檢查

3.2非梅毒螺旋體抗原血清學試驗3.2.1血清抗體自身比較:3.2.2與母親比較。

3.3梅毒螺旋體抗原血清學試驗3.3.1TP-IgM抗體。3.3.2接受治療的嬰兒，隨訪18個月后TPPA。診斷標準

1疑似病例：應同時符合1，2和3.2項。

2確診病例：應同時符合疑似病例的要求和3.1、3.3中的任一項。梅毒的傳播途徑：性接觸是主要的傳染途徑:母嬰傳播:血源性傳播:間接接觸傳播梅毒的實驗室檢查結(jié)果對診斷有決定性意義?。?！梅毒實驗室檢測方法病原學檢查血清學檢測病原學檢查－試驗方法病原學檢查的主要方法有暗視顯微鏡檢查、鍍銀染色法和直接熒光法。取材：病原學檢查－結(jié)果

暗視野顯微鏡下，典型的梅毒螺旋體呈白色發(fā)光,其螺旋較密而均勻，運動規(guī)律，運動性較強。梅毒螺旋體具有親銀性，鍍銀染色后顯微鏡下可見到染成棕色的梅毒螺旋體。直接熒光染色后，在熒光顯微鏡下可見到發(fā)蘋果綠色的梅毒螺旋體。臨床意義與暗視野顯微鏡檢測相同。但DFA的特異性及敏感性均大于暗視野顯微鏡檢測。病原學檢查－臨床意義病原學方法直接鏡檢到梅毒螺旋體，在臨床可確診梅毒，且具有快速、簡便、直接的特點。螺旋體檢查是診斷早期現(xiàn)癥梅毒的最佳方法(一期、二期梅毒皮損或淋巴結(jié)節(jié)、孕婦羊膜穿刺)，對于患者的早期診斷、及時治療、預后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性，取材部位不正確、螺旋體數(shù)量不足、患者已接受抗生素治療、損害接近自然消退和實驗室工作人員缺乏經(jīng)驗等均會影響結(jié)果的判斷。梅毒血清學檢測非梅毒螺旋體抗原血清學試驗梅毒螺旋體抗原血清學試驗常見的非梅毒螺旋體抗原血清學試驗：1、快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗(RPR)2、甲苯胺紅試驗(TRUST)3、性病研究實驗室試驗(VDRL)等基本成分是心磷脂卵磷脂和膽固醇抗原抗體結(jié)合形成復合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見上述方法的敏感性和特異性都基本相似RPR(TRUST)－原理原理：活性炭顆粒(甲苯胺紅)吸附心磷脂抗原，此抗原與待檢血清中的反應素結(jié)合，形成肉眼可見的黑(紅）色絮狀物。RPR(TRUST)－材料RPR(TRUST)試劑盒：含RPR(TRUST)抗原；直徑為18mm圓圈的特制白色反應卡片；標準針頭（60±1滴/mL）；RPR(TRUST)試驗結(jié)果圖片。其他：可調(diào)水平旋轉(zhuǎn)器。

RPR(TRUST)試驗前期準備水平旋轉(zhuǎn)儀試劑50μl移液器、吸頭記號筆、廢物缸工作服一次性手套、口罩、帽子生物安全柜梅毒自動旋轉(zhuǎn)儀梅毒自動旋轉(zhuǎn)儀

檢測流程操作步驟：將檢測試劑盒從冰箱中取出，室溫放置30分鐘。測水平旋轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)速。在RPR紙卡上編上相應的待檢樣本的編號。RPR(TRUST)-定性試驗

a.吸取50μL血清或血漿加于卡片圈內(nèi)，并均勻地涂布在整個圈內(nèi)（每張紙卡有10個或12個反應圈）；

b.將抗原輕輕搖勻，用標準針頭吸取抗原，每個標本加1滴抗原；

c.將卡片置水平旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)8min，100±5轉(zhuǎn)/min；

d.立即在明亮光線下觀察結(jié)果。RPR(TRUST)－定量試驗

RPR定量試驗的指證與VDRL試驗相同。

a.在圈內(nèi)加入50μL等滲鹽水（一般作6～8個稀釋度），勿將鹽水涂開；

b.吸取50μL血清或血漿作系列稀釋（1:2～1:64），當稀釋到最后的第6孔時，棄去50μLmL稀釋液。從第6孔起將血清稀釋液涂布整個圈內(nèi)，再涂布第5孔，依此向前到第1孔。

c.滴加抗原，旋轉(zhuǎn)時間、速度和觀察結(jié)果同定性試驗。滴度：出現(xiàn)凝集反應的血清最高稀釋倍數(shù)。

結(jié)果報告結(jié)果報告：定性試驗:陽性：出現(xiàn)不同強度的肉眼可見的黑色/紅色凝集反應。陰性：不產(chǎn)生凝集反應。定量試驗。滴度：出現(xiàn)凝集反應的樣本最高稀釋倍數(shù)。特點在USR試劑成分的基礎(chǔ)上加入了黑色碳顆粒（甲苯胺紅），作為沉淀的指示物，所不需要顯微鏡觀察結(jié)果，可用肉眼直接觀察特制的白色紙卡替代了玻片血清不需滅活可作定量試驗有現(xiàn)成的試劑盒，攜帶方便操作簡單價格便宜RPR質(zhì)控卡RPR試驗結(jié)果TRUST試驗結(jié)果TRUST試驗與RPR試驗結(jié)果性病研究實驗室試驗（VDRL)特點抗原需新鮮配制，不能長時間保存血清標本需56℃滅活目前主要用于腦脊液標本檢查顯微鏡觀察結(jié)果主要用于神經(jīng)梅毒的腦脊液檢查,特異性高，但敏感性低非梅毒螺旋體抗原血清學試驗－臨床意義早期梅毒經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后滴度變化一期梅毒可轉(zhuǎn)陰二期梅毒可轉(zhuǎn)陰晚期梅毒治療后可否轉(zhuǎn)陰？非梅毒螺旋體抗原血清學試驗－臨床意義非梅毒螺旋體抗原血清試驗方法簡單、快速、敏感性和特異性較好，適合于大量人群的篩查、產(chǎn)前檢查及健康體檢等早期梅毒硬下疳出現(xiàn)1－2周后，血清可呈現(xiàn)陽性治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復發(fā)或再感染的指征非梅毒螺旋體抗原血清學試驗－假陽性技術(shù)性假陽性反應由于標本保存不當（如細菌污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或?qū)嶒炇也僮麇e誤所造成生物學假陽性反應是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清學試驗出現(xiàn)陽性梅毒假陽性的處理由操作錯誤引起的技術(shù)性假陽性反應：對于急性生物學假陽性反應：前帶現(xiàn)象：耐血清性（血清固定）：影響定量試驗穩(wěn)定性的因素試劑質(zhì)量移液器、水平旋轉(zhuǎn)儀、試劑滴管等反應孔大小樣本處理要規(guī)范旋轉(zhuǎn)速度、時間要準確，結(jié)果觀察要及時。非梅毒螺旋體抗原血清試驗方法比較VDRLRPRTRUST抗原成分心磷脂、卵磷脂、膽固醇同前+EDTA+氯化膽堿+活性炭同前+EDTA+氯化膽堿+甲苯胺紅抗原穩(wěn)定性不穩(wěn)定,1天穩(wěn)定4℃～8℃保存12個月穩(wěn)定4℃～8℃保存12個月血清試驗前處理需滅活不需滅活不需滅活反應板直徑14mm漆圈玻片直徑為18mm圓圈的特制白色反應卡片直徑為18mm圓圈的特制白色反應卡片針頭60±1滴/mL60±1滴/mL60±1滴/mL轉(zhuǎn)速180±5次/min100±5轉(zhuǎn)/min100±5轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)時4min8min8min顯微鏡10×10倍顯微鏡下觀察肉眼肉眼梅毒螺旋體抗原血清學試驗采用梅毒螺旋體特異蛋白作抗原，檢測血清中抗梅毒螺旋體IgG或IgM抗體（為特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體），其敏感性和特異性均較高。感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者終身陽性。常見的梅毒螺旋體抗原血清學試驗：1梅毒螺旋體血球凝集試驗（TPHA）2梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）3熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）4梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗（TP-ELISA）5梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（TP-WB）6梅毒免疫層析法－梅毒快速檢測（RT）7測定螺旋體IgM抗體的血清學試驗8化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）TPPA試驗－原理原理：超聲裂解的梅毒螺旋體抗原，致敏明膠粒子，其致敏粒子與待檢血清中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集。試驗前期準備微量振蕩儀試劑25μl移液器、吸頭記號筆、廢物缸有蓋濕盒工作服一次性手套、口罩、帽子生物安全柜TPPA/TPHA試驗－檢測流程

試驗使用前將試劑盒從冰箱中取出，室溫放置30分鐘恢復到15℃～30℃。在96孔UU型板上編上相應的待檢樣本的編號。按標簽標明量（0.6ml)向每瓶凍干致敏粒子（C液）和未致敏粒子（D液）各加入溶解用液（A液）復溶，置室溫不得少于30分鐘。

定性試驗：每份標本做4孔，加標本稀釋液（B液）至U型反應板，第1孔100μl，第2～4孔各25μl。用移液器取血清25μl至第1孔，反復混勻后取25μl至第2孔，連續(xù)倍比稀釋至第4孔，最后1孔混勻后棄去25μμl。第3孔加未致敏粒子D液25μl，第4孔加致敏粒子C液25μl。將微量反應板置震蕩器震蕩30秒。置微量反應板于有蓋濕盒內(nèi)，37℃孵箱或室溫（15℃-30℃）靜置2小時后，觀察結(jié)果。TPPA/TPHA試驗－定量試驗

a.加B液至微量反應板孔，第1孔～第4孔與定性試驗相同，第5孔～第10孔各加25μL；

b.取血清25μL加至第1孔，如定性試驗稀釋方法，從第2孔～第10孔混勻，混勻后第10孔棄去25μL；

c.第3孔加D液25μL，第4孔～第10孔各加C液25μL；

d.以后步驟同定性試驗。結(jié)果以最高血清稀釋度能產(chǎn)生陽性反應的稀釋度為抗體滴度。結(jié)果報告:觀察加D液的第3孔，不出現(xiàn)凝集為有效試驗。陽性：第3孔不出現(xiàn)凝集，第4孔出現(xiàn)1+～4+凝集反應。陰性：第3、4孔均不產(chǎn)生凝集反應。TPPA/TPHA試驗－報告方法

a.陽性報告：定性試驗，血清在1:80以上稀釋度與致敏顆粒發(fā)生凝集反應（1+或更強），與未致敏顆粒（第3孔）不發(fā)生凝集反應。定量試驗則應報告發(fā)生陽性反應的血清最高稀釋度，為血清滴度。

b.陰性報告：血清與致敏顆粒和未致敏顆粒均不發(fā)生凝集反應。TPPA結(jié)果TPPA/TPHA試驗－注意事項

a.微量反應板要清潔干凈，孔內(nèi)無異物。

b.加入血清后，使用微量板振蕩器振蕩反應板，而不可使用水平旋轉(zhuǎn)儀。

c.試劑盒不可置于0℃以下，防止凍結(jié)。不同批號試劑不可混合使用。

d.有些血清標本在血清低稀釋度時可出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，此時可作定量試驗；

e.如未致敏顆粒出現(xiàn)凝集反應，應將血清進行吸收處理后再進行試驗，或改用其他試驗方法。TPPA試驗梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(TP-ELISA)原理

該試驗是用經(jīng)純化及超聲裂解處理的梅毒螺旋體為抗原包被固相板條，加上梅毒血清和辣根過氧化酶標記的抗人IgG抗體，利用酶免疫法檢測患者血清中的抗梅毒螺旋體特異性抗體。采用特異的梅毒螺旋體重組蛋白作為抗原，使試驗更加敏感、特異。TP-ELISA材料

a.ELISA試劑盒：含包被梅毒螺旋體抗原的反應板（96孔）；標本稀釋液；洗滌液，使用前按說明書要求稀釋；酶結(jié)合物；底物液（A液和B液）；反應終止液；陽性對照血清；陰性對照血清。

b.其他：酶標檢測儀；洗扳機。TP-ELISA方法

a.取標本稀釋液100μL加到反應板孔內(nèi)，再加入待檢血清10μL，同時作陽性和陰性對照，置37℃孵育30min。

b.洗滌液洗板5次，拍干；

c.每孔加酶結(jié)合物100μL，置37℃孵育15min；

d.洗滌液洗板5次，拍干；

e.每孔加底物液A液、B液各1滴（各50μL），37℃避光孵育15min；

f.每孔加終止液1滴（50μL）終止反應；

g.置酶標檢測儀450nm波長測定光密度（OD值）。TP-ELISA結(jié)果判定

臨界值（cutoff）＝0.10+陰性對照平均OD值（陰性對照OD值<0.05時按0.05計算）。標本OD值<臨界值時，結(jié)果為陰性。標本≥臨界值，結(jié)果為陽性（或按各診斷試劑要求判定結(jié)果）。

注意事項

a.試劑盒置4～8℃保存；

b.不同批號試劑不能混用；

c.嚴格按試劑盒說明書要求操作；

d.反應的溫度和時間必須嚴格控制。

梅毒免疫層析法－梅毒快速檢測（RT）

原理

利用免疫色譜原理，采用吸附有顯色標記的梅毒螺旋體抗原的濾紙條，快速檢測標本中的梅毒螺旋體抗體。梅毒免疫層析快速檢測方法測定螺旋體IgM抗體的血清學試驗梅毒中特異性的IgM抗體是梅毒感染最早其產(chǎn)生的抗體。在潛伏期以及晚期患者可發(fā)現(xiàn)IgM水平在自愈的患者中下降的速度比經(jīng)過治療痊愈的患者慢。IgM分子量較大不能通過胎盤屏障。因此在新生兒血中檢測到IgM抗體表明有先天感染。如在患者的腦脊液檢測到IgM抗體表明有活動性神經(jīng)梅毒。血液中或腦脊液中出現(xiàn)抗梅毒IgM抗體均表示需要治療。檢測Igm的FTA-ABS試驗檢測19S-IgM組分的FTA-ABS試驗IgM固相層血球吸附試驗(SPHA)IgM捕獲ELISA免疫印跡試驗推薦使用19S-IgM-TPHA試驗來診斷先天梅毒。梅毒螺旋體抗原血清學試驗臨床意義證實試驗：體內(nèi)持續(xù)時間：假陽性情況：梅毒螺旋體抗原血清學試驗臨床意義如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清可使FTA—ABS試驗呈假陽，但大多數(shù)病例中螺旋體呈串株狀熒光。傳染性單核細胞增多癥，可能由于嗜異性抗體所致，可使TPHA呈假陽性。麻風患者也可使特異試驗呈陽性。作為非梅毒螺旋體