DB37-T 4754.1-2024動物疫病鑒別檢測技術　第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒

ICS11.220CCSB41ICS11.220CCSB41山 東 省 地 方 標 準DB37/T4754.1—20241Animaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part1:ClassicalswineAnimaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part1:Classicalswinefevervirulentstrainandvaccinestrain2024090320241003山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB37/T4754《動物疫病鑒別檢測技術》的第1部分。DB37/T4754已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒。本文件由山東省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。引 言基（Classicalswinefever，CSFV）20501熒光RT-PCR鑒別檢測技術的操作，便于檢測技術在豬瘟臨床診斷、流行病學調(diào)查、檢驗檢疫、豬瘟疫苗質(zhì)量控制等方面的穩(wěn)定應用。熒光RT-PCR鑒別檢測技術的操作，便于檢測技術在豬瘟臨床診斷、流行病學調(diào)查、檢驗檢疫、豬瘟疫苗質(zhì)量控制等方面的穩(wěn)定應用。222RT-PCR3PCR動物疫病鑒別檢測技術第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒范圍本文件規(guī)定了豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenI熒光RT-PCR鑒別檢測。本文件適用于豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒的鑒別檢測。（GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范本文件沒有需要界定的術語和定義。RT-PCR126bp335bpSYBRGreenDNATmTm注：SYBRGreenI是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。水：GB/T6682（DEPC）取1mLDEPC1000mL，24h，12115min，2℃～8（PBS）取Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mLpH7.4，1000mL，12115min，2℃～8（3%）。稱取3g100mL乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（4%）。稱取4g100mL。商品化病毒核酸提取試劑盒。RT-PCR：DEPCDEPC，pH6.5～8.5PCR0.01g≥12000r/min6000r/min-70樣品采樣工具35min～10min，2min1602h采樣NY/T5411.5mL（）1/104EDTA1mLPBS1mL32mLPBS樣品的運輸及保存2～824h2～82435樣品處理54DEPC10000r/min5min，54DEPC10000r/min5min，410000r/min5min0.5mL10000r/min5min0.5mL10000r/min5min0.5mL核酸抽提進行豬瘟病毒檢測時，生物安全按照GB19489執(zhí)行，采用商品化試劑盒提取病毒核酸。熒光RT-PCR檢測反應體系的配制見附錄B。加樣在各設定的熒光RT-PCR管中分別加入陽性對照、陰性對照和提取的試樣溶液2μL，1min測定SYBRGreenI425min；9510s；510207210.1/s979結(jié)果判定質(zhì)控標準9.1.1豬瘟病毒疫苗弱毒CtTm81.5±0.5Ct值＜30.0Tm81.5℃±0.5熔解峰，參見附錄C（圖C.1）CtTm83.3±0.9Ct值＜30.0Tm83.3℃±0.9熔解峰，參見附錄C（圖C.2）陰陽性結(jié)果的判定CtTm81.5±0.5CtTm81.5±0.530.0＜CtTm81.5±0.5CtTm83.3±0.9CtTm83.3±0.930.0＜CtTm83.3±0.9附錄A（資料性）引物引物名稱和序列見表A.1。表A.1引物名稱和序列引物名稱引物序列（5′—3′）豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT豬瘟病毒強毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT豬瘟病毒強毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA注：引物用DEPC水溶解并稀釋至100μmol/L10μmol/L保存供檢測使用。附錄B（資料性）熒光RT-PCR反應體系配制RT-PCRB.1表B.1RT-PCR試劑1個檢測反應的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5ExTaqHS（5U/μL）0.5豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物1.0豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物1.0RNaseFreedH2O7.5試樣溶液2.0uL總體積25.0μLRT-PCRB.2表B.2豬瘟病毒強毒熒光RT-PCR反應體系試劑1個檢測反應的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5ExTaqHS（5U/μL）0.5豬瘟病毒強毒上游引物1.0豬瘟病毒強毒下游引物1.0RNaseFreedH2O7.5試樣溶液2.0uL總體積25.0μL附錄C（資料性）豬瘟疫苗弱毒與豬瘟強毒溶解曲線分析圖豬瘟病毒疫苗弱毒熔解曲線分析見圖C.1。標引序號說明：1——豬瘟病毒疫苗弱毒；2——