第12章-免疫學技術(shù)與方法

第十二章

免疫學技術(shù)與方法1指利用抗原抗體反應(yīng)的特異性原理，建立各種檢測與分析技術(shù)以及建立這些技術(shù)的制備方法。分為：

免疫檢測技術(shù)（血清學技術(shù)）細胞免疫技術(shù)免疫制備技術(shù)免疫學技術(shù)2血清學技術(shù)的類型（免疫檢測技術(shù)）凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補體結(jié)合反應(yīng)免疫標記技術(shù)3指與細胞免疫有關(guān)的各種檢測技術(shù)，包括對免疫細胞、細胞因子的檢測及功能分析。細胞免疫技術(shù)淋巴細胞分離與檢測淋巴細胞功能測定細胞因子測定體內(nèi)細胞免疫試驗玫瑰花環(huán)試驗T細胞亞群檢測技術(shù)淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗細胞毒性T細胞試驗巨噬細胞移動抑制試驗白細胞介素測定干擾素測定皮膚試驗4免疫制備技術(shù)抗原制備抗體制備抗體和細胞因子純化淋巴細胞制備抗體標記與致敏指制備與免疫檢測有關(guān)的各種試劑，包括抗原制備、抗體制備及抗體標記等技術(shù)。5體內(nèi)殺菌、溶菌、調(diào)理、中和毒素免疫病理損傷—超敏反應(yīng)、免疫性疾病等體外：凝集、沉淀、溶細胞、中和毒素、補體結(jié)合等又稱：serologicalreaction血清學實驗第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理及特點6一、抗原抗體反應(yīng)的原理基本原理：特異性（epitopeHVR）可見性（凝集、沉淀、溶血等）結(jié)合力(4種)7高度互補（epitope-HVR）緊密接觸結(jié)合力抗原

抗體帶電離子異性相吸靜電引力分子極化范德華引力形成氫鍵氫鍵引力形成疏水基團疏水作用力作用最小最具特異性作用最大抗原抗體結(jié)合可見反應(yīng)比例合適8

結(jié)合力的大小

親和力（affinity）

親合力（avidity）9一個抗體結(jié)合點與一個抗原表位間的結(jié)合強度。（singlepoint－single

point)親和力用平衡常數(shù)表示：K=K1/K2親和力（affinity）：即：結(jié)合常數(shù)/解離常數(shù)

K值越大，親和力越高，與抗原的結(jié)合越牢固10親合力（avidity）指整個抗體分子與抗原之間結(jié)合的強度

(allpointsallpoints)

與抗體的結(jié)合價直接相關(guān)。親合力高，與抗原結(jié)合牢固不易解離。11二、抗原抗體反應(yīng)的特點（一）特異性（specificity）概念：一種抗原只能與其相應(yīng)的抗體結(jié)合起反應(yīng)Ag-epitopeHVR-Ab空間結(jié)構(gòu)高度互補意義檢測時常用已知Ag檢測未知Ab

，或反之。相對性：當抗原之間有相同或相似結(jié)構(gòu)的epitope時（共同抗原）交叉反應(yīng)（crossreaction）分子基礎(chǔ)：12（二）比例性

(proportionality)指抗原抗體的量比關(guān)系，即只有當抗原抗體的濃度比例適當時，才出現(xiàn)可見反應(yīng)。1929年Heidelberger以固定Ab量逐漸增加Ag量的試驗發(fā)現(xiàn)帶現(xiàn)象。1977年Green把此現(xiàn)象稱為鉤狀效應(yīng)（hookeffect），包括前后帶現(xiàn)象。指免疫檢測中由于抗原、抗體濃度比例不合適而致檢測結(jié)果呈假陰性的現(xiàn)象。13抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖141、帶現(xiàn)象:在抗原抗體反應(yīng)等價帶前后,由于抗體或抗原過量,上清液中可測出游離的抗體或抗原,形成的沉淀物少,不出現(xiàn)可見反應(yīng),這種現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象2、等價帶:抗原抗體反應(yīng)曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍,稱為抗原抗體反應(yīng)的等價帶。在此范圍內(nèi),抗原抗體充分結(jié)合,沉淀物形成快而多。3、前帶現(xiàn)象:抗體量過剩時,不出現(xiàn)可見反應(yīng)。4、后帶現(xiàn)象:抗原量過剩時,不出現(xiàn)可見反應(yīng)。15抗體的兩個Fab段分別結(jié)合兩個epitope，相互交叉結(jié)合連接成巨大的網(wǎng)格狀立體聚合物（可見）。網(wǎng)格學說16

Ab/Ag過剩過剩方的結(jié)合價得不到飽和，大多數(shù)游離存在，只形成小分子復(fù)合物（不可見）。17（三）可逆性（reversibility）解離1.Ag+AbAg-Ab一定條件（動態(tài)平衡）動態(tài)平衡公式:

[Ag]+[Ab][Ag-Ab]

K1:結(jié)合常數(shù)；K2：解離常數(shù)K1K218（四）階段性數(shù)秒～數(shù)分鐘，肉眼不可見數(shù)分～數(shù)小時肉眼可見兩個階段特異性結(jié)合可見反應(yīng)階段19（一）電解質(zhì)作用：中和膠體表面電荷，破壞水化層，使Ag-Ab聚集。

常用：0.85%生理鹽水，PBS、Ca2+、Mg2+等。鹽析（salting）即電解質(zhì)濃度過高引起的非特異性蛋白質(zhì)沉淀。三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素20（二）酸堿度Ag、Ab多為蛋白質(zhì)，具兩性電離特性，有固定的等電點，pH過高或過低均可影響Ag、Ab反應(yīng)一般：pH6～8為宜。注意：自凝——即pH達到或接近抗原的pI時，引起的抗原非特異性自身凝集現(xiàn)象。酸凝——pH過低時造成的蛋白質(zhì)自凝現(xiàn)象。21（三）溫度—影響反應(yīng)速度一般：15～40℃為宜，最適溫度：37℃,

過高（>56℃）:Ag-Ab解離，Ag、Ab變性。22免疫學檢測技術(shù)的評價標準Specificity（特異）：

檢測信號針對性和排他性Sensitivity（靈敏）：

可測出的最低含量Simplicity（簡便）：

操作是否方便Safety（安全）：

是否有污染，對操作者的傷害Saving（節(jié)約）：

性能/價格比23免疫檢驗技術(shù)發(fā)展進程的主要階段自然的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)）加速的肉眼觀察的抗原抗體反應(yīng)（電泳技術(shù)、分離技術(shù)）標記性免疫技術(shù)提高抗原抗體反應(yīng)的特異性、敏感性半自動、自動化檢驗儀器與免疫反應(yīng)原理結(jié)合，加快了反應(yīng)過程標記技術(shù)、單克隆技術(shù)、高智能自動化技術(shù)的最佳組合24抗原抗體反應(yīng)的基本類型表反應(yīng)類型實驗技術(shù)檢測方法敏感度沉淀反應(yīng)液相沉淀試驗觀察沉淀、檢測濁度+，++++

瓊脂凝膠擴散觀察掃描沉淀線或環(huán)+

凝膠電泳技術(shù)或峰或弧++補體參與反應(yīng)補體溶血試驗以裸眼或光電比色儀++

補體結(jié)合試驗觀察測定溶血現(xiàn)象+++免疫標記技術(shù)熒光免疫技術(shù)檢測熒光現(xiàn)象++++

放射免疫技術(shù)檢測放射性++++

酶標免疫技術(shù)檢測酶底物顯色++++

發(fā)光免疫技術(shù)測定發(fā)光強度++++

生物素-親合素技術(shù)結(jié)合其它標記技術(shù)++++

金標免疫技術(shù)檢測金顆粒沉淀++++凝集反應(yīng)

直接凝集試驗用裸眼、放大鏡或顯+

間接凝集試驗微鏡觀察紅細胞或膠++

凝集抑制試驗乳等顆粒和各種凝集+++

協(xié)同凝集試驗現(xiàn)象+++

抗球蛋白試驗+++中和反應(yīng)病毒中和試驗病毒感染性喪失+

毒素中和試驗外毒素毒性丟失++25一、凝集反應(yīng)（Agglutination）

顆粒性抗原（如細菌、細胞）與相應(yīng)抗體，在適當電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應(yīng)。第二節(jié)基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法26272、凝集反應(yīng)的用途（1）定性檢測

即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽性或陰性（2）定量檢測

即將標本作一系列倍比稀釋后進行反應(yīng)，以出現(xiàn)50%凝集的最高稀釋度作為滴度。凝集反應(yīng)方法簡便，敏感性高，臨床應(yīng)用廣泛。283、凝集反應(yīng)的分類玻片凝集反應(yīng)試管凝集反應(yīng)29（一）直接凝集試驗（Directagglutination）301、玻片凝集試驗312、試管凝集試驗32（二）間接凝集試驗

indirectagglutination33已知抗原檢測抗體已知抗體檢測抗原正向反向341、正向間接凝集反應(yīng)352、反向間接凝集反應(yīng)363、間接凝集抑制反應(yīng)374、協(xié)同凝集反應(yīng)（coaggoltination）38可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細胞裂解液或組織液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應(yīng)。二、沉淀反應(yīng)39

液相沉淀反應(yīng)凝膠擴散沉淀凝膠免疫電泳絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀單向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗血清免疫電泳火箭電泳對流免疫電泳免疫印跡等401、絮狀沉淀試驗操作步驟：（1）將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2）各管加入一定濃度的適量抗血清。（3）振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。（4）產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。絮狀沉淀試驗方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，目前多用以測定抗原抗體反應(yīng)的最適比。（一）液相沉淀反應(yīng)412、環(huán)狀沉淀試驗操作步驟：（1）用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免產(chǎn)生氣泡。（2）將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（3）置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應(yīng)用：主要用于抗原的定性試驗。用已知抗體來檢測未知抗原。

（診斷炭疽的Ascoli實驗、細菌分型、血跡鑒定）。

423、凝膠擴散沉淀凝膠擴散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴散部位相遇形成沉淀線的反應(yīng)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為：①單向瓊脂擴散試驗②雙向瓊脂擴散試驗43（1）單向瓊脂擴散試驗原理：1％～2%的瓊脂凝膠形成網(wǎng)狀構(gòu)架，空隙中是98％-99%的電解質(zhì)溶液。凝膠網(wǎng)孔較大，允許分子量在200kD以下甚至更大些的大分子物質(zhì)通過，絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體的分子量在200kD以下，因此可以在瓊脂凝膠中自由擴散，所受阻力甚小。二者在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處發(fā)生沉淀，此沉淀物因顆粒較大而不擴散，故形成沉淀帶。

44單向免疫擴散試驗示意圖環(huán)的直徑與抗原含量成正相關(guān)45（2）雙向免疫擴散試驗雙向免疫擴散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散時，在兩孔間可出現(xiàn)沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。46473、免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。兩大優(yōu)點：

一是加快了沉淀反應(yīng)的速度二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等

48（1）血清免疫電泳將抗原混合物在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進行雙向擴散。沉淀線的特點顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加。4950(2)對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)是將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)51（3）火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實質(zhì)上是加速度的單向擴散。52是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。

經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（如NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的蛋白成分。廣泛應(yīng)用于檢測蛋白的表達。

（4）免疫印跡westernblot53kDaM123456907560402554免疫標記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標記物標記抗原或抗體所進行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標記技術(shù)既可對樣品作定性、定量檢測，也可進行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學檢測技術(shù)。四、免疫標記技術(shù)55常見標記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)化學發(fā)光免疫技術(shù)免疫膠體金技術(shù)免疫印跡技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

56抗體制備多克隆抗體單克隆抗體標記物與標記方法放射性同位素、酶、熒光分子、化學和生物發(fā)光系統(tǒng)免疫分析基本環(huán)節(jié)57分析方式設(shè)計

非競爭方式、競爭方式；

直接法、間接法；

標記抗原、標記抗體；

均相、非均相信號檢測

與相應(yīng)的標記物對應(yīng)。主要為分光光度法、

熒光光度法、化學發(fā)光檢測法。58是用放射性核素作為標記物標記抗原或抗體所進行的抗原抗體反應(yīng)，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度（pg）和自動化檢測等特點，因此在實驗研究和臨床檢測中仍被廣泛應(yīng)用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技術(shù)59放射免疫分析－基本原理競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力60

Ag*AbAg

標記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab

和游離Ag*從標準曲線上讀知含量

測定Ag*-Ab和游離Ag*放射性

放射免疫測定法(RIA)示意圖61將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）標記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。2.免疫熒光技術(shù)62免疫熒光技術(shù)——直接法AgY熒光素標記的特異性抗體組織切片或細胞63免疫熒光技術(shù)——間接法AgYY熒光素標記的抗抗體組織切片或細胞待測抗體64免疫熒光染色顯示細胞骨架

免疫熒光染色是利用抗原－抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)熒光染料標記的抗體對細胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進行定性或定量研究的方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對特定的蛋白質(zhì)進行細胞或組織內(nèi)的精確定位。常用于抗原、抗體標記的熒光染料有以下幾種：顯示綠色熒光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：RhodamineB（羅丹明）,TexasRed,Alexa-546,568,594顯示藍色熒光：Alexa－350,DAPI

用Alexa488標記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細胞核:紅色,人皮膚角化細胞免疫熒光染色653、免疫酶技術(shù)概念：是用酶標記的抗體進行的抗原抗體反應(yīng)。將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。66優(yōu)點：⑴靈敏度高，可與放射免疫相比，檢測能力可達ng水平。⑵應(yīng)用范圍廣，既能檢測抗體又能檢測抗原，既能定性又能定量、定位。⑶不需要特殊設(shè)備，放射免疫需要特殊的實驗室條件，免疫熒光法需要熒光顯微鏡。⑷酶標記物有效時間較長，一般低溫保存可達一年以上。67⑴活性高，分解底物的能力強。⑵特異性強，即作用于底物的專一性強。⑶與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。⑷與底物作用可以顯色。⑸純度高、易純化。⑹可溶性(水溶性)好，在溶液中穩(wěn)定。⑺測定方法簡單。⑻來源廣、價格低。標記酶的選擇條件：

68酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶（HRP）鄰苯二胺（OPD）

3、3‘二氨基聯(lián)苯胺（DAB）

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

420以HRP最為常用，具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點。6970酶聯(lián)免疫吸附試驗Enzymelinkedimmunosorbent

assay簡稱：ELISA1971年Engvall和Perlmann發(fā)表是一類在固相載體上進行免疫酶染色的免疫酶標記技術(shù)711）基本原理與類型一種固相免疫測定技術(shù)，先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測定時，將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，后加入酶標抗體與免疫復(fù)合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分，最后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進行定性或定量分析的方法。72

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。73①

雙抗體夾心法測抗原檢測抗原最常用的方法此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。用抗體包被固相載體加入抗原Sample(二價以上)，溫育加入酶標抗體，溫育加入底物，顯色74②

雙抗原夾心法測抗體

用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定。乙肝標志物中抗HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標記方法。Ag固相載體酶標抗原75③

間接法測抗體

檢測抗體最常用的方法間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標二抗建立檢測相應(yīng)抗體的方法。76用已知特異性抗體包被固相載體測定孔加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合對照孔只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結(jié)合分別洗滌除去未結(jié)合的成分加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標本中待測抗原含量④競爭法77⑤捕獲包被法測IgM抗體IgM的檢測常用于傳染病的診斷，尤其用于病毒性感染的早期診斷?？谷薎gM抗體連接在固相載體形成固相抗人IgM加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在（陽性反應(yīng)）78⑥

ABS-ELISA法（親和素-生物素系統(tǒng)-酶聯(lián)免疫吸附試驗）ABS：親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system）①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG

抗體（Biotin）；⑤：HRP酶標鏈親和素（Avidin）；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；79親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。生物素與親和素的結(jié)合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個親和素可與4個生物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA法結(jié)合起來可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標抗體（抗原）。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應(yīng)用不多?？蒲许椖恐袡z測微量的成分如細胞因子常用本法。802）ELISA的一般操作方法81ELISA試劑盒8283848586共同特點：象搭積木一樣在固相載體上一層一層疊加87888990914、免疫膠體金標記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種免疫標記技術(shù)；膠體金是由氯金酸在還原劑(如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等)作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。膠體金的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化。92膠體金是氯金酸(HAuCl4)的水溶膠顆粒，具有高電子密度，在電鏡中顆粒致密，易于辨認，定位比酶反應(yīng)物精確。93早孕試紙條：兩條杠，檢測迅速，靈敏度高94膠體金快速診斷技術(shù)的特點

簡捷快速：操作簡單，一般只要5-10min就會出結(jié)果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要時間更長。結(jié)果易于判定：陰、陽性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。特異性好：用單克隆抗體標記，具有很好的特異性。95單個核細胞的分離

淋巴細胞亞群的分離T細胞功能檢測B細胞功能檢測種類免疫細胞及其亞類分離、鑒定和檢測淋巴細胞功能測定

T細胞的鑒定和檢測B細胞的鑒定和檢測第三節(jié)

檢測淋巴細胞及其功能的體外試驗96一、細胞分離原理1、基于細胞的物理特性

1）細胞比重差異

2）細胞的粘附性

3）細胞對滲透壓改變的敏感性2、基于細胞表面的特異性標志物

1）免疫磁珠分離法

2）流式細胞術(shù)973、血液細胞的組成及比重外周血紅細胞粒細胞單個核細胞血小板淋巴細胞單核細胞1.0931.030~1.0351.075~1.0901.09298

原理：外周血各種血細胞的比重不同，利用淋巴細胞分層液作密度梯度離心，使一定比重的細胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。一）單個核細胞分離密度梯度離心法二、細胞分離方法99離心后PBMC紅細胞粒細胞Ficoll/60%Percoll稀釋外周血稀釋的血漿、血小板Ficoll/60%Percoll100二）淋巴細胞亞群的分離尼龍棉分離法E花環(huán)分離法洗淘法流式細胞術(shù)混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細胞、漿細胞、單核細胞被選擇性粘附于尼龍毛上，多數(shù)T細胞則通過尼龍毛柱人T細胞與SRBC結(jié)合形成E花結(jié)，經(jīng)密度梯度離心，花結(jié)形成細胞沉于管底；用低滲裂解花結(jié)中的SRBC即獲得T細胞。將已知抗特定標志的抗體包被培養(yǎng)板，加入淋巴細胞懸液，相應(yīng)的細胞即結(jié)合于培養(yǎng)板表面，與懸液中的其他細胞分離。借助流式細胞儀對細胞快速鑒定和分類、并進行多參數(shù)定量測定和綜合分析的技術(shù)。磁珠分離將特異性抗體與磁性微粒交聯(lián)，與表達相應(yīng)膜抗原的細胞結(jié)合，應(yīng)用強磁場分離所吸附的細胞，從而對特定的細胞進行分選101流式細胞術(shù)概念:流式細胞儀

(flowcytometer,FCM)：是集光電子物理，光電測量，計算機，細胞熒光化學，單抗技術(shù)為一體的高科技細胞分析儀。流式細胞術(shù)

(flowcytometry)：利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。又稱熒光激活細胞分選儀分離法（FACS）102機型1.分析型流式細胞儀：

檢測標記細胞的百分比含量。同時檢測四色不同染色的細胞。2.分選型流式細胞儀：

無菌獲取陽性細胞，以進一步培養(yǎng)。同時獲取四色不同染色的細胞。流式細胞術(shù)可以同時鑒別單個細胞上的多種抗原，而且可以在極短時間內(nèi)分析大量細胞。103流式細胞儀的工作原理光學系統(tǒng)

激光光源 光收集系統(tǒng)液流系統(tǒng)

流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)電子系統(tǒng)

光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)104特點

1、各種組織細胞均可用于分析，如血液、骨髓、體液中的細胞、培養(yǎng)細胞等，實體組織經(jīng)處理后制成單細胞懸液均能分析。2、測量速度快，每分鐘能測量數(shù)千至數(shù)萬個細胞。3、可進行多參數(shù)的分析，可同時檢測四種不同熒光染色的細胞。新一代的流式可同時檢測十多色的細胞。4、可將目的細胞無菌分選出來做進一步的培養(yǎng)。105三、淋巴細胞的功能檢測淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。體內(nèi)實驗主要是間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定。

106(一)T細胞功能的檢測T細胞增殖試驗T細胞分泌功能測定T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗體內(nèi)試驗1071、T淋巴細胞增殖試驗1）原理：T淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松1082）淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：

PHAT細胞

ConAT細胞

PWMT、B細胞

LPSB細胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原1093）檢測方法

形態(tài)法：刺激物淋巴細胞（4-6天）母細胞化同位素法：PHA淋巴細胞

DNA合成期+3H-TdR摻入

收集細胞

檢測β射線

測定細胞內(nèi)的3H－TdR110形態(tài)學檢查法111原理：活細胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將噻唑鹽（MTT）由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{紫色的甲臜，甲臜的形成量與細胞增殖程度有關(guān)，與活細胞數(shù)成正比。甲臜溶于有機溶劑（DMSO、乙醇等）后，可在560nm波長下用酶標儀檢測。MTT法簡單快速、準確，廣泛應(yīng)用于疫苗免疫效果測定、新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。MTT法112培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性MTT測吸光度1132、T