血液學檢驗實驗指導

血液學檢驗實驗指導

實驗一、活化凝血時間測定

【實驗原理】同試管法CT測定。試驗中加入白陶土-腦磷脂的懸液以充分激活因子刈

和XI,并為凝血反應提供豐富的催化表面，故稱為活化凝血時間(ACT)；還可以避免因接觸

激活階段的不同結果帶來的影響，從而提高了本試驗的敏感性和重復性。

【試劑】

1.腦磷脂的制備腦磷脂是將兔腦粉中的組織凝血活酶除去參與外源凝血途徑的蛋白

部分后所得的磷脂，故又稱部分凝血活酶。取干燥兔腦粉L2g加25ml丙酮，放置2h后過

濾，將此兔腦粉加氯仿25ml,連續(xù)震蕩2h,以濾紙過濾，濾液蒸發(fā)后為淡黃色蠟狀物，刮

入玻璃研缽中，加12ml生理鹽水研磨成均勻乳劑，以每安瓶0.25ml分裝。

2.4%白掏土懸液白陶土2g加入50ml生理鹽水中，室溫保存，用前搖動。

3.4%白陶土-腦磷脂懸液將腦磷脂用巴比妥緩沖液作1：50稀釋后，再加等量4%白

陶土懸液混合而成。4℃可保存3天，用時充分混合。

4.巴比妥緩沖液巴比妥鈉11.75g、NaC114.67g、0.Imol/L的HC1430ml,加蒸饋水

至2000ml。此緩沖液pH應為7.3,否則影響試驗穩(wěn)定性。

【操作方法】

1.在含4%白陶土-腦磷脂懸液0.2ml的試管中注入受檢全血0.5,輕輕混勻。

2.其余操作同試管法CT測定。

【參考值】1.70+0.76(1.14~2.05)min?

【臨床意義】

1.同試管法CT測定，但較其敏感，重復性也較好，可檢出因子VID：C小于45%的亞臨

床型血友病。

2.是監(jiān)測體外循環(huán)肝素用量的良好指標之一。

實驗二、血漿游離血紅蛋白測定(鄰一甲聯(lián)苯胺法)

【實驗原理】鄰一甲聯(lián)苯胺在酸性溶液中和過氧化氫與血紅蛋白共同作用生成氧化型

聯(lián)苯胺，產生綠色一藍色一紫色，其顏色的深淺與血漿游離血紅蛋白的含量呈正相關。

【試劑】

1.2g/L鄰一甲聯(lián)苯胺溶液稱取鄰一甲聯(lián)苯胺0.2g,溶于冰醋酸601nl，加蒸儲水至

100ml,置于棕色瓶內于冰箱保存，色變暗應重配。

2.通過氧化氫溶液用30%過氧化氫原液新鮮配制。

3.10%冰醋酸溶液。取10ml冰醋酸，加蒸偲水至100ml。

4.血紅蛋白應用標準液將血紅蛋白貯存液用生理鹽水稀釋成10mg/100ml備用。

5.抗凝試管取0.2ml100U/ml肝素于試管內，在80c以下烘干，每管可抗凝2ml全

血。

【操作方法】

1.將抗凝全血分離血漿。

2.取試管3支，分別標明測定、標準和空白，分別加入血漿、應用標準液，再向

各管中分別加入鄰一甲聯(lián)苯胺溶液及1%過氧化氫溶液各L0ml,充分混勻，放置lOmino

3.于上述3支試管內分別加入10%冰醋酸溶液10ml混勻，用435nm波長比色，以空白

調“0”，讀各管吸光度。

4.計算:

測定管吸光度

游離Hb(mg/L)X100

標準管吸光度

【質量控制】

1.一切容器均應避免血紅蛋白污染，標本勿溶血，否則可引起假陽性。

2.過氧化氫溶液濃度要準，新鮮配制。

3.聯(lián)苯胺醋酸的含水量不能低于15%和超過30%,否則均可引起吸光度降低。

4.標準液的加入量一定要準。

【參考區(qū)間】＜40mg/L

【臨床意義】血漿游離血紅蛋白含量增加是血管內溶血的特征。血漿中血紅蛋白含量

超過與血清中結合珠蛋白的結合能力時，其含量即可升高。微血管內溶血時，血漿游離血幻：

蛋白含量均明顯升高。PNH為200?2500mg/L,輸不合血型后為150?5000mg/L。溫抗體型

自身免疫性溶血性貧血、鐮狀細胞貧血及地中海貧血時血漿游離血紅蛋白可輕度或中度增

加。血管外溶血則正常。

實驗三、血清結合珠蛋白測定(比色法)

【實驗原理】血清結合珠蛋白(Hp)是肝臟產生的a2糖蛋白，它與游離的血紅蛋白

(Hb)具有特殊的親合力，可形成穩(wěn)定的Hb-Hp復合物，后者在弱酸性(pH4)條件下，具

有過氧化物酶的活性，測其活性可間接反映Hp的含量。

【試劑】

1.乙酸緩沖液0.2mol/L(pH4)稱取乙酸鈉(NaAC?3H20)2.8g,冰乙酸5.7ml溶解,

加蒸儲水至500mlo

2.0.1%(V/V)愈創(chuàng)木酚溶液取1ml愈創(chuàng)木酚溶液于500ml乙酸緩沖液中，加蒸儲

水至1000ml,,

3.0.3%過氧化氫溶液臨用前配制。

4.0.5g/L高鐵血紅蛋白液。

【操作方法】

1.取靜脈血分離血清，避免溶血。

2.取受檢血清0.4ml,與等量高鐵Hb溶液混合。

3.取上述混合液0.2ml,加入于已預溫（25℃）的愈創(chuàng)木酚5ml溶液中，再加入0.5ml

0.3%過氧化氫，于25℃水浴內作用8min,注意避光。每份標本均應雙份同時測定。

4.用蒸鐳水調“0”點，440nm處讀取吸光度。

5.由校正曲線查出受檢血清中Hp含量。

【質量控制】

1.受檢血清要避免溶血。

2.電泳時溫度不能過高，應把電泳槽置于冷水中電泳。否則電泳效果差，區(qū)帶不易區(qū)

分。

3.電泳液應經常更換，防止因pH及離子強度改變對電泳效果的影響。

【參考區(qū)間】0.2?1.9gHb/L。

【臨床意義】Hp可與Hb結合，以除去血循環(huán)中游離的Hb。各種溶血性貧血，無論血

管內溶血還是血管外溶血，血清中即含量均明顯降低，甚至測不出。Hp降低的程度與溶血

程度呈正相關，即溶血越嚴重，血清Hp越低。如果血管內溶血超出Hp的結合能力，即可出

現(xiàn)血紅蛋白尿。動態(tài)監(jiān)測表明，急性溶血開始，血循環(huán)中游離Hb即迅速增加，隨著Hb-Hp

復合物的有效清除，血清Hp也隨之恢復正常，因此血清Hp與游離Hb同時測定對溶血性貧

血的診斷及療效觀察均具有重要意義。肝病、傳染性單核細胞增多癥和先天性無Hp血癥，

Hp亦降低，故診斷溶貧時應除外上述疾患。感染、創(chuàng)傷、腫瘤、肝外阻塞性黃疸及類固醇

激素治療時Hp可增加，這些情況下Hp正常也不能除外溶血。

醋纖膜電泳有助于區(qū)別血管內抑或血管外溶血。各種溶血性貧血患者Hp均顯著減少，

甚至缺如，故電泳后無HbTIp區(qū)帶，而僅有一條未結合的11b區(qū)帶。但顯著血管內溶血（如

PNH）時，還出現(xiàn)一條高鐵血紅素白蛋白區(qū)帶，而血管外溶血（如球形紅細胞增多癥）則無

此區(qū)帶。

實驗四、尿含鐵血黃素試驗（Rou'stest）

【實驗原理】含鐵血黃素中的高鐵離子（Fe“）在酸性環(huán)境中與亞鐵氟化鉀作用，生成

藍色的低鐵氟化鐵，稱為普魯氏藍反應。

【試劑】

1、20g/L亞鐵氟化鉀水溶液，用時新鮮配制。

2、3%鹽酸。

【操作方法】取新鮮尿5ml離心沉淀，棄去上清，于沉淀中加入試劑①和②各1ml,

混勻。置室溫lOmin,再離心沉淀，取沉淀物顯微鏡檢查。

【結果判斷】如見到有分散或成堆藍色顆粒(直徑約1?3口m)即為陽性。存在于細

胞內更為可信。

【質量控制】所用試管、玻片、試劑均應防止鐵劑污染，否則出現(xiàn)假陽性。每次試驗

應做陰性對照。如兩種試劑混合后即顯深藍色，提示試劑污染高鐵，不宜使用。晨尿陽性率

較高。

【臨床意義】血漿游離血紅蛋白經腎小球濾出后，被腎小管上皮細胞吸收、降解，最

后形成含鐵血黃素，貯存于細胞內。當細胞脫落隨尿排出，即成為含鐵血黃素尿。正常為陰

性。陽性主要見于慢性血管內溶血，尤其以PNH為多見。即使無血紅蛋白尿時也可呈陽性。

但陰性結果也不能完全排除血管內溶血，因含鐵血黃素顆粒的直徑需＞1Pm時才能從鏡下見

到。急性血管內溶血時，雖可有血紅蛋白血癥和血紅蛋白尿，但還不能形成足夠大的含鐵血

黃素顆粒，需在數日后才陽性，并可持續(xù)數周。

實驗五、紅細胞滲透脆性試驗

【實驗原理】紅細胞在低滲鹽水中，水分透過細胞膜內滲，使之膨脹破壞而溶血。本

試驗是測定紅細胞對不同濃度低滲鹽水的抵抗力，以鑒別某些與紅細胞形態(tài)有關的溶血性貧

血。紅細胞對低滲鹽水的抵抗力與其表面積和體積的比值有關，厚度越大，該比值越小，即

滲透脆性越大；反之，脆性越小。以濃度為橫坐標，溶血度為縱坐標繪制曲線，找出50%溶

血對應的鹽濃度，即紅細胞中間脆性(MCF),后者較敏感。

【試劑】171mmol/LNaCl(10g/L)溶液：將100C烘干的分析純氯化鈉1.0g置于100ml

容量瓶中加少量蒸儲水溶解后，再加蒸儲水至刻度處。

【操作方法】取12支試管，按5-1分別加入10g/LNaCl和蒸儲水。

表5-1紅細胞滲透脆性試驗操作表(國際單位制)

試管號123456789101112

10g/LNaCl(ml)1.71.61.51.41.31.21.11.00.90.80.70.6

蒸儲水(ml)0.80.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.9

NaClSIg/L6.86.46.05.65.24.84.44.03.63.22.82.4

制mmol/L116.3109.4102.695.888.982.175.268.461.654.747.941.0

濃度舊制(%)0.680.640.600.560.520.480.440.400.360.320.280.24

然后各管立即加入新鮮靜脈血各1滴并從低濃度到高濃度逐管顛倒混勻，室溫靜置。

【結果判斷】靜置室溫2h,觀察結果，從高濃度開始，上清液呈透明紅色而管底有

紅細胞者為開始溶血管：溶液透明紅色，管底完全無紅細胞者為完全溶血管。

【質量控制】

1.NaCl溶液濃度要準確，故應干燥精稱。

2.注射器和試管必須清潔干燥。

3.應用新鮮靜脈血，忌用抗凝血，必要時可用去纖維蛋白血或肝素抗凝血。

4.結果不易判斷時可離心后觀察。

5.黃疸病人開始溶血不易觀察，嚴重貧血紅細胞太少時均可用等滲鹽水將紅細胞

洗滌后再配成50%紅細胞懸液進行試驗。

6.每次試驗均應做正常對照，與被檢血相差0.4g/L,即有臨床意義。

【參考區(qū)間】開始溶血：71.8-78.6mmol/L(4.2-4.6g/L)

完全溶血:47.8~54.7mmol/L(2.8-3.2g/L)

中間脆性:68.5—76.2mmol/L

【臨床意義】患者比正常對照高6.8mmol/L或中間脆性＞76.2mmol/L有診斷價值。

脆性增加：見于遺傳性球形紅細胞增多癥，也見于自身免疫性溶血性貧血伴球形紅細胞

增多者。

脆性降低：見于缺鐵性貧血，各型地中海貧血，HbC、D、E病，脾切除術后及阻塞性黃

疸等.

實驗六、酸溶血試驗(Ham'stest)

【實驗原理】正常人紅細胞在酸化(pH6.6~6.8)的自身新鮮血清中(內含補體和備

解素)，經37℃孵育lh不溶血。而陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)患者，因紅細胞膜缺陷，

對補體溶血效應敏感性增強，則發(fā)生溶血。

【試劑】

1.0.2mol/LHClo

2.8.5g/LNaCl溶液。

【操作方法】

1.配制50%紅細胞懸液取10ml離心管2支，標明患者、對照，均加入8.5g/LNaCl

溶液5?6ml,分別加入患者和對照者未梢血十幾滴，混勻，離心后棄去上清，如此重復洗

滌紅細胞2次，最后配成50%紅細胞懸液備用。

2.分離正常對照血清取與患者同型或AB型血3?5ml,待自然凝固后分離血清。

3.按表6T操作。

表6-1酸溶血試驗操作表

正常對50%紅細胞0.2mol/L

管別孵育

照血清懸液(ml)HCl(ml)

患者對照

試驗管0.50.0250.0537℃

對照管0.50.0250.05水溶Ih

【結果判斷】試驗管溶血，對照管不溶血為陽性；試驗管和對照管均不溶血為陰性。

【質量控制】

1.血清酸化后試管必須塞緊，否則co?逸出使血清酸度降低。

2.抗凝劑中的Na、K可影響pH,故不宜用抗凝血，但可用脫纖維血。

3.為保證補體充足，最好用混合血清，但正常對照紅細胞必須用“0”型血。

4.多次輸血者，可因血中異常加細胞相對減少，本試驗可呈弱陽性或陰性。

【臨床意義】正常人為陰性。陽性見于PNH。遺傳性球形紅細胞增多癥及自身免疫性溶

血性貧血也可呈陽性。主要與紅細胞球形化有關。血清加熱破壞補體，若本試驗轉為陰性則

更支持PNH。

實驗七、蔗糖溶血試驗

【實驗原理】低離子強度的等滲蔗糖溶液，在溫育條件下可促進補體與紅細胞膜的

結合，使紅細胞對補體損傷的敏感性增強而導致溶血。

【試劑】92.4g/L蔗糖溶液。

【操作方法】取新鮮抗凝血（枸椽酸鹽或草酸鹽抗凝）0.5ml加入4.5ml蔗糖溶液中，

混勻，置37℃孵育箱內30min后離心，上清液呈紅色為陽性，無色為陰性。

【質量控制】注射器、試管應清潔干燥，避免溶血。無蔗糖可用10%葡萄糖代替。

【臨床意義】正常人為陰性。陽性見于PNH。本試驗較Ham試驗敏感，是PNH診斷的篩

選試驗，但特異性較差。再障-PNH綜合征、巨幼紅細胞性貧血、自身免疫性溶血性貧血也

可呈陽性。本試驗最好與Ham試驗同時操作，用正常血清代替患者血清做試驗，可除外患者

補體異常所致的假陰性。

實驗八、熱溶血試驗

【實驗原理】利用患者的紅細胞和自身新鮮血清（含補體），經37℃孵育后，由于葡萄

糖分解產酸，使有內在缺陷的紅細胞溶解而溶血。

【操作方法】抽取靜脈血取下針頭，沿管壁緩緩注入小試管內，避免產生氣泡,

置37℃孵育箱保溫24h,取出后離心。上清呈紅色（溶血）為陽性。

【質量控制】注射器要干燥，小試管要清潔，操作過程中避免溶血，防止出現(xiàn)假陽性。

孵育24h血塊未回縮者，可用小玻棒沿管壁輕輕分離，然后離心，觀察結果。

【臨床意義】正常人為陰性。陽性見于PNH,其他溶血性貧血亦呈陽性，但陽性率比PNH

為低。本試驗用于PNH的篩選。

實驗九、高鐵血紅蛋白還原試驗

一、比色定量法

【實驗原理】6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)在戊糖旁路中使6-磷酸葡萄糖轉變?yōu)?-

磷酸葡萄糖酸，同時催化氧化型輔酶II(NADP)形成還原型輔酶II(NADPH),再使氧化型

谷胱甘肽(GSSG)形成還原型谷胱甘肽(GSH)。NADPH是高鐵血紅蛋白還原酶的輔酶，在遞

氫體美蘭和高鐵血紅蛋白還原酶的作用下，使暗褐色的高鐵血紅蛋白還原為紅色的血紅蛋

白。當紅細胞內G6PD含量不足或缺乏時，高鐵血紅蛋白還原速度減慢，甚至不能還原。

【試劑】

1.12.5g/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液亞硝酸鈉1.25g,葡萄糖5g,加蒸儲水至100ml。

置棕色瓶內4°C下可保存1個月。

2.0.0004niol/L美藍溶液美藍15mg放乳缽中，加少量蒸儲水研磨后過濾，再加蒸儲

水至100ml。室溫可保存1?2個月。

3.0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)取NazHP0"229.5mg,KH2Pol52.2mg,加蒸儲水

至100mlo

【操作方法】

1.靜脈采血L5-2.0mL加入含有38g/L枸椽酸鈉抗凝劑的小瓶內(血:抗凝劑=9:1),

再加葡萄糖20mg搖勻。

2.取血液1.0ml,加亞硝酸鈉-葡萄糖溶液和美藍溶液各0.05ml,顛倒混合12次，使

與空氣中的氧充分接觸。加塞，37±0.5工水浴(或孵箱)保溫3h。

3.取出后搖勻，取0.1ml加于10ml磷酸鹽緩沖液中溶解，2min后于波長635nm處(或

紅色濾光板)比色，用蒸儲水作空白，測其吸光度(A)。

4.另取原血液0.1ml,按上法加緩沖液溶解后比色，測其吸光度(B)o再于此液中加

亞硝酸鈉-葡萄糖液1滴，搖勻,5min后比色，測其吸光度(S).

【計算】

A-B

高鐵血紅蛋白還原率臟(1----------)X100

S-B

【參考區(qū)間】高鐵血紅蛋白還原率＞75%(比色法)

【質量控制】

1.紅細胞比積低于30%時，高鐵血紅蛋白還原率顯著降低，必須調整紂細胞與血漿的

比例。

2.本試驗抗凝劑若用ACD保養(yǎng)液時，該保養(yǎng)液與血液之比為0.15:1。該抗凝血可保存

1周。因草酸鹽具有還原性，不宜使用。

3.標本不應有凝塊或溶血，以免影響測定結果。

4.測定吸光度時，分光光度計的波長應準確。一般要求S比B大8倍以上。

【臨床意義】

本試驗用于G6PD缺乏癥的過篩檢查，蠶豆病和伯氨喳琳型藥物溶血性貧血患者，由于

G6PD缺陷（隱性遺傳），高鐵血紅蛋白還原率明顯下降。雜合子型多在74%?31%之間，純合

子型常在30%以下。

二、細胞化學法

【實驗原理】紅細胞內血紅蛋白可被亞硝酸鈉氧化為高鐵血紅蛋白，后者可經美蘭還

原為血紅蛋白；G6PD缺乏時則高鐵血紅蛋白不被還原。加入氟化物后形成氟化高鐵血紅蛋

白，易被過氧化氫洗脫，染色后形成空影紅細胞。正常的紅細胞，氧合血紅蛋白的過氧化酶

活性，不被氟化物抑制，阻止了枸椽酸鹽的洗脫作用，保證紅細胞的正常形態(tài)。

【試劑】

1.反應試劑取0.0004mol/L美藍溶液1mL12.5g/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液0.5ml,

生理鹽水8.5ml,混勻。此液于冰箱中可放置1周。

2.0.4mol/L氟化鈉（或氟化鉀）。

3.洗脫液95%酒精40.0ml,0.2mol/L枸椽酸8.0ml,30%H@2.5ml,混勻。

4.固定液甲醇

5.染液5g/L蘇木素液，4g/L伊紅液。

【操作方法】

1.取ACD抗凝血0.05ml,置于預先盛有0.05ml反應試劑之小試管中，搖勻，放37c

水浴（或孵箱）中保存4h。

2.取出后用滴管輕輕吸去上清液，于剩下的紅細胞中加入0.4mol/L氟化鈉0.005ml（細

破棒蘸起一小滴），搖勻。

3.5min后加入1滴患者血漿（或AB型血漿），用滴管混勻，取出1滴作薄涂片，待干。

4.將玻片放入盛有洗脫液的染色缸內，上下移動Imin,再靜置于液中2?4min,取出

后甲醇固定半分鐘，水沖洗，待干。

5.用蘇木素染2?3min,水沖洗，再以伊紅染l~4min水沖洗，待干。

6.在高倍鏡下觀察，計數1000個紅細胞（涂片四角及中央各數200個），算出G6PD

缺乏紅細胞（空影紅細胞）的百分率。

【質量控制】本法受洗脫液HQ2濃度的影響，因壓。2易分解，不易保存所需濃度，因

此使用過程中宜隨時補充少量上。2。補充的量依使用次數的多少、放置時間和室溫高低而定，

需憑經驗掌握，最好用陰性、陽性樣本對比試驗來確定。

【臨床意義】正常人空影紅細胞＜0.4%,G6PD嚴重缺乏者＞88.0%,雜合子0.4%~88%?

此法對于雜合子的檢出敏感性較高，但作為篩選法則過于繁瑣。

實驗十、變性球蛋白小體檢查

【實驗原理】氧化物質可使G6PD缺乏患者的紅細胞中積蓄多量的H2O2等氧化劑，使

血紅蛋白氧化變性。而與某些堿性染料（如煌焦油藍）或結晶紫孵育后形成藍黑色或紫黑色

顆粒定位于紅細胞內。

【試劑】用0.73%NaCl溶液配制成1%的結晶紫（龍膽紫）溶液。

【操作方法】滴1滴試劑于載玻片上，用玻棒或竹簽蘸一點患者血液于其上，混勻，

加蓋玻片，染5~10min后在高倍鏡下觀察。計算500個紅細胞中含變性珠蛋白小體紅細胞

的百分率。

含變性珠蛋白小體的紅細胞是在紅細胞中出現(xiàn)多個紫黑色、或細或粗、形狀不規(guī)則的顆

粒，位于細胞的邊緣或中央，血紅蛋白或仍均勻分布，或完全缺如。

【參考區(qū)間】正常人無變性珠蛋白小體，或偶見幾個（＜0.01）細小者。

【臨床意義】陽性見于G6PD缺乏癥患者（3%?82%）,隨著溶血的恢復逐漸減少或消

失。還見于不穩(wěn)定血紅蛋白病，呈單一的圓形或卵圓形粗大顆粒，附著于紅細胞膜或突出于

其外。另外，硝基苯、苯胺、苯朋等化學物質中毒者也可出現(xiàn)變性珠蛋白小體。

實驗十一、葡萄糖6-磷酸脫氫酶熒光斑點試驗

【實驗原理】在葡萄糖-6-磷酸（G6P）和NADP存在下，G6PD能使NADP還原成NADPII,

后者在紫外線照射下可發(fā)出熒光。

【試劑】混合劑的成分與配方如下：

0.Imol/LG6Plml

7.5mmol/LNADP1ml

0.7mol/LTris-HCl（pH7.8）3m1

8mmol/L氧化型谷胱甘肽1ml

lOg/L皂素2ml

蒸儲水2ml

此混合試劑分裝，置-20”C保存，可穩(wěn)定數月。

【操作方法】

1.取末梢血或抗凝血5?10u1,加入含100口1反應試劑的小試管中。亦可取血滴于

濾紙上,干后取直徑約為1cm的血跡剪碎,置含反應試劑的小試管中洗脫。

2.放37℃孵育lOmin。

3.取約10lU溶血液滴于新華濾紙上，晾干后立即用冷風吹干，在長波紫外線下觀察

結果。

【結果觀察】G6PD正常者可見明亮熒光，嚴重缺乏者無熒光，雜合子介于兩者之間

（弱熒光）。

【質量控制】

1.本法是直接測定NADPH的量，特異性較好。

2.每次或每批要有（G6PD）正常和缺陷者的標本作對照。

3.取血量以5?10u1為宜，正常者宜偏少，貧血者可偏多。

4.干血濾紙片存在其酶活性可損失，宜同時作正常對照血樣品。

5.加入GSSG是為了提高敏感性，因有殘余G6PD活性的標本（如雜合子），可產生少量

NADPH,若有足量的GSSG存在，則通過谷胱甘肽還原能的作用，再將其氧化為NADP。這樣

患者和正常紅細胞即可顯示明顯差別。不使用GSSG亦可，效果稍差，可將G6P-N@和NADP

濃度減半，血樣本用生理鹽水稀釋至1/4,孵育時間縮至3min,可減弱殘余酶活性的影響。

【臨床意義】正常人有很強的熒光。G6PD缺乏者熒光很弱或無熒光；雜合子型或某

些G6PD變異體者可有輕度或中度熒光，本試驗適用于大批量篩選，但不利于雜合子型的檢

出。

實驗十二、硝基四氮哩藍試驗

硝基四氯哇藍試驗（nitroblue-tetrazoliumtest）有定性試驗和G6PD活性定量測定兩

種。

一、定性紙片法

【實驗原理】NADPH通過吩嗪二甲酯硫酸鹽（M-PMS）的遞氫作用，使淡黃色的硝基

四氮唾藍（NBT）,還原成紫色的甲。G6PD缺乏時由于NADPH生成不足，不顯紫色。

【試劑】

1.0.25mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.4）稱取三羥甲基教基甲烷（Tris）7.6g,溶

于蒸儲水約100ml中,先加入lmol/HCl60mL然后用pH計調整pH至7.4,再加蒸儲水200m1。

在4℃可保存數月。

2.0.6g/LM-PMSM-PMS6mg加蒸儲水10ml溶解，加入0.01mol/LHC11小滴調整pH

至3.8左右。于棕色瓶內，暗處存放，可保存2周以上。如試劑由黃變綠，應重新配制。

3.3g/LNBTNBT15mg加蒸儲水5ml,在水浴中加熱至80K左右溶解,過濾。用棕色瓶

盛裝，可保存2周以上。

4.6.25mmol/LG6P-Na2稱取G6P-Na210mg,用Tris-HCl緩沖液4ml溶解。放0℃可保

存1個月以上。

5.6.25mmol/LNADP稱取NADP10mg（如用含70%的制品則稱14mg）,加Tris-HCl緩沖

液2ml溶解。放0"C可保存數月。

6.0.12mol/LMgCL稱取分析純MgCl2?6H202.10g溶于蒸儲水至100mLMg?'為G6PD

的激活劑。

7.反應試劑M-PMS0.1ml,NBT0.5ml,G6P-Na20.4ml,NADP0.1ml,MgCb0.1ml,

混合，當天配制。

8.對照試劑用等量Tris-HCl代替G6P-NaZ和NADP,余同反應試劑。

【操作方法】

1.取末梢血1滴，滴于干凈濾紙上，血跡直徑1.0cm左右，自然晾干（密封后4"C保

存，酶活性可維持5?7天）

2.用打孔機打出一小圓血跡紅片（直徑約5mm）,置于反應板的小孔內，加入蒸鐳水1

滴搖勻，靜置5min,待紅細胞完全溶解。

3.用6號半至7號注射針頭吸取反應試劑，在每個放置血紙片的小孔中央加入1滴，

輕輕混勻。加蓋，置37"C水浴箱中溫育10?30min。以對照試劑取代反應試劑作對照。

【結果觀察】正常酶活性者紙片變?yōu)樽纤{色；酶嚴重缺乏者仍為紅色；雜合子為淡紫

紅色。觀察時與對照孔比較看顏色的區(qū)別。

【質量控制】

1.血跡紙片放置時間長短對結果觀察為重要。如為新鮮血紙片，37"C5?lOmin能看

到結果，若放置數小時，則20?30nlin才現(xiàn)結果，故應在同一批標本相互比較。

2.緩沖液的pH要準確。

3.遇到酶缺乏或可疑標本，應用定量法來確證。

二、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性定量測定

【實驗原理】與定性紙片法相同。NADPH生成的量與甲生成的量在一定范圍內呈線

性關系，在分光光計波長650nm測定甲的吸光度，可反映NADPH生成的量，用以代表G6PD

活性。

【試劑】

1.反應試劑對照試劑及其各種組成液均與定性紙片法相同。

2.7mol/L尿素稱取分析純尿素210g,溶于蒸儲水至500ml（可微熱溶解），室溫保

存。

3.氯化高鐵血紅蛋白測定法試劑（Drabkin）NaHC03l.Og,K3Fe（CN）60.2g,KCNO.05g,

加蒸儲水至1000ml,置棕色瓶內暗處保存。

【操作方法】

1.取抗凝血（肝素或EDTA血需在12h內測定，ACD血在0?4（可保存至3天）0.1ml,

用生理鹽水洗滌紅細胞3次（2000r/min）,吸去上清液及白色層（為血小板及白細胞，如不

吸去則結果增高）。

2.紅細胞懸液內加入蒸鐳水3?4ml,（一般視其顏色深淺而定），使其溶血，混勻，靜

置lOmirio

3.取0.4ml溶血液，加入4.0mlDrabkin試劑,放置15min,用Drabkin試劑作空白,

光徑1cm,于540nm波長讀取吸光度（H）?

4.另取2只試管，每管準確加入溶血液0.1ml于管底。

5.于第一管中加對照試劑0.1ml,搖勻，放入37t0.5"C水浴中保溫，并立即用秒表記

錄時間。于第二管中加入反應試劑0.1ml,搖勻，待秒表行至30s時，放入水浴中保溫。

6.準確30min取出第一管，立即加入7moi/L尿素2.5ml,以終止反應。30s鐘后取出

第二管加入尿素2.5ml?

7.用分光光度計比色，光徑1cm,波長650nm,以第一管為空白，測定第二管吸光度（S）。

【計算】以每克Hb每分鐘吸光度變化值作為單位，即NBT單位（U）=AA/min/Hb（g）。

0.1ml溶血液中含Hb（g）

644584.411

=0.1XHXXXX

440.410001000

=HX0.00161

S1s

G6PD（U）="X=—X20.7

HXO.0016130H

【參考區(qū)間】：6.7~20.5U

中間缺乏值（雜合子）：1.7?6.6U。

嚴重缺乏值：低于L6U。

【質量控制】

1.試劑配制必須嚴格按照操作規(guī)程。反應試劑配制后放置24h,顯色反應明顯降低。

2.標本如不能及時測定，應保存于冰箱（0?4°C）。洗滌后的紅細胞，特別是溶血液不

能久置（4℃不能超過4h）。

3.緩沖液的pH,保溫溫度、時間及加入溶血液量都必須十分準確。

4.尿素的作用是終止酶促反應，并保持色澤澄明度。加尿素后應盡快比色（不超過lh）。

5.由于甲溶解度低，溶血濃度不宜過高，一般以吸光度0.300?0.400為宜。

6.由于使用的NBT不同，各實驗室最好建立自己的參考值。

7.Hb測定必須準確，應用HICN標準液校正所有儀器，測得的H值應先乘以校正系數

然后帶入計算公式。

實驗十三、丙酮酸激酶（PK）熒光斑點試驗

【實驗原理】由PK產生的丙酮酸作用于LDH,使其轉變?yōu)槿樗?，同時NADH轉變?yōu)镹AD\

在長波紫外線照射下NADH有熒光，NAD*無熒光，故反應后熒光逐漸消失。

【試劑】

1.0.15mol/LPEP249mgPEP溶于蒸儲水5ml中，0.2mol/LNaOH調整pH至7?8。

2.0.03mol/LADPADP二鈉鹽150mg溶于蒸鐳水5ml中，用0.2mol/LNaOH調整pH7~

8。

3.0.08mol/LMgSO4MgSO4?7H2098mg溶于蒸儲水5m1中。

4.0.25mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）取KILPO,3.40g,K2HPO<4.35g,分別配成100ml?

然后取KH2Pol溶液19.2ml,K2HPO1溶液80.8ml混合，校準pH7.4。

5.反應試劑PEP30u1,ADP100ul,MgSOi100ub磷酸鹽緩沖液50u1,蒸儲水

720y1,混合。在4°C保存1周，臨用時加NADH干粉Img,混勻。

【操作方法】

1.取抗凝血（肝素、EDTA或ACD）經1000r/min離心沉淀5min,將血漿及白細胞小心

吸棄。

2.用冷生理鹽水洗紅細胞3次，最后用冷生理鹽水配成20%紅細胞懸液。

3.于小試管中加200U1反應試劑,再加紅細胞懸液20U1,混勻,置37℃水浴中反

應。

4.在反應開始、10、20、25、30和60nlin各取此液，點在新華濾紙上，晾至完全干燥,

在長波紫外線下觀察熒光點。

【結果觀察】PK活性正常者熒光在20min消失，中間缺乏者（雜合子）熒光在25?

60min消失，嚴重缺乏者（純合子）熒光60min不消失。

【質量控制】

1.每次試驗都應用正常人血液作陰性對照。

2.白細胞和血小板中含有與紅細胞中類型不同而活性很高的PK同工酶，而且在PK缺

乏癥其活性也不降低，故血液離心后應盡量除去白細胞和血小板。

3.本法不用皂素而用低滲反應試劑來破壞紅細胞，這樣可使由殘存白細胞和血小板中

釋放出的酶量很少，不影響試驗的可靠性。

【臨床意義】正常人本試驗為陰性，即熒光逐漸消失。丙酮酸激的缺乏癥患者呈陽性

（熒光不消失），可用于丙酮酸激酶缺乏癥的過篩試驗。

實驗十四、丙酮酸激酶活力測定

【實驗原理】

在ADP存在下，丙酮酸激酶（PK）使磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉變?yōu)楸?，后者?/p>

過乳酸脫氫能（LDH）作用轉變?yōu)槿樗幔瑫rNADH轉變?yōu)镹AD'。NADH在340nm處有吸收峰,

故可根據吸光度的改變來推算PK的活力。

【試劑】

1.0.3mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.4）:取Tris3.63g,KCl1.679g,MgSO,-7H200.592g

溶于90ml蒸儲水中，用0.Imol/LHCl調節(jié)至pH7.4,加水至100ml,每管5ml分裝，于-20

"C保存。

2.ADP溶液：取ADP二鈉鹽6.5mg,溶于1ml蒸儲水中，宜少量配制，置4"C備用。

3.5mmol/LNADH溶液：取NADH3.5mg溶于1ml蒸儲水中，宜少量配制，備用。

4.LDH溶液：自兔肌肉提取之懸液，活力單位為600U/ml。

5.30mmol/LPEP溶液：稱取磷酸烯醉式丙酮酸銹鹽14.43mg,溶于1ml蒸儲水中，用

前宜少量配制，置4°C備用。

【操作方法】

1.取肝素或￡口丁人抗凝血3.51111,加1ml60g/L右旋糖酎，室溫（20℃）靜置30min后

吸棄上層含有白細胞的血漿。

2.再加1ml右旋糖酊，并用生理鹽水補足4.5ml,重復6次，然后把幾乎無白細胞的

紅細胞用生理鹽水洗2次。

3.取洗過的紅細胞經壓積為80%?90%的懸液，吸0.1ml,加入41nl蒸儲水中，使其溶

血。溶血液置冰浴中備用。

4.410mm光徑的比色杯中依次加入Tris緩沖液1.00ml,H2O1.48mLNADH溶液0.10ml,

ADP溶液0.10ml,LDH溶液0.02ml,PEP溶液0.20mL總容量2.90ml,37"保溫。

5.分光光度計340nm,37"C在測定管加入0.1ml溶血液后，立即計時，用蒸儲水調零,

每分鐘測吸光度1次，共測15min。

6.根據讀數記錄，在線性反應期算出平均吸光度下降值A4/min,再按下式計算。

【計算】

PK活性（U/ml紅細胞）

A4/min4.13.01

=XXX

6.220.10.1PCV

（6.22=NADH的毫摩爾吸光系數）

【參考區(qū)間】

1.2~2.2U/ml紅細胞（37℃）

【質量控制】

1.血液標本需新鮮，若以4"C貯存血進行測定，則須有同樣貯存血的正常對照。

2.血細胞含有相當高PK活性，即使在紅細胞PK缺乏癥亦是如此。故必須盡可能從紅

細胞懸液中除去。

【臨床意義】紅細胞丙酮酸激酶缺乏癥為常見的先天性非球形細胞溶血性貧血，屬常

染色體隱性遺傳。純合子時，PK活性顯著降低；雜合子時，無貧血癥狀，但酶活性降低，

介于正常人和純合子之間。

實驗十五、自身溶血試驗及糾正試驗

【實驗原理】將肝素抗凝血置37℃孵育48h,觀察自然溶血程度，并結合加葡萄糖及

ATP糾正試驗，協(xié)助遺傳性球形紅細胞增多癥的診斷，并鑒定其類型。

【試劑】

1.10%葡萄糖（無菌）。

2,等滲鹽水（無菌）。

3.0.4mol/LATP生理鹽水無菌液。

4.0.4g/L氨水（濃氨水0.16ml加水至100ml）或HiCN轉化液。

【操作方法】

1.取小試管4支，分別加lg/L肝素0.02ml,3.624kg(8磅)15min高壓滅菌,烘干。

2.取靜脈血4ml,以無菌手續(xù)按表15-1加入各管，混合抗凝，然后依次操作。

3.以冷藏血離心后的血漿0.2ml加0.4g/L氨水或轉化液4.8ml為空白對照管，在540nm

處測各管吸光度A值。

4.計算各管溶血率(相當于空白對照管100%的比值)。

測定管AX(1-紅細胞壓積)

測定管溶血率=

溶血對照管AX4

【質量控制】操作過程嚴格無菌。

【臨床意義】正常人血液無菌時孵育48h后溶血率很低，一般<4.0缸加葡萄糖或ATP

后，溶血率更低(<0.6%),而各類溶血性貧血溶血率不同程度增強。遺傳性球形紅細胞增多

癥自身溶血早而明顯，能被葡萄糖糾正。遺傳性非球形紅細胞溶血性貧血，自身溶血增加，

其中1型因6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性降低，能被葡萄糖和ATP糾正；II型

表15T自身溶血試驗操作表

123溶血對照

肝素抗凝血(ml)1.01.01.(1.0

10%葡萄糖(ml)0.05—一—

0.4mol/LATP(ml)0.05一—

9g/LNaCl(ml)—一0.(5一

370C孵育48小時測紅細胞壓積冷藏

孵育血漿(ml)0.20.20.2全血0.1

0.4g/L氨水或

4.84.84.89.9

HiCN轉化液(ml)

系丙酮酸激酶缺乏，溶血不能被葡萄糖糾正，但能被ATP糾正。PNH、自身免疫性溶血性貧

血.、藥物性溶血等均不能被葡萄糖糾正。大部分不穩(wěn)定血紅蛋白病例自身溶血率輕度增加，

加葡萄糖1型可以糾正，II型則不能糾正。

實驗十六、血紅蛋白電泳

【實驗原理】利用各種血紅蛋白(包括正?；虍惓b)珠蛋白及等電點不同，在一定

電場和pH緩沖液中電泳方向和速度亦不相同，Hb與等電點緩沖液的pH差別越大，Hb電泳

速度越快；相反則電泳速度越慢。采用不同的緩沖液，支持介質和電泳儀其分辨率不同。以

此來判斷異常Hb的性質，為診斷異常Hb病提供依據。

在電泳中，因所用支持物不同，而有紙上電泳、瓊脂電泳、淀粉膠電泳、醋酸纖維素薄

膜電泳等。電泳膠分辨率較高，但制板較費時且不方便，瓊脂凝膠電泳應用于某些異常11b

的分辨。醋酸纖維素膜電泳方法簡便，省時，易于洗脫定量，對異常Hb分辨率較好，適于

一般試驗室作為異常Hb的篩選試驗。在緩沖液選擇上，多以堿性（pH8.5或9.1）緩沖液浸

泡薄膜，用硼酸鹽緩沖液進行電泳篩選。必要時再用川6?6.2緩沖液電泳鑒別。

【試劑】

1.0.26mol/LTris緩沖液（pH9.1）（用于陽極）三羥甲基氨基甲烷25.2g,EDTA2.5g

或EDTA-Na?2.83g,硼酸1.9g,加蒸儲水至1000ml。

2.巴比妥緩沖液（pH8.6）（陰極）巴比妥鈉5.15g,巴比妥0.92g,加蒸儲水至1000ml。

3.醋酸纖維素薄膜浸泡液①、②兩種緩沖液等量混合。

4.氨基黑10B染色液氨基黑10B1g,磺基水楊酸10g,冰醋酸20ml,加蒸儲水至400ml。

5.漂洗液乙醇45ml,冰醋酸5ml,蒸儲水50ml混合。

6.透明液冰醋酸25ml,無水乙醇75ml。

7.0.4mol/LNaOHo

[Hb液的制備】將抗凝血離心去血漿，加生理鹽水洗滌3次。每ml紅細胞加1.4ml

蒸儲水和0.4ml四氯化碳，強烈振搖5min,離心后取上清液于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫ú贿m用于

不穩(wěn)定血紅蛋白檢查）。

【操作方法】

1.電泳槽內陽極注入pH9.1的Tris緩沖液；陰極注入pH8.6的巴比妥緩沖液，要求兩

極液面平行。

2.醋酸纖維素薄膜切成12X4cm的條狀，置于浸泡液內lOmin后取出，用濾紙吸去多

余液體，使粗面朝上，貼于電泳槽的支架上，用兩層紗布搭橋，自然平衡5min。

3.用Hb吸管吸取2?3u110%Hb液，放在蓋玻片上（長約1cm）邊緣，使之印在靠陰

極端1.5cm薄膜片處，薄膜下襯一張干燥濾紙以吸去多余的Hb液，同時用正常人血紅蛋白

液做對照。

4.接通電源，平衡5min后，調電壓至150v,電流0.2mA/cm薄膜寬，電泳15?30min。

取下薄膜條，置于氨基黑10B染液中，lOmin后取出，用漂洗液至薄膜條潔白為止。

5.定量測定將各小區(qū)帶剪下,llbAi用20ml0.4mol/LNaOH脫色,HbA2用4ml0.4mol/L

NaOH脫色。另取一條無色膜條（與Hb條帶相仿大?。?加0.4mol/LNaOH液4ml作為空白，

用分光光度計，在640nm處比色，記錄吸光度，按下式求其含量（%）?

Hb-吸光度

HbA2（%）=X100

HbA?吸光度+HbAi吸光度X5

【質量控制】

1.醋酸纖維素薄膜應在浸膜液中浸透。

2.防止被檢血紅蛋白以外的標本污染薄膜。

3.為保證電泳效果，電泳槽內緩沖液最多使用兩次。

【參考區(qū)間】1.1%~3.2%.

【臨床意義】

HbA2增高是輕型地中海貧血的重要特征。止匕外，巨幼紅細胞性貧血.，惡性貧血.，某些不

穩(wěn)定血紅蛋白等，HbA?也相對增高。在電泳分組中，以HbA為標志，較HbA快者包括H組和

J組，屬快速異常Hb

HbA,減低見于缺鐵性貧血及鐵粒幼紅細胞性貧血等。

實驗十七、抗堿血紅蛋白（HbF）測定

【實驗原理】抗堿血紅蛋白具有抗堿變性的能力，在堿性溶液中不易變性沉淀，其他

Hb在堿性溶液中可變性而被沉淀劑沉淀，測其濾液中Hb含量即HbF的含量。

【試劑】

1.0.083mol/LKOH4℃保存，用前應滴定校正。若有沉淀或混濁應棄去。

2.半飽和硫酸鐵取飽和硫酸鉉（約390g/500ml）4ml,加蒸儲水4ml及l(fā)mol/L鹽酸

0.2ml。

【操作方法】

1.Hb液的制備取抗凝血1?2ml