DNA的生物合成(基因信息傳遞)

DNA的生物合成復(fù)制(replication)

是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過(guò)程。復(fù)制親代DNA子代DNA本章主要內(nèi)容：

復(fù)制的基本規(guī)律

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化復(fù)制的過(guò)程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式

DNA損傷（突變）與修復(fù)復(fù)制的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication第一節(jié)復(fù)制的方式—半保留復(fù)制

(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制

(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制

(semi-discontinuousreplication)

復(fù)制的基本規(guī)律(重點(diǎn))

一、DNA復(fù)制的基本特征：半保留復(fù)制DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開(kāi)為兩股單鏈，各自為模板合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代DNA，一股單鏈來(lái)自親代，另一股單鏈從新合成，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。

全保留式半保留式混合式DNA復(fù)制的3種可能方式密度梯度實(shí)驗(yàn)支持半保留復(fù)制機(jī)制15NH4Cl14NH4Cl含重氮-DNA的細(xì)菌第一代第二代AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制叉子代DNA子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義:原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。二、DNA復(fù)制從起始點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’三、半不連續(xù)復(fù)制3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)領(lǐng)頭鏈：順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的隨從鏈：復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不連續(xù)復(fù)制岡崎片段(okazakifragment)DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication參與DNA復(fù)制的物質(zhì):底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫(xiě)為DNA-pol；模板(template):解開(kāi)成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。一、生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPiDNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長(zhǎng)只可沿5→3

方向進(jìn)行。二、DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase，DNA-pol)活性：1.5

3

的聚合活性①3

5

外切酶活性:②5

3

外切酶活性:能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解2.核酸外切酶活性（一）原核生物的DNA聚合酶分為三型小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

323個(gè)氨基酸604個(gè)氨基酸DNA-polⅠ功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅡDNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。DNA-polⅡ?qū)δ０宓奶禺愋圆桓?，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。DNA-polⅢ是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。（二）常見(jiàn)的真核細(xì)胞DNA聚合酶三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的即時(shí)校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制：（一）核酸外切酶活性核酸外切酶(exonuclease)是指能從核酸鏈的末端把核苷酸依次水解出來(lái)的酶，外切酶是有方向性的。核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)切除錯(cuò)配堿基并加以校正A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。（二）堿基的正確選擇DNA聚合酶協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。四、復(fù)制中DNA解鏈伴有分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解螺旋酶(helicase)：利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開(kāi)成為兩條單鏈。引物酶(primase)：復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶。單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)：在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。E.Coli基因圖譜（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶理順DNA鏈復(fù)制過(guò)程中正超螺旋的形成，需拓?fù)洚悩?gòu)酶水解并連接磷酸二酯鍵。

拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過(guò)切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。拓?fù)涿傅淖饔梅绞剑何?、DNA連接酶連接單鏈缺口連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶功能：提供核糖3

-OH提供5

-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長(zhǎng)中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)→連續(xù)鏈拓?fù)涿盖袛唷⒄砗蟮膬涉湼淖兺負(fù)錉顟B(tài)DNA聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化3

,5

-磷酸二酯鍵生成的比較

DNA生物合成過(guò)程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)（一）復(fù)制起始：DNA解鏈形成引發(fā)體需要解決兩個(gè)問(wèn)題：1.DNA解開(kāi)成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。（二）半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol領(lǐng)頭鏈的合成：沿5

→3

方向連續(xù)延伸隨從鏈的合成領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制，隨從鏈不連續(xù)復(fù)制領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由同一種DNA-pol催化延長(zhǎng)復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。（三）復(fù)制的終止過(guò)程：切除引物、填補(bǔ)空缺、連接切口5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATP

ADP+Pi5

5

DNA連接酶

隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接：哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期DNA合成期二、真核生物的DNA生物合成細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。

真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。

復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。（一）真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似增殖細(xì)胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。PCNA為同源三聚體，具有與E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形成閉合環(huán)形的可滑動(dòng)DNA夾子，在RFC的作用下PCNA結(jié)合于引物－模板鏈；并且PCNA使polδ獲得持續(xù)合成能力。PCNA水平也是檢驗(yàn)細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。相關(guān)的激酶都有調(diào)節(jié)亞基即細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，和催化亞基即細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclindependentkinase，CDK)。

CDK相匹配的周期蛋白作用點(diǎn)CDK2CyclinD1,D2,D3G1期CyclinEG1→S期CyclinAS期CDK3和CDK4CyclinD1,D2,D3G2期CDK1（CDC2）CyclinA,BG2→M期哺乳類動(dòng)物的周期蛋白和CDK哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，例如錨蛋白(ankynin)是CDK4的特異性抑制物，P21蛋白能抑制多種CDK。錨蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使細(xì)胞周期開(kāi)放/關(guān)閉，因此被形容為細(xì)胞周期的檢查點(diǎn)(checkpoint)蛋白。DNA-polδ和polα分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，DNA-polδ通過(guò)PCNA的協(xié)同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由polα催化合成。然后由PCNA協(xié)同，polδ置換polα，繼續(xù)合成DNA子鏈。（二）真核生物復(fù)制的延長(zhǎng)發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換3

5

5

3

領(lǐng)頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體真核生物復(fù)制叉的延長(zhǎng)：（三）端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問(wèn)題端粒（Telomeres）：真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)

富含GC的重復(fù)序列人：(TTAGGG)n功能：維持染色體的穩(wěn)定性維持DNA復(fù)制的完整性端粒酶：RNA--蛋白質(zhì)復(fù)合物既有模板，又有逆轉(zhuǎn)錄酶以自身的RNA為模板延長(zhǎng)DNA單鏈，然后反折為雙鏈,爬行模式端粒酶與生物體的衰老、腫瘤的發(fā)生有關(guān)聚合酶基本性質(zhì)相同復(fù)制過(guò)程基本相同半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、雙向復(fù)制原核、真核生物DNA復(fù)制的異同相同點(diǎn)真核生物多復(fù)制起點(diǎn)全部復(fù)制后才可開(kāi)始下一次復(fù)制酶和蛋白因子不同

末端需端粒和端粒酶原核生物1個(gè)復(fù)制起；起點(diǎn)可連續(xù)發(fā)生復(fù)制酶和蛋白因子不同逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四節(jié)某些病毒的遺傳物質(zhì)是RNA。少數(shù)低等生物如M13噬菌體，它的感染型只含單鏈DNA。原核生物的質(zhì)粒，真核生物的線粒體DNA，都是染色體外存在的DNA。這些非染色體基因組，采用特殊的方式進(jìn)行復(fù)制。一、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組的復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組是RNA，其復(fù)制方式是逆轉(zhuǎn)錄RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNARNA病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈DNA的前病毒(provirus)。在某些情況下，前病毒基因組通過(guò)基因重組整合到細(xì)胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復(fù)制和表達(dá)。分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTTAAAA

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT二、逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說(shuō)明：在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。三、噬菌體和線粒體DNA的復(fù)制噬菌體：滾環(huán)方式復(fù)制線粒體DNA：D環(huán)方式復(fù)制特點(diǎn)：復(fù)制起始點(diǎn)不在同一位點(diǎn)，內(nèi)、外環(huán)復(fù)制有時(shí)序差別。復(fù)制中呈字母D形狀。

D-環(huán)復(fù)制時(shí)需合成引物。第一個(gè)引物以內(nèi)環(huán)為模板延伸。至第二個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)時(shí)，又合成另一個(gè)反向引物，以外環(huán)為模板進(jìn)行反向的延伸。最后完成兩個(gè)雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制。DNA損傷（突變）與修復(fù)DNADamage(Mutation)&Repair第五節(jié)DNA突變具體指?jìng)€(gè)別dNMP殘基以至片段DNA在構(gòu)成、復(fù)制或表型功能的異常變化，也稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來(lái)看，突變就是DNA分子上堿基的改變。一、突變?cè)谏锝缙毡榇嬖冢ㄒ唬┩蛔兪沁M(jìn)化的分子基礎(chǔ)（二）只有基因型改變的突變形成DNA的多態(tài)性有些突變沒(méi)有可察覺(jué)的表型改變，如在簡(jiǎn)并密碼子上第三位堿基的改變，非編碼區(qū)上序列變化等。（三）致死性的突變可導(dǎo)致個(gè)體、細(xì)胞的死亡

（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)二、多種化學(xué)或物理因素可誘發(fā)突變大量的突變屬于自發(fā)突變，發(fā)生頻率只不過(guò)在10-9左右。但由于生物基因組龐大，細(xì)胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。致突變的因素，主要有物理和化學(xué)因素。物理因素：紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射UV化學(xué)因素：三、突變的類型錯(cuò)配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rear