T-ZNZ 244-2024 動物源性產(chǎn)品中羊源性成分檢測數(shù)字PCR 法

ICS67.120.10CCSB45T/ZNZ浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學(xué)會發(fā)布IT/ZNZ244—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、邁克生物股份有限公司。本文件主要起草人：陳笑蕓、紀(jì)藝、趙新、付軍、彭城、王曉雪、汪小福、徐俊鋒。IT/ZNZ244—20241T/ZNZ244—2024動物源性產(chǎn)品中羊源性成分檢測數(shù)字PCR法本文件描述了使用數(shù)字PCR檢測方法測定動物源性產(chǎn)品中山羊、綿羊等DNA成分的原理、試劑與材料、儀器和設(shè)備、試驗步驟、結(jié)果分析與表述、定量限和檢出限。本文件適用于肉及其加工品、動物源性飼料中山羊、綿羊等DNA成分的數(shù)字PCR定性和定量檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。農(nóng)業(yè)部2406號公告-7-2016轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品成分檢測DNA提取和純化3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1數(shù)字PCRdigitalPCR一種核酸絕對定量的PCR技術(shù)。將PCR體系分配成大量微反應(yīng)體系進行PCR擴增，擴增后對微反應(yīng)體系進行熒光信號閱讀，通過陽性率和泊松分布計算獲得樣品中靶序列拷貝數(shù)濃度。4原理本文件針對羊種屬特異序列設(shè)計選取特異性引物和探針進行數(shù)字PCR擴增，根據(jù)熒光閾值判斷每個微反應(yīng)體系的擴增結(jié)果，依據(jù)微反應(yīng)體系的陰、陽性率和泊松分布公式計算得到數(shù)字PCR反應(yīng)體系中的羊種屬特異性基因拷貝數(shù)濃度。5試劑與材料除非另有說明，所有試驗用試劑均為分析純，水為無DNase/RNase超純水。5.1基因組DNA提取或動物成分相關(guān)DNA提取試劑盒按照農(nóng)業(yè)部2406號公告-7-2016中4執(zhí)行或采用等效的動物成分DNA提取試劑盒。5.2數(shù)字PCR反應(yīng)試劑盒2T/ZNZ244—2024按照不同的數(shù)字PCR平臺的說明書選取其推薦的數(shù)字PCR反應(yīng)試劑盒。5.3羊種屬特異性序列引物/探針（鋅指解旋酶基因，HELZ基因）HELZ-F:5′-AGGTTGCGCCATGCTGTAG-3′HELZ-R:5′-CAGGACTTCTAATTTCGCCAGTAAC-3′HELZ-P:5′-AGGAGGAATCCCCATCATCACGGC-3′6儀器和設(shè)備6.1數(shù)字PCR系統(tǒng)：包括微反應(yīng)體系發(fā)生器或其他具有同樣功能的儀器、PCR擴增儀（變溫速率≤2℃/s，孔間溫度差異<1.0℃)和微反應(yīng)體系熒光檢測儀或其他具有同樣功能儀器的系統(tǒng)。6.2生物安全柜或超凈工作臺。6.3核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.4電子天平：感量0.1g。6.5離心機：離心力12000g。6.6微量移液器。6.7渦旋震蕩儀。7試驗步驟7.1試樣制備7.1.1對樣品進行前處理處理后將樣品分成三等份，包括待檢樣品、復(fù)檢樣品和留存樣品。7.1.2固體樣品依次用70%乙醇和雙蒸水沖洗2次~3次后，置于50mL離心管或密封袋中，-20℃以下凍存。7.1.3半固體和液體樣品混勻后直接分裝到50mL離心管或密封袋中，-20℃以下凍存。7.2DNA模板制備7.2.1試劑盒按照農(nóng)業(yè)部2406號公告-7-2016中6.3執(zhí)行或等效采用DNA提取試劑盒提取DNA。7.2.2DNA濃度和純度的測定遵照農(nóng)業(yè)部2406號公告-7-2016中6.4規(guī)定執(zhí)行。7.3數(shù)字PCR擴增3T/ZNZ244—20247.3.1對照以含有羊源性成分的樣品作為陽性對照（建議優(yōu)先選用有證標(biāo)準(zhǔn)樣品或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以不含有羊源性成分的樣品作為陰性對照，用等體積無菌水代替模板DNA作為空白對照。同時進行對照和試樣的數(shù)字PCR反應(yīng)，試樣設(shè)置6次重復(fù)，對羊源性特異基因進行擴增，以定量值的均值作為最終結(jié)果。各對照PCR反應(yīng)體系中，除模板外，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與7.3.2和7.3.3相同。7.3.2數(shù)字PCR反應(yīng)體系對樣本進行PCR反應(yīng)。數(shù)字PCR反應(yīng)中的羊種屬特異性基因按表1在PCR反應(yīng)管中加入反應(yīng)試劑，渦旋混勻。表1羊種屬特異性基因數(shù)字PCR反應(yīng)體系—10μmol/LHELZ-F10μmol/LHELZ-R10μmol/LHELZ-P注2：推薦市面上現(xiàn)售的數(shù)字PCR平臺進行試驗，并針對市面上現(xiàn)售的不同數(shù)字PCR平臺，依據(jù)說明書調(diào)整反應(yīng)7.3.3反應(yīng)程序1min98℃,10min；4℃保存。不同PCR反應(yīng)平臺可根據(jù)說明書對熱啟動步驟程序進行修改，但不能對熱循環(huán)（擴增程序）進行修改。擴增結(jié)束后讀取熒光信號，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。8結(jié)果分析與表述8.1質(zhì)量控制數(shù)字PCR擴增結(jié)果，陰性對照組和空白對照組均未檢出陽性微滴，陽性對照有明顯陽性微滴，且核酸拷貝數(shù)濃度大于6copies/μL，則試驗成立。8.2閾值設(shè)定數(shù)字PCR結(jié)果中，陰性微滴和陽性微滴明顯分開，閾值設(shè)在陰性微滴和陽性微滴分開的區(qū)域。8.3拷貝數(shù)計算數(shù)字PCR儀運行后經(jīng)軟件計算得出每個試樣羊種屬特異性基因拷貝數(shù)濃度。每份試樣6個重復(fù)，4T/ZNZ244—2024共6個數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過25%時，將6個檢測結(jié)果的平均值作為樣品的檢測結(jié)果，單位為拷8.4檢測結(jié)果表述陰性對照、陽性對照和空白對照檢測結(jié)果符合8.1要求的情況下，分析試樣結(jié)果：——試樣檢測出HELZ基因陽性微滴，且核酸拷貝數(shù)濃度≥6copies/μL，則判定為陽性。表述為“樣品中檢出羊源性成分，檢出XXcopies/μL”?！魳悠分袡z測出HELZ基因陽性微滴，且核酸拷貝數(shù)濃度＜6copies/μL，則需復(fù)檢。若復(fù)檢結(jié)果仍檢測出陽性微滴，則判定為陽性，否則判定為陰性。若陽性表述為“樣品中檢出羊源性成分”，若陰性表述為“樣品中未檢出羊源性成分”?！魳悠分形礄z測出HELZ基因陽性微滴，則判定為陰性。表述為“樣品中未檢出羊源性成分”。9定量限和檢出限定量限為11copies/μL；檢出限為6copies/μL（指在數(shù)字P