T-ZNZ 252-2024 配方乳粉中蠟樣芽胞桿菌的分離鑒定和毒力基因的檢測

ICS07.100.99CCSB41T/ZNZ浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學會發(fā)布IT/ZNZ252—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學會提出并歸口。本文件起草單位：浙江大學動物科學學院、國科大杭州高等研究院、貝因美股份有限公司、浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所。本文件主要起草人：樂敏、唐標、尹睿、滕霖、廖思豪、馮夢瑤、李艷、熊麗娜、高悅?cè)A、張藝。1T/ZNZ252—2024配方乳粉中蠟樣芽胞桿菌的分離鑒定和毒力基因的檢測本文件規(guī)定了配方乳粉來源的蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus）的分離鑒定和定量檢測方法中的設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑、樣品制備與菌株分離鑒定、平板計數(shù)法（第一法）、MPN計數(shù)法（第二法）、毒力基因的PCR檢測及生物安全的要求。本文件適用于配方乳粉中蠟樣芽胞桿菌的分離鑒定和毒力基因的檢測。本文件第一法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較高的配方乳粉樣品中蠟樣芽胞桿菌的檢驗計數(shù)；第二法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較低的配方乳粉樣品中蠟樣芽胞桿菌的檢驗計數(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國家標準食品微生物學檢驗總則GB4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定GB4789.14食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗GB4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4設(shè)備和材料4.1設(shè)備用于細菌分離的微生物實驗室應(yīng)符合GB19489生物安全二級實驗室（BSL-2）要求，滅菌、培養(yǎng)和鑒定設(shè)備按GB4789.1執(zhí)行，其他設(shè)備如下：——冰箱：-10℃~-20℃;——均質(zhì)器；——電子天平：感量0.1g和0.00——顯微鏡：10倍～100倍（油鏡——微量可調(diào)移液器（0.1μL~2μL、1μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL——水浴鍋；——渦旋振蕩器；——混勻儀（振蕩頻率1,400r/min以上——臺式離心機（離心轉(zhuǎn)速2,000r/min——高速臺式離心機（離心轉(zhuǎn)速12,000r/min以上——聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）擴增儀；——核酸電泳儀；——凝膠成像系統(tǒng)；2T/ZNZ252—2024——滅菌鍋；——pH計；——全自動生化鑒定系統(tǒng)；——菌落自動計數(shù)儀；——微量核酸蛋白濃度測定儀；——基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（選做）。4.2材料除微生物實驗室常規(guī)材料外，其他材料如下:——滅菌離心管（1.5mL、2mL——滅菌吸頭（10μL、200μL、1mL——滅菌PCR擴增反應(yīng)管；——無菌錐形瓶：100mL、500mL；——無菌平皿：直徑90mm；——無菌試管：18mm×180mm；——載玻片、蓋玻片、油鏡相關(guān)油擦鏡紙、染色試劑；——L型涂布棒；——API鑒定試劑條。5培養(yǎng)基和試劑5.1實驗用水培養(yǎng)基配制應(yīng)符合GB4789.28的規(guī)定，試劑配制用水應(yīng)符合GB/T6682的規(guī)定。5.2培養(yǎng)基5.2.1磷酸鹽緩沖液（PBS）：見附錄A中A.1。5.2.2甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂：見附錄A中A.2。5.2.3胰酪胨大豆多黏菌素肉湯：見附錄A中A.3。5.2.4營養(yǎng)瓊脂：見附錄A中A.4。5.2.5過氧化氫溶液：見附錄A中A.5。5.2.6動力培養(yǎng)基：見附錄A中A.6。5.2.7硝酸鹽肉湯：見附錄A中A.7。5.2.8酪蛋白瓊脂：見附錄A中A.8。5.2.9硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.9。5.2.100.5%堿性復(fù)紅：見附錄A中A.10。5.2.11動力培養(yǎng)基：見附錄A中A.11。5.2.12糖發(fā)酵管：見附錄A中A.12。5.2.13V-P（Voges-Proskauer）培養(yǎng)基：見附錄A中A.13。5.2.14胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂：見附錄A中A.14。5.2.15溶菌酶營養(yǎng)肉湯：見附錄A中A.15。5.2.16西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：見附錄A中A.16。5.2.17明膠培養(yǎng)基：見附錄A中A.17。5.3試劑5.3.1細菌基因組DNA提取試劑盒。5.3.2無水乙醇。5.3.3檸檬酸鈉（Na3C6H5O7）。5.3.4PCR擴增試劑盒。5.4引物3T/ZNZ252—20245.5標準菌株蠟樣芽胞桿菌ATCC14579、蠟樣芽孢桿菌NCTC11143，毒力基因陽性對照；枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501，毒力基因陰性對照；蕈狀芽孢桿菌CGMCC1.7891。6樣品制備與菌株分離鑒定6.1樣品制備6.1.1樣品保存冷凍樣品（整罐乳粉）應(yīng)在45℃以下不超過15min或在2℃~5℃不檢驗，應(yīng)放于-20~-10℃保存；非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應(yīng)置于2℃~5℃冰箱保存，24h內(nèi)檢驗。6.1.2樣品處理配方乳粉樣品應(yīng)在無菌環(huán)境下開啟，使用無菌稱量勺和無菌稱量紙稱取配方乳粉樣品25g，放入盛有225mL預(yù)熱至42℃的2%檸檬酸鈉（Na3C6H5O7）溶液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，用均質(zhì)器以8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min～2min，制成1:10的樣品勻液，或放入盛有225mL預(yù)熱至42℃的2%檸檬酸鈉溶液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。在8000g，4℃下離心15min，棄掉上清與脂質(zhì)。6.1.3樣品的稀釋吸取6.1.2中1:10的樣品勻液1mL加到裝有9mLPBS或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻制成1:100的樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。6.2分離和培養(yǎng)6.2.1分離用接種環(huán)從上述稀釋液中移取1環(huán)，劃線接種到MYP瓊脂平板上，30℃±1℃條件下培養(yǎng)24h±2h。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)24h±2h再觀察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色（表示不發(fā)酵甘露醇），周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。6.2.2培養(yǎng)從上述平板上挑取典型菌落，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板進行純培養(yǎng)，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h后進行確證。在營養(yǎng)瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展狀，直徑為4mm～10mm。6.3確定鑒定（任選其一）6.3.1生化鑒定6.3.1.1染色鏡檢挑取純培養(yǎng)的單個菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽性芽胞桿菌，大小為（1μm~1.3μm）×（3μm～5μm芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長鏈狀排列。6.3.1.2動力試驗用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動力培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h。有動力的蠟樣芽胞桿菌應(yīng)沿穿刺線呈擴散生長，而蕈狀芽胞桿菌常呈“絨毛狀”生長。6.3.1.3溶血試驗T/ZNZ252—2024挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落接種于TSSB瓊脂平板上，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。蠟樣芽胞桿菌菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環(huán)或完全溶血環(huán)。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象，而多數(shù)炭疽芽胞桿菌為不溶血，巨大芽胞桿菌為不溶血。6.3.1.4根狀生長試驗挑取單個可疑菌落，在室溫干燥1d～2d的營養(yǎng)瓊脂平板上，按間隔2cm～3cm左右距離劃平行直線于經(jīng)30℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，不能超過72h。用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標準株作為對照進行同步試驗。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長的特征，蠟樣芽胞桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長的特征。6.3.1.5溶菌酶耐性試驗0.001%溶菌酶）中能生長。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24h。巨大芽胞桿菌不生長。6.3.1.6蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落接種于硫酸錳營養(yǎng)瓊脂平板上，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，并于室溫放置3d～4d，挑取培養(yǎng)物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30s后傾去，再通過火焰干燥，于載玻片上滴滿0.5%堿性復(fù)紅，放火焰上加熱（微見蒸氣，勿使染液沸騰）持續(xù)1min～2min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30s，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀察有無游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結(jié)晶體。如發(fā)現(xiàn)游離芽孢數(shù)量較少，應(yīng)再將培養(yǎng)物置室溫2d～3d后進行檢查。除蘇云金芽胞桿菌外，其他芽胞桿菌不產(chǎn)生蛋白結(jié)晶體。6.3.1.7生化分型（選做項目）蠟樣芽胞桿菌與其他芽胞桿菌生化特征的區(qū)別，見附錄C中表C.1。生化試驗也可選用全自動生化鑒定系統(tǒng)進行。根據(jù)對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P試驗反應(yīng)、明膠液化試驗的結(jié)果，將蠟樣芽胞桿菌分成不同生化型別，見附錄C中表C.2。6.3.2PCR鑒定6.3.2.1樣品DNA提取挑取6.2.2中獲得的純培養(yǎng)物，按照試劑盒說明書提取細菌總DNA。6.3.2.2PCR擴增靶基因gyrB的PCR檢測需配制20μL的反應(yīng)體系，見表B.2。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min；存。檢測過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。用蠟樣芽胞桿菌ATCC14579作陽性對照，用枯草芽胞桿菌作陰性對照，用等體積的無菌水作空白對照。6.3.2.3結(jié)果判定吸取2μLPCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠置電泳槽中，在電壓120V條件下，電泳30min后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)下拍照并判定結(jié)果。參考圖F.1，出現(xiàn)與陽性對照gyrB基因條帶大小相同且有明亮條帶的菌株鑒定為蠟樣芽胞桿菌。6.3.3基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜鑒定挑取6.2.2中獲得的純培養(yǎng)物，均勻涂抹于靶板上的專用靶點孔位；每孔加入1μL70%甲酸；待自然風干后，每孔加入1μLHCCA(α-氰基-4羥基肉桂酸）基質(zhì)液；待自然風干后，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-AssistedLaserDesorption/IonzationTimeofFlightMassSpectrometry,MALDI-TOF-MS）進行鑒定。7平板計數(shù)法（第一法）7.1檢驗程序45T/ZNZ252—202424h～48h24h～48h經(jīng)過樣品制備后，選取2～3個適宜的連續(xù)稀釋梯度樣品溶液，涂布MYP瓊脂平板3030℃±1℃接種營養(yǎng)瓊脂24h±24h±2h30℃±1℃典型菌落計數(shù)及確定鑒定↓ 報告圖1蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法檢驗程序7.2樣品接種根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液，以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板，然后用無菌L涂布棒涂布整個平板，注意不要觸及培養(yǎng)基邊緣。7.3計數(shù)7.3.1選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個平板所有菌落數(shù)合計在20CFU～200CFU之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。如果出現(xiàn)a~f）現(xiàn)象按7.4.1中公式（1）計算，如果出現(xiàn)g）現(xiàn)象則按7.4.2中公式（2）計算；a)只有一個稀釋度的平板菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；b)2個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間，但只有一個稀釋度的平板有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；c)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20CFU且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落；d)某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；e)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均大于200CFU且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌f)所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在20CFU～200CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20CFU或大于200CFU時，應(yīng)計數(shù)最接近20CFU或200CFU的稀釋度平板上的典型菌落。g)2個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間且均有典型菌落。7.3.2從每個平板中挑取至少5個典型菌落（小于5個全選分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h后，按6.3進行確證。7.4計算公式7.4.1菌落計算公式（1）T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；A——某一稀釋度蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；B——鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；C——用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；6T/ZNZ252—2024d——稀釋因子。7.4.2菌落計算公式（2）T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；A2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；C2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；1.1——計算系數(shù)（如果第二稀釋度蠟樣芽胞桿菌鑒定結(jié)果為0，計算系數(shù)采用1d——稀釋因子（第一稀釋度）。7.5報告根據(jù)MYP平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數(shù)，按7.4中公式(1)、公式(2)計算，報告每g樣品中蠟樣芽胞桿菌菌數(shù)，以CFU/g表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。必要時報告蠟樣芽胞桿菌生化分型結(jié)果。8MPN計數(shù)法（第二法）8.1檢驗程序蠟樣芽胞桿菌MPN計數(shù)法檢驗程序見圖2。經(jīng)過樣品制備后，選取3個適宜的連續(xù)稀釋梯度樣品溶液，各吸取1mL，分別接種于3管胰酪胨大豆多黏菌素肉湯↓ 接種于MYP瓊脂平板 30℃±1℃↓24h～48h接種營養(yǎng)瓊脂 30℃±1℃↓24h±2h確定鑒定↓查MPN表↓報告8.2樣品接種7T/ZNZ252—2024在6.1.3的樣品中，取3個適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液1mL，接種于10mL胰酪胨大豆多黏菌素肉湯中，每一稀釋度接種3管，每管接種1mL（如果接種量需要超過1mL，則用雙料胰酪胨大豆多黏菌素肉湯）。于30℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。8.3鑒定用接種環(huán)從各管中分別移取1環(huán)，劃線接種到MYP瓊脂平板上，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)24h±2h再觀察。從每個平板選取5個典型菌落（小于5個全選），分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h后，按6.3進行確證。8.4報告根據(jù)證實為蠟樣芽胞桿菌陽性的試管管數(shù)，查MPN檢索表（見附錄D報告每g樣品中蠟樣芽胞桿菌的最可能數(shù)，以MPN/g表示。國際上對食品中蠟樣芽胞桿菌的限量要求參考附錄E。9毒力基因的PCR檢測將按6.3進行確證的蠟樣芽胞桿菌，進行毒力基因的檢測。9.1樣品DNA提取9.2PCR擴增檢測cesA、hblA、entFM、cytK或nheA毒力基因的PCR反應(yīng)條件同6.3.2.2。蠟樣芽胞桿菌NCTC11143作檢測cesA基因的陽性對照，蠟樣芽胞桿菌ATCC14579作hblA、entFM、cytK或nheA基因的陽性對照，枯草芽胞桿菌CMCC(B)63501作陰性對照，等體積的無菌水作空白對照。9.2.1結(jié)果判定參考圖F.1，根據(jù)是否出現(xiàn)與陽性對照中各毒力因子大小相同且明亮的條帶，判定樣品是否攜帶相應(yīng)的毒力基因。10生物安全檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的規(guī)定執(zhí)行。檢測過程中的廢棄物處理應(yīng)嚴格按照GB19489規(guī)定執(zhí)行。8T/ZNZ252—2024A.1磷酸鹽緩沖液（PBS）A.1.1成分磷酸二氫鉀蒸餾水34.0g500.0mLA.1.2制法貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。A.2甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂A.2.1成分D-甘露醇10.0g氯化鈉10.0g瓊脂粉12.0～15.0g0.2%酚紅溶液13.0mL50%卵黃液50.0mL多黏菌素B100000.0IU蒸餾水950.0mL濃度為10000IU的多黏菌素B溶液1mL，混勻后傾注平板。A.2.2.150％卵黃液取鮮雞蛋，用硬刷將蛋殼徹底洗凈，瀝干，于70%酒精溶液中浸泡30min。用無菌操作取出卵黃，加入等量滅菌生理鹽水，混勻后備用。A.2.2.2多黏菌素B溶液在50mL滅菌蒸餾水中溶解500000IU的無菌硫酸鹽多黏菌素B。A.3胰酪胨大豆多黏菌素肉湯9T/ZNZ252—2024A.3.1成分胰酪胨（或酪蛋白胨）植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）氯化鈉無水磷酸氫二鉀葡萄糖多黏菌素B蒸餾水3.0g5.0g2.5g2.5g100IU/mL1000.0mLA.3.2制法將A.3.1前五種成分加入于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min。臨用時加入多黏菌素B溶液混勻即可。多黏菌素B溶液制法同附錄A.2.2.2。A.4營養(yǎng)瓊脂A.4.1成分氯化鈉瓊脂粉12.0～15.0蒸餾水1000.0mLA.4.2制法將A.4.1所述成分溶解于蒸餾水內(nèi)，校正pH至7.2±0.2，加熱使瓊脂溶化。121℃高壓滅菌15min，A.5過氧化氫溶液A.5.1試劑3%過氧化氫溶液：臨用時配制，用H2O2配制。A.5.2試驗方法用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落,置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液2mL，觀察結(jié)果。A.5.3結(jié)果于30s內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。A.6動力培養(yǎng)基A.6.1成分胰酪胨（或酪蛋白胨）10.0gT/ZNZ252—2024酵母粉葡萄糖無水磷酸氫二鈉瓊脂粉蒸餾水A.6.2制法2.5g5.0g2.5g3.0～5.0g1000.0mL將A.6.1所述成分于蒸餾水，校正pH至7.2±0.2，加熱溶解。分裝每管2mL～3mL。115℃高壓滅菌20min，備用。A.6.3試驗方法用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動力培養(yǎng)基中，30℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。蠟樣芽胞桿菌應(yīng)沿穿刺線呈擴散生長，而蕈狀芽胞桿菌常常呈絨毛狀生長，形成蜂巢狀擴散。動力試驗也可用懸滴法檢查。蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌通常運動極為活潑，而炭疽桿菌則不運動。A.7硝酸鹽肉湯成分蛋白胨硝酸鉀蒸餾水5.0g0.2g1000.0mLA.7.2制法A.7.3硝酸鹽還原試劑A.7.4試驗方法接種后在36℃±1℃培養(yǎng)24h～72h。加甲液和乙液各1滴，觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)立即或數(shù)min內(nèi)顯紅色。如為陰性，可再加入鋅粉少許，如出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽未被還原，為陰性。反之，則表示硝酸鹽已被還原，為陽性。A.8A.8.1酪蛋白瓊脂成分牛肉粉無水磷酸氫二鈉2.0g氯化鈉瓊脂粉12.0～15.0gT/ZNZ252—2024蒸餾水1000.0mL0.4%溴麝香草酚藍溶液12.5mLA.8.2制法除溴麝香草酚藍溶液外，將A.8.1所述各成分溶于蒸餾水中加熱溶解（酪蛋白不會溶解）。校正pH至7.4±0.2，加入溴麝香草酚藍溶液，121℃高壓滅菌15min后傾注平板。A.8.3試驗方法用接種環(huán)挑取可疑菌落，點種于酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h，陽性反應(yīng)菌落周圍培養(yǎng)基應(yīng)出現(xiàn)澄清透明區(qū)(表示產(chǎn)生酪蛋白酶)。陰性反應(yīng)時應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)72h再觀察。A.9硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基A.9.1成分胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏磷酸氫二鉀瓊脂粉蒸餾水5.0g5.0g4.0g12.0～15.0g1000.0mLA.9.2制法將A.9.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至7.2±0.2。121℃高壓滅菌15min，備用。A.100.5%堿性復(fù)紅A.10.1成分堿性復(fù)紅0.5g乙醇20.0mL蒸餾水80.0mLA.10.2制法取堿性復(fù)紅0.5g溶解于20mL乙醇中，再用蒸餾水稀釋至100mL，濾紙過濾后儲存?zhèn)溆?。A.11動力培養(yǎng)基A.11.1成分蛋白胨10.0g牛肉浸粉3.0g瓊脂4.0gT/ZNZ252—2024氯化鈉5.0g蒸餾水1000.0mLA.11.2制法A.12糖發(fā)酵管A.12.1成分牛肉粉氯化鈉磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.0g0.2%溴麝香草酚藍溶液12.0mL蒸餾水1000.0mLA.12.2制法A.12.2.1糖發(fā)酵管按A.12.1所述成分配好后，校正pH至7.2±0.2，按0.5%加入葡萄糖，分裝于一個有倒置小管的小試管內(nèi)，115℃高壓滅菌15min。A.12.2.2其他各種糖發(fā)酵管可按A.12.1所述成分配好后，分裝每瓶100mL，115℃高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10%溶液，同時115℃高壓滅菌15min。將5mL糖溶液加入于100mL培養(yǎng)基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。蔗糖不純，加熱后會自行水解者，應(yīng)采用過濾法除菌。A.12.3試驗方法挑取可疑菌落接種于葡萄糖發(fā)酵管中，厭氧條件下36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色者表明該菌在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。A.13V-P培養(yǎng)基A.13.1成分磷酸氫二鉀葡萄糖氯化鈉蒸餾水1000.0mLA.13.2制法T/ZNZ252—2024用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物接種于本培養(yǎng)基中，36℃±1℃培養(yǎng)48h～72h。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氫氧化鉀溶液0.2mL，充分振搖試管，觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)立即或于數(shù)min內(nèi)出現(xiàn)紅色。如為陰性，應(yīng)放在36℃±1℃培養(yǎng)4h再觀察。A.14胰酪胨大豆羊血(TSSB)瓊脂A.14.1成分胰酪胨（或酪蛋白胨）15.0g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）5.0g氯化鈉無水磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g瓊脂粉12.0～15.0g蒸餾水1000.0mLA.14.2制法將A.14.1所述各成分于蒸餾水中加熱溶解。校正pH至7.2±0.2，分裝每瓶100mL。121℃高壓滅菌15min。水浴中冷卻至45℃~50℃,每100mL加入5～10mL無菌脫纖維羊血，混勻后傾注平板。A.15溶菌酶營養(yǎng)肉湯A.15.1成分牛肉粉3.0g蛋白胨5.0g蒸餾水990.0mL0.1%溶菌酶溶液10.0mLA.15.2制法除溶菌酶溶液外，將A.15.1所述成分溶解于蒸餾水。校正pH至6.8±0.1，分裝每瓶99mL。121℃高壓滅菌15min。每瓶加入0.1%溶菌酶溶液1mL，混勻后分裝滅菌試管，每管2.5mL。0.1%溶菌酶溶液配制：在65mL滅菌的0.1mol/L鹽酸中加入0.1g溶菌酶，隔水煮沸20min溶解后，再用滅菌的0.1mol/L鹽酸稀釋至100mL?；蛘叻Q取0.1g溶菌酶溶于100mL的無菌蒸餾水后，用孔徑為0.45μm硝酸纖維膜過濾。使用前測試是否無菌。A.15.3試驗方法用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36℃±1℃培養(yǎng)24h。蠟樣芽胞桿菌在本培養(yǎng)基(含0.001%溶菌酶)中能生長。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24h。A.16西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基A.16.1成分氯化鈉5.0gT/ZNZ252—2024硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.2磷酸二氫氨磷酸氫二鉀檸檬酸鈉瓊脂粉12.0～15.0g蒸餾水1000.0mL0.2%溴麝香草酚藍溶液40.0mLA.16.2制法除溴麝香草酚藍溶液和瓊脂外，將A.16.1所述各成分溶解于1000.0mL再加瓊脂，加熱溶化。然后加入溴麝香草酚藍溶液，混合均勻后分裝試管，121℃高壓滅菌15min。A.16.3試驗方法挑取少量瓊脂培養(yǎng)物接種于西蒙氏檸檬酸培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)4d。每天觀察結(jié)果，陽性者斜面上有菌落生長，培養(yǎng)基從綠色轉(zhuǎn)為藍色。A.17明膠培養(yǎng)基A.17.1成分蛋白胨5.0g牛肉粉3.0gg蒸餾水1000.0mLA.17.2制法