項目十八-B淋巴細胞功能檢測

項目十八B淋巴細胞功能檢測一、溶血空斑試驗(Plaqueformingcellassay)【實驗原理】將SRBC免疫動物，隔一定時間取其脾臟制成細胞懸液，當與SRBC混合孵育時，其中抗體形成細胞釋放的抗體會與周圍SRBC特異性結合，在補體作用下，使這些致敏的SRBC溶解，從而在瓊脂凝膠中的每個抗體形成細胞周圍形成一個肉眼可見的溶血空斑。測定與補體結合力強的IgM形成細胞采用直接方法；測定與補體結合力弱的IgG或IgA形成細胞采用間接法，即實驗中需加入抗免疫動物Ig的抗體(二抗)，才能促進溶血空斑形成。此處只介紹小鼠瓊脂直接溶血空斑技術?！驹噭┖推鞑摹?．小白鼠體重18~22g。2．補體豚鼠混合新鮮血清。3．SRBC懸液用Gey液將SRBC洗3次，分別配成2.5×108個細胞/ml和5×108個細胞/ml濃度的紅細胞懸液。4．Gey液、瓊脂糖。5．注射器、剪刀、鑷子、不銹鋼網、小平皿、試管、吸管、顯微鏡、溫箱、水浴箱?！静襟E和方法】1．免疫小鼠取1ml2.5×108個細胞/ml濃度的SRBC懸液注入小鼠腹腔，或取0.2mlSRBC懸液經小鼠尾靜脈注入。2．制備脾細胞懸液將免疫4天后的小鼠處死，取脾臟制備細胞懸液(制備方法見動物組織中免疫細胞收集)，用Gey液配成1×107個細胞/ml的細胞懸液(每只小鼠約加6~10mlGey液)。3．制備底層瓊脂將14g/L瓊脂糖(用Gey液配制)溶化后取2~3ml傾注于水平的小平皿內，凝固后去蓋反扣于37℃4．制備頂層瓊脂將5g/L瓊脂糖(用Gey液配制)溶化，置48℃水浴中平衡備用。取脾細胞懸液和5×108個細胞/mlSRBC懸液各0.1ml，再加入未稀釋補體0.05ml，混勻，置48℃水浴平衡片刻。加入0.8ml已平衡好的瓊脂糖，混勻后倒入底層瓊脂上，旋轉平皿使之均勻平鋪，凝固后置【結果判定】1．將平皿置低倍顯微鏡下觀察計數(shù)。溶血空斑中心有淋巴細胞，周圍為透明區(qū)。2．全脾中PFC數(shù)計算：每個平皿PFC數(shù)×10×脾細胞懸液體積(ml)或以每百萬脾細胞所含PFC數(shù)來表示?！咀⒁馐马棥?．試驗選用Gey液為洗滌液和培養(yǎng)液，優(yōu)于Hanks液、Eagle液和Dullecco液，但工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配。2．最好選用近交系小鼠，且鼠齡和體重應基本一致。3．制備脾細胞過程所用Gey液應預先4℃預冷，制好的細胞懸液應及時放44．制備頂層瓊脂時，溫度應控制在45～48℃之間，溫度太高細胞會失活，過低會使瓊脂凝固，細胞不能分散，無法倒入平皿。各細胞成分要充分混勻，同時避免出現(xiàn)氣泡；與瓊脂糖混勻、傾倒平皿時動作要敏捷，以免凝固?！痉椒ㄔu價】本方法為改良平皿法，穩(wěn)定性較好，常用于體液免疫功能測定，是臨床研究的可靠指標。與經典平皿法比較具有簡便、節(jié)省試劑、標本可長期保存、敏感性高等優(yōu)點。【臨床意義】可用于研究機體免疫機制；篩選藥物并探討其作用機理及對免疫功能的影響?！靖健縂ey液配制1液NaCl35gKCl1.85gNa2HPO4·12H2O1.5gKH2PO40.119g葡萄糖5g酚紅50mg加蒸餾水至1000ml。2液MgCl2·6H2O0.42gMgSO4·7H2O0.14CaCl20.34g加蒸餾水至1000ml。3液NaHCO32.25g加蒸餾水至1000ml。以上均高壓滅菌(112℃【思考題】溶血空斑試驗有哪些方法類型？檢測人不同Ig形成細胞的溶血空斑試驗常用何種方法？它們的原理如何？二、溶血素測定法(Hemolysinquantitativedetermination)【實驗原理】SRBC免疫的動物血清中存在有溶血素，在補體存在下能使溶血素致敏的SRBC發(fā)生溶血反應，用分光光度計檢測溶血釋放的血紅蛋白，即可確定免疫動物血清中溶血素的含量，從而可評價機體體液免疫功能狀態(tài)?！驹噭┖推鞑摹?．小白鼠18~22g。2．SRBC懸液將SRBC用生理鹽水洗3次，按壓積用生理鹽水配成10％濃度(約2×109/ml)，用于免疫小鼠。另按壓積用工作BBD配成4％的濃度，用于測定溶血素。3．補體豚鼠混合新鮮血清，用時用工作BBD1:30稀釋。4．貯存BBD(5×)和工作BBD配制見補體結合試驗。5．氰化高鐵血紅蛋白試劑(都氏試劑)NaHCO31.0gKCN0.05gK3Fe(CN)60.2g吐溫800.5ml加蒸餾水至1000ml。6．注射器、眼科鑷子、試管、離心管、吸管、水浴箱、分光光度計?！静襟E和方法】1．溶血素制備(1)取0.2ml10％SRBC懸液給小鼠腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射3天。(2)未次注射后6~8天時摘除小鼠眼球取血，分離血清。(3)將血清用工作BBD1:10稀釋，置56℃作用30min后備用2．溶血素測定(1)取1:10稀釋血清及4％SRBC懸液各0.2ml，混勻后置37℃(2)加入工作BBD0.8ml，1:30稀釋補體0.8ml，混勻，置37℃水浴1h(或放4(3)到時取出離心2000r/min10min。取上清液1ml，加入氰化高鐵血紅蛋白試劑3ml，混勻，置室溫10min后測A540nm吸光度。3．50％溶血(CH50)管制備。(1)取0.1ml4％SRBC懸液，加入1.5ml蒸餾水，完全溶血后再加入貯存BBD0.4ml，混勻。(2)取出1ml，加入氰化高鐵血紅蛋白試劑3ml，混勻，置室溫10min后測吸光度，用氰化高鐵血紅蛋白試劑做空白對照。測值為1個CH50的吸光度?！窘Y果判定】1．CH50單位計算：2．以CH50單位數(shù)表示溶血素含量?！咀⒁馐马棥?．溶血素測定所用玻璃器材必需十分潔凈。2．補體最好用混合的新鮮豚鼠血清，用前臨時稀釋。3．溶血素測定管離心后發(fā)現(xiàn)完全溶血，或溶血甚微，應將測試血清稀釋度調整后再重新測定。4．SRBC不能溶血，應作SRBC-補體對照：取4％SRBC懸液0.2ml，加入工作BBD1.0ml，1:30稀釋補體0.8ml；按實驗溫育、離心后應無溶血現(xiàn)象?？瞻讓φ眨喝≡撋锨逡?.0ml，加入氰化高鐵血紅蛋白試劑3.0ml，置室溫10min，應以此作為溶血素比色測定的空白對照管。5．收獲免疫血清時應避免溶血，若溶血嚴重，測定結果應予校正：取1:10稀釋血清0.1ml，加入工作BBD0.5ml，1:30稀釋補體0.4ml，氰化高鐵血紅蛋白試劑3ml，混勻，置室溫10min后以氰化高鐵血紅蛋白試劑為空白對照測吸光度，并以下式校正結果。6．溶血素測定時4℃【方法評價】此法簡便、重復性好、結果準確、客觀?！九R床意義】常用于藥物篩選及免疫藥理作用的研究?！舅伎碱}】該試驗與補體結合試驗中的溶血素測定、血清總補體活性測定在原理、方法和應用上有何異同？三、酶聯(lián)免疫斑點試驗(Enzyme-linkedimmunospotassay)【實驗原理】酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)試驗是一種直接檢測細胞分泌產物的方法，以此可評價被測細胞的功能、特性。其原理與ELISA類似，此處以測定B細胞分泌抗體活性介紹其檢測原理。該方法是用已知抗原包被組織培養(yǎng)板或平皿，再加入B細胞培養(yǎng)3～4h，B細胞沉積到底部，分泌的抗體可與鄰近包被抗原結合，就像一個細胞的足印。因此在加入酶標抗相應同種型Ig抗體(二抗)并經酶促反應后，底物形成不溶性顏色斑點，據(jù)此可檢測抗體的含量；并可在低倍光學顯微鏡下通過計數(shù)斑點即可知抗體形成細胞數(shù)?！驹噭┖推鞑摹?．抗原包被緩沖液PBS。2．封閉液含5%的新生小牛血清(NCS)或含1%的牛血清白蛋白(BSA)的PBS。3．PBS-T加入0.005%Tween-20及0.1%BSA的PBS。4．RPMI-1640培養(yǎng)液含5%NCS。4．HRP或堿性磷酸酶標記的二抗。6．1.2％瓊脂糖用雙蒸水配制，加熱溶化。7．1％瓊脂糖用PBS-T溶液配制。用前加熱溶化，置46℃水浴平衡8．凝膠底物(1)HRP-底物：將50mg1,4-對苯二胺(1,4-p-phenylenediamine，PPD)溶于2ml甲醇中，在應用前加入50μl30%H2O2和46℃預溫的1％(2)堿性磷酸酶底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolylpho-sphate，BCIP)與等體積的1.2％瓊脂糖混合。BCIP與堿性磷酸酶反應形成藍色斑點。9．可溶性底物(1)HRP底物：25mg3-氨基-9-乙基咔巴唑(3-amino-9-ethycarbazole，AEC)溶于2ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)中，加入95ml0.1mol/L醋酸鈉緩沖液(pH5.0)。經0.45m濾膜過濾，除去沉淀，獲無色溶液，加入40l30%H2O(2)堿性磷酸酶底物：將15mgBCIP和30mgNBT分別溶于1mlDMP中。BCIP和NBT溶液與100ml0.1mol/LNaHCO3-1.0mol/LMgCl2(pH9.8)混合。BCIP或BCIP-NBT與堿性磷酸酶反應形成藍色斑點。10．96孔板聚苯乙烯培養(yǎng)板(亦可用6孔、24孔、48孔板)，或聚苯乙烯平皿(直徑為40~50mm)，或帶有硝酸纖維膜的96孔板；微量移液器、CO2孵育箱、光學顯微鏡等?！静襟E和方法】1．包被用PBS將抗原作適當稀釋后包被聚苯乙烯培養(yǎng)板或聚苯乙烯平皿，4℃過夜或37℃孵育2h。用PBS洗滌平皿或培養(yǎng)板3次，每次2~3min。包被好的平皿或培養(yǎng)板置2．封閉加入封閉液，每孔200l，平皿為2ml，置373．加樣反應加入用RPMI-1640稀釋的抗體分泌細胞(1×106/ml)，每孔100~200l，平皿為2ml。置37℃5%CO2的溫箱3~4h或過夜。用PBS-T洗滌去除細胞，方法同上。注意防止4．結果測定：每孔加入酶標二抗50~100l(2ml/平皿)，置室溫(25℃)2~3h或4℃過夜。用PBS洗滌3次。(1)凝膠底物法加凝膠底物，每孔50~100l，平皿為2ml，快速振搖微孔板或平皿使凝膠平鋪，置室溫使凝膠凝固(需(2)可溶性底物法加可溶性底物50l至96孔板(盛有硝酸纖維膜)。首先加入堿性磷酸酶底物，置室溫5~10min，顯藍色斑點，用PBS漂洗；然后加入HRP底物，再置【結果判定】可在低倍鏡下計數(shù)斑點形成細胞(spot-fomingcells，SFC)。陰性和空白對照應無斑點出現(xiàn)。有斑點形成為陽性，無斑點出現(xiàn)為陰性?！咀⒁馐马棥?．實驗條件應統(tǒng)一；并做好陰性、陽