02-紫外可見分光光度法

紫外可見分光光度法分光光度法基本原理：測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)光的吸收度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。分類：吸收光波長(zhǎng)范圍200～400nm，可用于物質(zhì)的定性和定量分析吸收光波長(zhǎng)范圍400～780nm，用于有色物質(zhì)的定性和定量分析吸收光波長(zhǎng)范圍2.5—1000m，用于已知結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物鑒別紫外分光光度法可見分光光度法紅外分光光度法

紫外和可見分光光度法合稱為紫外—可見分光光度法。1定性鑒定各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會(huì)相同，因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線2純度檢驗(yàn)用紫外吸收光譜確定試樣的純度是比較方便的。如果一化合物在紫外區(qū)沒有吸收峰，而其雜質(zhì)有較強(qiáng)吸收，就可方便的檢出該化合物中的痕量雜質(zhì)。3結(jié)構(gòu)分析紫外-可見吸收光譜一般不用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結(jié)構(gòu)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)還是有一定價(jià)值。應(yīng)用P43第一節(jié)紫外-可見分光光度計(jì)的使用P14分光光度計(jì)工作原理：采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的裝置，通過系列分光裝置，得到一束平行的波長(zhǎng)范圍很窄的單色光，透過一定厚度的試樣溶液后，部分光被吸收，剩余的光照射到光電元件上，產(chǎn)生光電流，在儀器上可讀取相應(yīng)的吸光度或透光率，完成測(cè)定。0.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示1.單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性，且操作麻煩，任一波長(zhǎng)的光均要用參比調(diào)T=100﹪后，再測(cè)樣品一、紫外可見分光光度計(jì)類型2.雙光束分光光度計(jì)比值光源單色器試樣池檢測(cè)器顯示光束分器自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。是目前用的最多的分光光度計(jì)。裂參比池3.雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)光源單色器單色器切光器檢測(cè)器吸收池兩種不同波長(zhǎng)的單色光，經(jīng)切光源后，分時(shí)交替照射于同一吸收池，再由檢測(cè)器測(cè)量和記錄樣品溶液對(duì)兩束波長(zhǎng)的吸收差。不需要參比溶液；可以消除背景吸收干擾；適合多組分混合物、渾濁試樣的定量分析，可以測(cè)定較高濃度的樣品溶液。可進(jìn)行導(dǎo)數(shù)光譜分析。價(jià)格昂貴。二．紫外可見分光光度計(jì)的組成部分光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示系統(tǒng)1．光源

在所需光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射連續(xù)的、足夠強(qiáng)度、穩(wěn)定的輻射光?？梢妳^(qū)：鎢燈、碘鎢燈；

通常用6～12V鎢絲燈作可見光區(qū)的光源，最適宜的使用范圍在360—800nm。氙燈氫燈鎢燈紫外區(qū)：氫燈、氘燈、氚燈光源應(yīng)該穩(wěn)定，即要求電源電壓保持穩(wěn)定。為此，通常在儀器內(nèi)同時(shí)配有電源穩(wěn)壓器。色散原理：依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過棱鏡時(shí)折射率不同分光入射狹縫準(zhǔn)直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800600500400單色器是將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置。單色器由棱鏡或光柵等色散元件及狹縫和透鏡等組成。其中色散元件是關(guān)鍵部件。2．單色器

（1）棱鏡：根據(jù)光的折射原理而將復(fù)合光色散為不同波長(zhǎng)的單色光，然后再讓所需波長(zhǎng)的光通過一個(gè)很窄的狹縫照射到吸收池上。玻璃棱鏡用于可見光范圍，石英棱鏡則在紫外和可見光范圍均可使用。（2）光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有多條等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。

光柵可根據(jù)光的衍射和干涉原理將復(fù)合光色散為不同波長(zhǎng)的單色光，然后再讓所需波長(zhǎng)的光通過狹縫照射到吸收池上。其分辨率比棱鏡大，可用的波長(zhǎng)范圍也較寬。3．吸收池吸收池也稱比色皿，用于盛放參比溶液或待測(cè)溶液。它是由無色透明、耐腐蝕、化學(xué)性質(zhì)相同、厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分為0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm。在可見光區(qū)測(cè)量吸光度時(shí)使用玻璃吸收池，紫外區(qū)則使用石英吸收池。使用比色皿時(shí)應(yīng)注意保持清潔、透明，避免磨損透光面。經(jīng)常使用的吸收池應(yīng)于清洗后浸泡在蒸餾水中保存。

使用前需配對(duì)檢驗(yàn)，成套吸收池其透光率之差應(yīng)<0.5%

。

4．檢測(cè)器

檢測(cè)器的作用是接受從比色皿發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。分為光電管和光電倍增管。光電管：光電管依其對(duì)光敏感的波長(zhǎng)范圍不同分為紅敏和紫敏兩種。紅敏光電管是在陰極表面涂銀和氧化銫，適用波長(zhǎng)范圍為625—1000nm；紫敏光電管是陰極表面涂銻和銫，適用波長(zhǎng)范圍為200—625nm。光電倍增管：靈敏度最高，比光電管高200多倍。光電管改進(jìn)而成，管中有若干稱為倍增極的附加電極。適用波長(zhǎng)范圍為160～700nm。光電倍增管在現(xiàn)代的分光光度計(jì)中被廣泛采用。顯示裝置的作用是把放大的信號(hào)以吸光度A或透光率T的方式顯示或記錄下來。分光光度計(jì)常用的顯示裝置是檢流計(jì)、微安表、數(shù)字顯示記錄儀。

很多型號(hào)的分光光度計(jì)裝配有微處理機(jī)，一方面可對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行操作控制，另一方面可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。5．顯示系統(tǒng)三、紫外可見分光光度計(jì)的使用方法定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收在一定實(shí)驗(yàn)條件下,A∝cA

c增大AB

A

第二節(jié)紫外-可見分光光度法的定性分析P81、分子吸收光譜的產(chǎn)生在分子中，除了電子相對(duì)于原子核的運(yùn)動(dòng)外，還有核間相對(duì)位移引起的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)。這三種運(yùn)動(dòng)能量都是量子化的，并對(duì)應(yīng)有一定能級(jí)。電子能級(jí)振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)BA若用△E電子、△E振動(dòng)、△E轉(zhuǎn)動(dòng)分別表示電子能級(jí)差、振動(dòng)能級(jí)差、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)差則△E電子

△

E振動(dòng)

△

E轉(zhuǎn)動(dòng)分子的總能量可以認(rèn)為是這三種能量的總和：

E分子=E電子+E振動(dòng)+E轉(zhuǎn)動(dòng)當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或某溶液時(shí)，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子等粒子與吸光子作用，光子的能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，使原子核外層電子由低能量軌道躍遷到高能量軌道，即由基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)。M(基態(tài))+h

M*(激發(fā)態(tài))這個(gè)過程即是物質(zhì)對(duì)光的吸收。當(dāng)用頻率為

的電磁波照射分子，由于分子、原子或離子的能級(jí)是量子化的，不連續(xù)的，只有光子的能量(h

)與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差(

E)相等時(shí)，才能被吸收?！鱁=h（h為普朗克常數(shù)）不同物質(zhì)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)的能量差不同，選擇吸收光子的能量也不同，即吸收的波長(zhǎng)不同。

具有單一波長(zhǎng)的光叫單色光，比如紅，藍(lán)光等。

由不同波長(zhǎng)的光組成的光叫復(fù)色光。比如日光等

如兩種適當(dāng)顏色的單色光按適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度比例混合能得到白光，則這兩種顏色的光叫做互補(bǔ)色光。

2、光的種類P7溶液的顏色

⑴溶液為什么會(huì)有顏色？

由于溶液中的質(zhì)點(diǎn)選擇性地吸收某種顏色的光所引起的。

⑵吸收光與溶液顏色的關(guān)系：

當(dāng)白光通過某一均勻溶液時(shí)：CuSO4溶液：之所以呈藍(lán)色，是因?yàn)槲樟税坠庵械狞S光，透過其黃光的互補(bǔ)光藍(lán)光。①如溶液對(duì)其全不吸收，光全透過，溶液為無色；②如溶液對(duì)其全部吸收，無光透過，溶液呈黑色；③如溶液對(duì)其部分吸收，其余光透過，溶液呈透過光的顏色。2、物質(zhì)吸收光譜曲線P8

某一溶液對(duì)何種波長(zhǎng)的光吸收？吸收的程度如何？

這可通過使不同波長(zhǎng)的光通過某一固定濃度的有色溶液，分別測(cè)量每一波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)的光的吸收程度[吸光度

A]，作A-λ曲線，即吸收光譜曲線。KMnO4溶液的max=525nm

max/nm吸收強(qiáng)度綠光被吸收特點(diǎn):①為帶狀光譜，具有最大吸收波長(zhǎng)。②不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似，

max不變。但是不同物質(zhì)，其吸收曲線形狀和

max不一樣，所以可作為定性分析的依據(jù)。③不同濃度的同一種物質(zhì)，在

max處吸光度隨濃度變化的幅度最大，測(cè)定的靈敏度最高，所以通常選取在

max處測(cè)量。1）生色團(tuán)：含有π鍵的不飽和基團(tuán)，簡(jiǎn)單的生色團(tuán)由雙鍵或三鍵組成（如乙烯基、乙炔基等）2）助色團(tuán)：本身沒有生色功能（不能吸收波長(zhǎng)大于200nm的光），但當(dāng)與生色團(tuán)連接時(shí)，有增強(qiáng)生色團(tuán)生色能力的基團(tuán)吸電子：極性基團(tuán)，如—OH，—NH2，—NHR，-OR,-SH，-SR給電子基團(tuán)：帶有n電子（未成鍵的孤對(duì)電子）的雜原子基團(tuán)，如-Cl，-Br等3、紫外吸收?qǐng)D譜的常用術(shù)語P39

（3）藍(lán)移、紅移藍(lán)移（或紫移）：指吸收峰向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，紅移：指吸收峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)（共軛效應(yīng)、引入助色團(tuán)或改變?nèi)軇┑臉O性）。吸收波長(zhǎng):-CH3I>-CH3Br>-CH3OH>

-CH3Cl>CH3F

習(xí)題P46第20題（4）增色效應(yīng)和減色效應(yīng)前者指吸收強(qiáng)度增加，后者指吸收強(qiáng)度減小。（1）270-750nm無吸收峰。飽和化合物，單烯。（2）

270-350nm有吸收峰（ε=10-100L/（mol*cm）），含有一個(gè)簡(jiǎn)單的非共軛且含有n電子的生色團(tuán)（3）

250-300nm有中等強(qiáng)度的吸收峰,（ε=200-2000L/（mol*cm

），如苯環(huán)。（4）

210-250nm有強(qiáng)吸收峰，表明可能含有2個(gè)共軛雙鍵；在260nm,300nm,330nm有強(qiáng)吸收峰，說明是3個(gè)或3個(gè)以上雙鍵的共軛體系。

（5)若吸收峰延伸至可見光區(qū)，則可能是長(zhǎng)鏈共軛或稠環(huán)化合物

習(xí)題P46第21,22題4、常見有機(jī)化合物的紫外可見吸收光譜一、朗伯-比爾定律

朗伯-比爾定律是說明物質(zhì)對(duì)單色光吸收的強(qiáng)弱與吸光物質(zhì)的濃度和液層厚度間關(guān)系的定律。第三節(jié)紫外可見分光光度法的定量分析P91、透光率和吸光度入射光強(qiáng)度I0，吸收光強(qiáng)度Ia，透過光強(qiáng)度It，反射光強(qiáng)度為IrI0

＝Ia+It+Ir被測(cè)溶液和參比溶液的吸收池同樣材料和厚度，反射光強(qiáng)度影響相互抵消，上式簡(jiǎn)化為I0＝

Ia+It

透射光的強(qiáng)度It與入射光的強(qiáng)度I0的比值稱為透光率(T)透光率愈大，溶液對(duì)光的吸收愈少。透光率的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度(A)當(dāng)A為0時(shí)，T（%）為100吸光度愈大，溶液對(duì)光的吸收愈多。

1760年，Lambert指出：一束平行單色光通過有色溶液后，光的吸收程度與溶液液層的厚度成正比。A=k1·b

1852年，Beer指出：一束平行單色光通過有色溶液后，光的吸收程度與溶液的濃度成正比。A=k2·c將Lambert定律和Beer定律合并起來，就得到Lambert-Beer定律。A=K·b·c2、光的吸收定律(Lambert-Beer定律)c：物質(zhì)的量濃度(mol·L-1)b：為液層厚度(cm)K:吸光系數(shù)。應(yīng)用的條件：入射光必須是單色光；吸收發(fā)生在稀的均勻的介質(zhì)中；吸收過程中，吸收物質(zhì)互相不發(fā)生作用。其數(shù)值的大小，與物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長(zhǎng)、溶劑種類及溶液溫度等因素有關(guān)。當(dāng)波長(zhǎng)等其他因素一定時(shí)，只與物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。兩種表示方法：

a：質(zhì)量吸光系數(shù)(L·g-1·cm-1)；

：摩爾吸光系數(shù)(L·mol-1·cm-1)。特點(diǎn)：不隨濃度和液層厚度的改變而改變，作為定性鑒別的參數(shù)；在

max處的摩爾吸光系數(shù)，常用

max表示，。不同物質(zhì)的λmax有時(shí)可能相同，但

max不一定相同，作為定性的依據(jù)；

max越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測(cè)定該物質(zhì)的靈敏度越高3、吸光系數(shù)（K）例：Cd2+濃度為140umol·L-1

，雙硫腙法顯色測(cè)定波長(zhǎng)為520nm，液層厚度2cm，吸光度為0.22，求

和透光率T。解：(1)

A=

bc

0.22=

214010-6

=785.7L·mol-1·cm-1(2)A=－lgT

=0.22

lgT=－0.22

T=10－0.22

=0.60=60%標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時(shí)），這種現(xiàn)象稱為對(duì)朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）光的因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學(xué)因素。正偏離負(fù)偏離Ac標(biāo)準(zhǔn)曲線4、影響朗伯—比耳定律的因素（1）光的因素

單色光不純，導(dǎo)致負(fù)偏差。

散射光的影響，膠體、乳濁液或懸濁液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通過比色皿（非平行入射光）產(chǎn)生正偏差為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波長(zhǎng)選定在待測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)且吸收曲線較平坦處。(2)化學(xué)因素吸光質(zhì)點(diǎn)的相互作用，濃度較大時(shí)，產(chǎn)生負(fù)偏差，朗伯-比爾定律只適合于稀溶液（C<10-2mol/L)。

平衡效應(yīng)：溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時(shí)。使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化，影響吸光度。

例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O

溶液中CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故此時(shí)溶液pH對(duì)測(cè)定有重要影響。

根據(jù)Lambert-Beer定律，以該物質(zhì)吸收光譜圖中的λmax為入射光，首先配制一個(gè)與被測(cè)溶液濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液cs，測(cè)其As，再將樣品溶液推入光路，測(cè)其Ax

，則試樣溶液的濃度cx為：此法適于非經(jīng)常性的分析工作，準(zhǔn)確度不如標(biāo)準(zhǔn)曲線法。二、紫外可見分光光度法的定量方法P24目視比色法——標(biāo)準(zhǔn)系列法原理：將標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測(cè)溶液在同樣的條件下進(jìn)行比較，當(dāng)溶液液層厚度相同,顏色深度一樣時(shí),兩者的濃度相等。1.單一組分的測(cè)定例：維生素B12的含量測(cè)定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀釋至10.00mL；另配制對(duì)照液，精密稱定對(duì)照品25.00mg，加水稀釋至1000mL。在361nm處，用1cm吸收池，分別測(cè)定吸光度為0.508和0.518，求B12注射液注射液的濃度（單位ug/mL)⑴測(cè)定步驟

①首先配制一系列被測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)其吸光度，繪出A-c工作曲線；②在相同條件下，測(cè)出被測(cè)物的吸光度Ax;③根據(jù)Ax的值在工作曲線上查處cx的大小。⑵適用范圍大批重復(fù)試樣的分析。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線法(工作曲線法)P292、多組分的定量方法P32三種情況：（1）兩組分吸收光譜不重疊（互不干擾）

兩組分在各自λmax下不重疊→分別按單組分定量令E=εbλ1→測(cè)A1→b組分不干擾→可按單組分定量測(cè)Caλ2→測(cè)A2→a組分干擾→不能按單組分定量測(cè)Ca（2）兩組分吸收光譜部分重疊原則：比爾定律、加和性原理步驟：（3）兩組分吸收光譜完全重疊——混合樣品測(cè)定3、差示分光光度法P33當(dāng)在吸光度很高或很低的范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析時(shí)，相對(duì)誤差比較大。本法是用比試樣濃度稍低（高吸光度差示分光光度法）或稍大（低吸光度差示分光光度法）的溶液做參比溶液進(jìn)行測(cè)定。高吸收法在測(cè)定高濃度溶液時(shí)使用。選用比待測(cè)溶液濃度稍低的已知濃度溶液作標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)節(jié)透光率為100%。低吸收法在測(cè)定低濃度溶液時(shí)使用。選用比待測(cè)液濃度稍高的已知濃度溶液作標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)節(jié)透光率為0。最精密法是同時(shí)用濃度比待測(cè)液濃度稍高或稍低的兩份已知溶液作標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別調(diào)節(jié)透光率為0或100%。

物質(zhì)的吸收光譜與測(cè)定條件有密切的關(guān)系。測(cè)定條件（溫度、溶劑極性、pH等）不同，吸收光譜的形狀、吸收峰的位置、吸收強(qiáng)度等都可能發(fā)生變化。第四節(jié)紫外可見分光光度法的條件選擇P28(一）測(cè)定波長(zhǎng)的選擇“吸收最大

max

，干擾最小”A

X

maxY

（二）參比溶液(空白溶液)在測(cè)定時(shí)用空白溶液調(diào)節(jié)儀器A=0(T=100%),以消除溶液中其它物質(zhì)的干擾,抵消比色皿對(duì)光反射、吸收.1)溶劑參比：只有被測(cè)組分有色，試液、試劑、顯色劑均無色(無吸收)，則可用溶劑如純水作參比溶液.2)試劑參比：試液無色,顯色劑或其它試劑有色(有吸收),則應(yīng)選試劑空白.3)試樣參比：試劑、顯色劑均無色(無吸收),試液中其它組分有色,則應(yīng)采用不加顯色劑的試液作參比溶液.選擇參比溶液的總原則是:使試液的吸光度能真正反映待測(cè)組分的濃度.4)退色參比：指在吸光試樣溶液（或顯色溶液）中加入適當(dāng)試劑，將吸光物質(zhì)或顯色化合物破壞（或顏色退去）后的溶液.1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434濃度測(cè)量的相對(duì)誤差與T(或A)的關(guān)系實(shí)際工作中，應(yīng)控制T在15～65％,

A在0.2～0.8之間(調(diào)溶液濃度，吸收池厚度)（三）、吸光度的測(cè)量范圍

最佳值最佳讀數(shù)范圍（四）、顯色反應(yīng)條件的選擇P271.顯色劑的選擇

靈敏度高，選擇性好。（一對(duì)一）

Cu~NH3（綠藍(lán)色）

e620=1.2×102

Cu~雙硫腙（紫紅色）

e533=5.0×104顯色產(chǎn)物組成恒定,性質(zhì)穩(wěn)定。顯色產(chǎn)物與顯色劑色差大,顯色時(shí)顏色變化明顯，試劑空白值小。