第八章分子生物學(xué)研究方法下模板

一、原位雜交技術(shù)

原位雜交（Insituhybridization,ISH)

是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。通?？煞譃镽NA原位雜交和染色體原位雜交。第八章分子生物學(xué)研究方法(下)11/2/20241RNA原位雜交：

用放射性或非放射性標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，就可通過(guò)檢測(cè)放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞水平上做出定性定量分析。11/2/2024211/2/20243染色體原位雜交技術(shù)是DNA探針與染色體上的DNA雜交，并在染色體上直接進(jìn)行檢測(cè)的分子標(biāo)記技術(shù)。目前發(fā)展最快的是熒光素標(biāo)記的原位DNA雜交技術(shù)，即熒光原位雜交技術(shù)（fluorescenceinsituhybridization,簡(jiǎn)稱FISH技術(shù)），是利用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標(biāo)記的探針?lè)肿犹禺愋缘慕Y(jié)合來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體上的位置。染色體原位雜交11/2/20244染色體專一位點(diǎn)探針11/2/2024511/2/202461、酵母單雜交法轉(zhuǎn)錄因子cDNA酵母轉(zhuǎn)錄激活域酵母細(xì)胞表達(dá)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)順式作用元件啟動(dòng)子報(bào)告基因報(bào)告基因是否表達(dá)？二、蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)11/2/202472、酵母雙雜交系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(bindingdomain,BD)(Activationdomain,AD)11/2/20248

將編碼已知蛋白的DNA序列連接到能夠表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)構(gòu)域的載體上，使之表達(dá)融合蛋白。靶蛋白DNA結(jié)合蛋白報(bào)告基因啟動(dòng)子DNA結(jié)合蛋白誘餌11/2/20249編碼轉(zhuǎn)錄激活域的DNA待篩選cDNA文庫(kù)片段獵物

獵物與誘餌共同在酵母細(xì)胞中表達(dá)，假如獵物載體中表達(dá)的蛋白有與靶蛋白作用的蛋白，這時(shí)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域與激活域就會(huì)靠攏，激活報(bào)告基因表達(dá)。

總之，通過(guò)判斷報(bào)告基因是否表達(dá)，來(lái)分離與已知蛋白作用的新基因。10三、RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷體內(nèi)靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。11/2/202411放大作用DICER：核酸酶RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNAinduciblesilentcomplex：

RISC)阻斷靶基因表達(dá)11/2/202412RNAi的生物學(xué)功能：

RNAi的本質(zhì)是一種由RNA介導(dǎo)的序列特異性的獲得性免疫反應(yīng)，是一種原始的基因組對(duì)抗外來(lái)基因表達(dá)的保護(hù)機(jī)制，是生物體在基因組水平上的免疫系統(tǒng)。11/2/202413線蟲(chóng)體內(nèi)的RNAi

線蟲(chóng)中RNAi效應(yīng)的檢測(cè)（左面）兩條線蟲(chóng)表現(xiàn)為綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)類型品系，該品系含有一個(gè)普遍性表達(dá)的GFP報(bào)告基因重組質(zhì)粒（帶有核內(nèi)定位信號(hào)位點(diǎn)）。（右面）喂食表達(dá)爭(zhēng)對(duì)GFP的dsRNA的細(xì)菌后，整個(gè)蟲(chóng)體的GFP信號(hào)消失。11/2/202414四、

基因芯片及數(shù)據(jù)分析

DNA芯片(DNAchip)，又稱DNA微列陣(DNAmicroarray)，是指通過(guò)微電子、微加工技術(shù)在平方厘米大小的固體介質(zhì)表面構(gòu)建的微型分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)和其他生物成分的快速、高效、敏感的處理與分析。1、基因芯片技術(shù)原理11/2/202415基因芯片的制作原理11/2/2024162、基因芯片的主要制作過(guò)程:1、經(jīng)大規(guī)模PCR擴(kuò)增獲得獨(dú)立cDNA插入片段；2、用機(jī)械手將PCR產(chǎn)物點(diǎn)到玻璃片了，變性固定；3、分別從不同組織或器官中分離mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA；4、分別用兩種不同的熒光染料標(biāo)記兩種cDNA；5、將標(biāo)記后的cDNA與點(diǎn)好的芯片進(jìn)行雜交；6、激光掃描芯片雜交結(jié)果，計(jì)算機(jī)處理；7、分析雜交數(shù)據(jù)。11/2/202417按基因芯片點(diǎn)陣的制備方法，基因芯片可以分為：原位合成芯片（syntheticgenechip）適用于寡核苷酸。根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的點(diǎn)陣序列在每個(gè)位點(diǎn)通過(guò)有機(jī)合成的方式直接聚合得到所要求的探針?lè)肿印NA微陣列芯片（DNAmicroarray）多用于大片段DNA，有時(shí)也用于寡核苷酸，甚至mRNA。將合成好的探針、cDNA、基因組通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。11/2/202418根據(jù)基因芯片的用途可分為:基因表達(dá)分析芯片基因多態(tài)性分析芯片疾病診斷芯片發(fā)現(xiàn)新基因疾病診斷11/2/2024193、基因芯片數(shù)據(jù)分析11/2/2024201、凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)又叫凝膠阻滯試驗(yàn)(gelretardationassay)，是在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡(jiǎn)單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。

原理：DNA與蛋白的結(jié)合導(dǎo)致了電泳時(shí)遷移率的降低。五、其他分子生物學(xué)技術(shù)11/2/202421凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖放射性標(biāo)記的DNA由于同一種細(xì)胞蛋白質(zhì)B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動(dòng)速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影****凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合******BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合用來(lái)判斷是否存在與該DNA結(jié)合的蛋白。222、噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)的原理：將編碼“誘餌”的DNA片段插入到噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因融合。該重組噬菌體侵染宿主細(xì)菌后，復(fù)制形成大量帶有外殼蛋白的