常見(jiàn)測(cè)蛋白濃度方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

第第頁(yè)常見(jiàn)測(cè)蛋白濃度方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較蛋白濃度測(cè)定的方法有很多，但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上依據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果精準(zhǔn)明確，但操作多而雜，用于大批量樣品的測(cè)試則不太合適；Lowry法精準(zhǔn)明確度較高，但是比較費(fèi)時(shí)，且每步的時(shí)間要求相對(duì)嚴(yán)格；Bradford法靈敏簡(jiǎn)便，但易受去垢劑的影響；BCA法以其試劑穩(wěn)定，抗干擾本領(lǐng)強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受歡迎。在蛋白濃度測(cè)定中，以下面四種方法為常見(jiàn)：1.Bradford法：原理：在酸性環(huán)境中，蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)G250染料，導(dǎo)致染料的汲取峰發(fā)生位移，從紅棕色形式（汲取峰465nm）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色形式（汲取峰610nm）。這兩種形式在595nm處光汲取差別most大，因此595nm是測(cè)定考馬斯染料—蛋白復(fù)合物的藍(lán)色的best波長(zhǎng)。結(jié)合到每個(gè)蛋白質(zhì)分子上的考馬斯染料分子數(shù)大概與蛋白所帶正電荷的數(shù)量成正比，因此通過(guò)比色法可以測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，可以檢測(cè)到1μg/ml的蛋白質(zhì)濃度。2.反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)時(shí)間只需5—10分鐘。3.操作簡(jiǎn)單，只需加入試劑，混合均勻即可。4.適用范圍廣，適用于大部分類型的蛋白質(zhì)。5.不受溶液中還原劑的影響。缺點(diǎn)：1.受干擾：某些離子和化合物會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果，去垢劑（表面活性劑）會(huì)產(chǎn)生猛烈干擾，使得與很多常用的緩沖液不兼容。2.靈敏度不穩(wěn)定：不同蛋白質(zhì)的靈敏度不同，有些蛋白質(zhì)可能無(wú)法被檢測(cè)到。肽或蛋白質(zhì)的分子量必需大于3,000道爾頓才略被檢出。3.需要標(biāo)準(zhǔn)曲線：需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，加添了操作步驟。近來(lái)市場(chǎng)上已顯現(xiàn)能兼容去垢劑的Bradford法蛋白定量試劑盒，可以兼容各種常用的蛋白緩沖液，大大拓展了應(yīng)用范圍。2.BCA法：原理：在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子，二喹啉甲酸（BCA）與亞銅離子形成紫色的絡(luò)合物，這種絡(luò)合物溶于水并在562nm處產(chǎn)生光汲取峰值，光汲取強(qiáng)度在肯定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量呈貌似線性關(guān)系，因此使用比色法可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和定量。BCA法沒(méi)有反應(yīng)終點(diǎn)，反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間而連續(xù)進(jìn)行；通過(guò)一段時(shí)間的孵育后，反應(yīng)速度會(huì)變慢，從而可以對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，可以檢測(cè)到低至0.5μg/mL的蛋白質(zhì)。2.對(duì)蛋白質(zhì)分子量沒(méi)有要求，小分子量肽也可檢測(cè)。3.結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。4.可用于高通量的蛋白質(zhì)測(cè)定。5.與Bradford法相比，可耐受肯定濃度的去垢劑。缺點(diǎn)：1.受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM，DTT和巰基乙醇均低于1mM。2.對(duì)不同蛋白質(zhì)的反應(yīng)性不同，因此不同蛋白質(zhì)靈敏度有差別。3.與Bradford法相比，操作相對(duì)較多而雜，需要多個(gè)步驟。3.Lowry法：原理：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在肯定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。通過(guò)比色法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。適合于測(cè)定20mg/L—400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液，可檢測(cè)的蛋白質(zhì)量低達(dá)5mg，通常測(cè)定范圍是20～250mg。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可檢測(cè)低至1μg/mL的蛋白質(zhì)；對(duì)于大部分蛋白質(zhì)都有較好的線性關(guān)系。缺點(diǎn)：1.操作相對(duì)較多而雜，需要多個(gè)步驟；2.干擾物比較多，不但還原劑和去垢劑會(huì)產(chǎn)生干擾，酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。4.UV汲取法：原理：利用蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸）在280nm處的汲取峰，測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，無(wú)需添加試劑；可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品。缺點(diǎn)：靈敏度較低，只能檢測(cè)高濃度的蛋白質(zhì)；對(duì)于某些蛋白質(zhì)（如酶）會(huì)產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。5.瓊脂糖凝膠電泳：原理：通過(guò)比較待測(cè)樣品與已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)強(qiáng)度，估算待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的含量。優(yōu)點(diǎn)：1.瓊脂糖凝膠電泳測(cè)蛋白濃度簡(jiǎn)單易行，不需要昂貴的儀器設(shè)備。2.可以同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。3.可以測(cè)定不