核酸探針技術(shù)及應(yīng)用

核酸探針技術(shù)及應(yīng)用基因檢測技術(shù)的發(fā)展，使對某些疾病的診斷達(dá)到了特異性強(qiáng)、敏感性高及簡便快速的目的。近年來各種血清學(xué)方法發(fā)展很快，但血清學(xué)方法主要是測抗體，是間接的證據(jù)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用DNA—DNA雜交建立了核酸探針(Probe)技術(shù)，該技術(shù)是目前基因檢測最常用的方法，目前已成為診斷各種感染性疾病，惡性腫瘤，遺傳病，檢測抗生紊的耐藥性，法醫(yī)學(xué)鑒定及從分子水平上研究發(fā)病機(jī)制與流行病學(xué)規(guī)律等方面的一種重要手段。本文主要介紹了核酸探針技術(shù)的原理，核酸分子雜交方法及核酸探針的應(yīng)用等方面。一、核酸探針技術(shù)的原理DNA或RNA片段能識別特定序列基因的DNA片段，能與互補(bǔ)的核苷酸序列特異結(jié)合，這種用同位素非同位素標(biāo)記的單鏈DNA片段即為核酸探針。核酸探針技術(shù)是將雙鏈DNA經(jīng)加熱或鹼處理，使鹼基對間的氫鏈被破壞而變性，解開成兩條互補(bǔ)的單鏈。它們在一定溫度和中性鹽溶液條件下，又可按A—T，G—C堿基配對的原則重新組合成雙鏈為復(fù)性。這種重組合只是在兩股DNA是互補(bǔ)(同源)或部分互補(bǔ)(部分同源)的條件下才能實(shí)現(xiàn)。正是由于雙鏈DNA的這種可解離與重組合的性質(zhì)，才可用一條已知的單鏈DNA，用放射性同位素或其他方法標(biāo)記后制備成核酸探針，與另一條固定在硝酸纖維素濾膜上的變性單鏈DNA進(jìn)行雜交，(另一條DNA鏈與核酸探針是配對堿基，稱為靶)再用放射自顯影或其他顯色技術(shù)檢測，以確定有無與探針DNA(或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。因?yàn)樘结樦慌c靶病原體的DNA或RNA雜交，而不與標(biāo)本中存在的其他DNA或RNA雜交。二、核酸探針技術(shù)的基本方法被檢標(biāo)本用去污劑和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各種方法處理DNA使其變性，把DNA雙螺旋的兩條鏈分開，單鏈DNA結(jié)合于固態(tài)基質(zhì)上，(如濾膜)使其固定。再加上已制備好的探針進(jìn)行雜交，探針便可找出已固定的DNA中的互補(bǔ)序列，與之配對結(jié)合，然后洗掉未結(jié)合部分，由于探針已將放射性同位素?fù)饺耄儆脁射線敏感的膠片自顯影，見黑色影印者即為陽性。探針亦可用3H標(biāo)記，最后用液閃計(jì)數(shù)器計(jì)致。還可用生物素，抗生物素等標(biāo)記，最后用酶標(biāo)法顯色，均能得到滿意效果。1核酸探針的制備核酸探針可分為DNA探針、CDNA探針、RNA探針和寡糖核苷酸探針，因其種類不同制備方法也不同。1．1DNA探針DNA探針可分為基因探針和基因片段探針。全基因組基因探針的制備最簡單，只要將染色體DNA分離純化，然后進(jìn)行標(biāo)記即可。基因片段探針則需要將染色體DNA用限制性內(nèi)切酶酶解，得到許多隨機(jī)片段，然后與質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E·coli)，篩選含特異目的基因片段的克隆株進(jìn)行擴(kuò)增，再提取基因片段作探針。1．2CDNA探針通過提取純度較高的相應(yīng)mRNA或正鏈RNA病毒的RNA，反轉(zhuǎn)錄成CDNA作為探針。也可以進(jìn)一步克隆在大腸桿菌中進(jìn)行無性繁殖，再從重組質(zhì)粒中提取CDNA作探針。1．3RNA探針有些雙鏈RNA病毒的基因組在標(biāo)記后，可直接用作探針。另一種是從CDNA衍生而來的RNA探針，可由很強(qiáng)的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄而得。其優(yōu)點(diǎn)為CDNA探針?biāo)患?，由于RNA—RNA復(fù)合物比DNA—RNA復(fù)合物穩(wěn)定，所以其靈敏度可提高10倍以上。1．4寡核苷酸探針用DNA合成儀可以合成50個核苷酸以內(nèi)的任意序列的寡核苷酸片段，以此作為核苷酸探針，也可將它克隆到M13系統(tǒng)中使之釋放含探針序列的單鏈DNA，使探針的制備和標(biāo)記簡化。2核酸探針的標(biāo)記核酸探針過去采用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，常用標(biāo)記物有α32PdNTP，35SdNTP等。同位素的選擇是依檢測類型而定，制就的DNA探針先經(jīng)加熱變性成單鏈后再與固定于硝酸纖維素膜上的待測DNA雜交，如為同源則與之結(jié)合，經(jīng)放射自顯髟后，膜上出現(xiàn)黑色區(qū)。放射性同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是敏感度高，對被檢樣品處理要求不高，假陽性率小，且32P代替磷原予不改變堿基空間結(jié)構(gòu)，所以不影響雜交反應(yīng)的動力學(xué)曲線。其缺點(diǎn)是半衰期短，費(fèi)用昂貴，同時(shí)需防護(hù)設(shè)備，另外放射自顯影時(shí)問較長。因此近年來發(fā)展了非放射性標(biāo)記，用于標(biāo)記的非放射性物質(zhì)有金屬(如汞)，半抗原(如地高辛)，生物素。和酶等，應(yīng)用較多的是生物素。非放射性標(biāo)記的特點(diǎn)是保存時(shí)問長，檢測時(shí)使用方便，其最大缺點(diǎn)是靈敏度一般比放射性同位素低，但最近報(bào)道用化學(xué)發(fā)光物吖啶酯直接標(biāo)記DNA探針，用化學(xué)發(fā)光儀檢測雜交體，其靈敏度超過放射性同位素標(biāo)記的探針?？梢杂枇匣瘜W(xué)發(fā)光物標(biāo)記技術(shù)和均相雜交技術(shù)相結(jié)合可能是未來核酸探針分析技術(shù)的發(fā)展方向。在這里介紹一種非放射性標(biāo)記“生物素核酸探針”，其基本原理為：生物素(Biotin)是一種B族維生素，能與抗生素蛋白——親和素(Avidin)或鏈霉親和素(Streptavidin)特異性結(jié)合，其解離平衡常數(shù)(KD)為10-5。每個生物素分子由四個相同亞基組成，每個亞基都能專一性地識別一個生物素分子的脲基環(huán)部分。當(dāng)生物素的戊酸側(cè)鏈通過酰胺鍵與其他分子相連后，其脲基環(huán)保持與親和素之一結(jié)合的能力，因而可通過生物素的戊酸側(cè)鏈與待測目標(biāo)相連。利用生物素和親和素專一結(jié)合的特點(diǎn)，加入與熒光物質(zhì)或酶相偶聯(lián)的親和素，去尋找被生物素所標(biāo)記的目標(biāo)，然后檢測熒光或酶反應(yīng)而檢待測目標(biāo)。3標(biāo)本處理首先從標(biāo)本中提取DNA作為靶源后方能用探針進(jìn)行檢測。提取DNA可用DNA提取儀，它是用一支包裝的小柱于30分鐘內(nèi)快速提取DNA的儀器。標(biāo)本經(jīng)快速過柱后，達(dá)到純化，DNA加熱變性使成單鏈(RNA是單鏈勿需予先變性)采取標(biāo)本可能是未知病原體懸液，亦可能是痰或糞便標(biāo)本等。目前已發(fā)展了不需抽提核酸而直接在細(xì)胞裂解液中進(jìn)行檢測的方法。用高濃度的硫氰酸胍直接使細(xì)胞裂解，并使細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)包括核酸酶變性，釋放出核酸，使纏繞的DNA分子解纏繞，形成一個適宜直接雜交的液相環(huán)境，這樣的標(biāo)本處理方法不僅減少了工作量，而且容易掌握，國外在愛滋病的病毒檢測中已應(yīng)用這種方法對血細(xì)胞進(jìn)行處理。樣品處理要考慮的另一個問題是待測樣品中目的序列的含量或總的核酸量。如果古量太低必然會影響檢測的靈敏度。解決的辦法是用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，它能在體外通過DNA聚合酶將目的序列的拷貝數(shù)特異地快速擴(kuò)增1O5～107倍，使標(biāo)本中目的序列的含量大為提高，便于檢測。目前PVCR法已廣泛應(yīng)用于DNA診斷的各種技術(shù)中，在遺傳病的產(chǎn)前診斷，傳染病的早期診斷和法醫(yī)物證鑒定中均取得了滿意的結(jié)果。4核酸分子雜交核酸分子雜交(nucleicacidbybridization)是指標(biāo)記的單核苷酸和所需檢測的目的單鏈核酸通過堿基配對互相結(jié)合的過程。若為雙鏈核酸則事先需要變性，使之打開成單鏈。肝癌。3.4法醫(yī)學(xué)物證鑒定罪犯的毛發(fā)、血斑或精斑等的鑒定可用DNA探針，如果樣品中目的序列的含量太低，可用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增而取得滿意效果。5．食品衛(wèi)生加工食品如乳、蛋及肉類制品要在制作過程中多次進(jìn)行沙門氏菌試驗(yàn)，需要5—7天時(shí)間并花費(fèi)大量人力物力，如果用探針只要2—3天完成，不但優(yōu)于培養(yǎng)的方法而且避免交叉反應(yīng)。綜上所述，目前用于