DB3708T 51-2024液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 第1部分：真姬菇

ICS65.020.20CCSB053708DB3708/T51—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出、歸口并組織實(shí)施。DB3708/T51—2024食用菌是可食用的大型真菌的統(tǒng)稱，如真姬菇、香菇、木耳、金針菇等。食用菌栽培使用的菌種是人工培育的純菌絲體及其培養(yǎng)基的混合體，根據(jù)不同的培養(yǎng)基質(zhì)又可分為固體菌種和液體菌種。不同食用菌的生物學(xué)特性不同，菌種生產(chǎn)條件差異較大，單一文件不能涵蓋所有食用菌種類，為了規(guī)范我市食用菌液體菌種生產(chǎn)和使用，確保我市食用菌生產(chǎn)持續(xù)健康發(fā)展，特制定液體菌種生產(chǎn)技術(shù)系列規(guī)程，本文件為該系列規(guī)程的第一部分。1DB3708/T51—2024液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程第1部分：真姬菇本文件規(guī)定了真姬菇液體菌種生產(chǎn)的人員要求、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)設(shè)施與設(shè)備、生產(chǎn)技術(shù)要求、液體菌種質(zhì)量要求、菌種保存、生產(chǎn)檔案等要求。本文件適用于真姬菇液體菌種的制備。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T150（所有部分）壓力容器GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T12728-2006食用菌術(shù)語GB19298食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范(附條文說明）NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1846食用菌菌種檢驗(yàn)規(guī)程3術(shù)語和定義GB/T12728界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1真姬菇hypsizygusmarmoreus屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，外形美觀，質(zhì)地脆嫩，味道鮮美，具有海蟹味，又名玉蕈、斑玉蕈。目前我國(guó)市場(chǎng)上有“蟹味菇”3.2母種stockculture經(jīng)各種方法選育得到的具有結(jié)實(shí)性的菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，也稱一級(jí)種、試管種。[來源：GB/T12728-2006，2.5.7]3.3液體菌種liquidspawn在搖瓶和發(fā)酵罐中通過液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的液體形態(tài)的食用菌菌種。3.4空氣壓縮機(jī)aircompressor2DB3708/T51—2024為液體菌種生產(chǎn)提供壓縮空氣的設(shè)備。3.5空氣過濾系統(tǒng)airfiltrationsystem對(duì)液體菌種生產(chǎn)所用空氣中的油、水、雜質(zhì)和雜菌等進(jìn)行過濾，達(dá)到無菌潔凈要求的設(shè)備，一般包括冷凍干燥機(jī)、吸附式干燥機(jī)、過濾器等。3.6罐壓tankpressure液體菌種生產(chǎn)過程中發(fā)酵罐內(nèi)保持的空氣壓力，單位：MPa。3.7通氣率aerationrate液體菌種培養(yǎng)過程中每分鐘通入發(fā)酵罐中無菌空氣體積與實(shí)際發(fā)酵液體積的比值。用vvm（每分鐘通入無菌空氣體積/發(fā)酵液體積）表示。3.8接種量inoculationamount接入的菌種體積與培養(yǎng)基體積的比值，用%表示。3.9液體菌種菌齡cellageofliquidspawn菌種接入培養(yǎng)基開始計(jì)算的液體菌種培養(yǎng)時(shí)間，用d表示。3.10發(fā)酵罐空消sterilizationforemptyfermenter對(duì)尚未加培養(yǎng)基的空發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。3.11投料addingculturemedium將配制好的培養(yǎng)基投放到發(fā)酵罐中。3.12定容constantvolume培養(yǎng)器中加入培養(yǎng)基后，加水至所要求體積。3.13發(fā)酵罐實(shí)消sterilizationforfermenter指對(duì)投料后的發(fā)酵罐進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。4人員要求工作人員應(yīng)熟練掌握菌種生產(chǎn)所需的專業(yè)技術(shù)，并注意保持個(gè)人衛(wèi)生。進(jìn)入凈化車間應(yīng)穿戴經(jīng)清洗干凈且消毒處理符合進(jìn)入凈化車間要求的工作服、口罩、鞋、帽等。5生產(chǎn)環(huán)境5.1環(huán)境要求環(huán)境空氣質(zhì)量應(yīng)符合GB3095要求。配制培養(yǎng)基用水宜使用純凈水，純凈水應(yīng)符合GB19298要求。其他生產(chǎn)用水應(yīng)符合GB5749要求。5.2生產(chǎn)場(chǎng)地、廠房設(shè)置和布局3DB3708/T51—2024生產(chǎn)場(chǎng)地、廠房設(shè)置和布局應(yīng)符合NY/T528的要求。增設(shè)搖瓶菌種培養(yǎng)室、發(fā)酵罐菌種培養(yǎng)室。凈化車間應(yīng)符合GB50073的要求。6生產(chǎn)設(shè)施與設(shè)備生產(chǎn)應(yīng)具備NY/T528規(guī)定的相關(guān)設(shè)施設(shè)備，還應(yīng)增加搖床、發(fā)酵罐系統(tǒng)。壓力容器應(yīng)使用經(jīng)有資質(zhì)部門生產(chǎn)與檢驗(yàn)的安全合格產(chǎn)品，符合GB/T150（所有部分）的規(guī)定。7生產(chǎn)技術(shù)要求7.1工藝流程真姬菇液體菌種生產(chǎn)工藝見圖1。圖1真姬菇液體菌種生產(chǎn)工藝流程7.2品種選擇從具有相應(yīng)資質(zhì)的供種單位引種，且種性清楚。引種后應(yīng)進(jìn)行適應(yīng)性出菇試驗(yàn)驗(yàn)證，選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的真姬菇品種。7.3母種生產(chǎn)7.3.1容器使用18mm×180mm或20mm×200mm玻璃試管，試管應(yīng)保持清潔、干燥。試管塞為棉塞（梳棉或化纖棉）或硅膠塞。4DB3708/T51—20247.3.2培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g/L（煮汁麥麩20g/L（煮汁葡萄糖20g/L，酵母浸粉3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L，瓊脂20g/L，純凈水1000mL。7.3.3培養(yǎng)基配制以配制1000mL培養(yǎng)基為例。選無青皮、未發(fā)芽的新鮮馬鈴薯洗凈、去皮、去芽眼，切成薄片，加水1000mL左右，麥麩用紗布包裹，與馬鈴薯共同煮20min～30min，用預(yù)濕的4層紗布過濾。取濾液加入20g瓊脂，邊煮邊攪拌至瓊脂全部融化。加入其它配料攪拌溶化，加水定容至1000mL。趁熱分裝，裝量為試管長(zhǎng)度的1/5～1/4，管口不能粘上培養(yǎng)基。7.3.4培養(yǎng)基滅菌將分裝好的試管直立放入滅菌鍋內(nèi)，用牛皮紙包住試管塞，鍋內(nèi)留有一定的空隙。檢查鍋內(nèi)水位，恒壓35min～40min。7.3.5擺斜面滅菌結(jié)束，自然降壓至零。打開鍋蓋，利用余熱烘干試管塞，將試管的一端斜放在1cm厚的木條上擺出斜面，斜面頂端距試管口不少于50mm。7.3.6接種培養(yǎng)檢查、核對(duì)菌種。于消毒后的接種箱或超凈工作臺(tái)上，用經(jīng)火焰消毒并冷卻后的接種針切?。?～5）mm×（3～5）mm的一塊母種迅速轉(zhuǎn)接于待接種試管斜面中央，接完種及時(shí)貼好標(biāo)簽，置于18℃~20℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種后2d～3d，觀察發(fā)菌情況，及時(shí)檢出雜菌污染、長(zhǎng)勢(shì)不良的試管。一般培養(yǎng)10d～14d、菌絲長(zhǎng)滿斜面后，及時(shí)使用或置于0℃~4℃冰箱中保存。7.3.7母種質(zhì)量要求菌絲白色、整齊、均勻、無角變、粉孢子少、無雜菌，生活力強(qiáng)，培養(yǎng)基不萎縮。應(yīng)符合NY/T1846要求。7.4搖瓶液體菌種生產(chǎn)7.4.1容器使用1000mL無色或近無色專用玻璃菌種瓶，瓶塞為棉塞（梳棉或化纖棉）或硅膠塞或?qū)Ｓ梅饪谕笟饽ぁ?.4.2培養(yǎng)基配方蟹味菇配方：馬鈴薯200g/L（煮汁葡萄糖20g/L，玉米粉20g/L，酵母浸粉3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L，純凈水1000mL。海鮮菇配方：馬鈴薯200g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀2g/L，純凈水1000mL。白玉菇配方：蔗糖20g/L，豆粕粉3g/L，硫酸鎂0.6g/L，磷酸氫二鉀0.25g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，純凈水1000mL。7.4.3培養(yǎng)基配制5DB3708/T51—2024以配制1000mL培養(yǎng)基為例。蟹味菇、海鮮菇：選無青皮、未發(fā)芽的新鮮馬鈴薯洗凈、去皮、去芽眼，切成薄片，加水1000mL左右，煮20min～30min，用預(yù)濕的4層紗布過濾、定容至1000mL。玉米粉提前用溫水?dāng)嚢杈鶆?，不能有結(jié)塊，加入濾液中煮沸，再加入其余的原料至溶解。培養(yǎng)基分裝入搖瓶中，裝液量為搖瓶容量的2/5～3/5，將瓶口用棉塞或硅膠塞或?qū)Ｓ猛笟夥饪谀し饪冢⒂门Ｆぜ埌?。白玉菇：按配方比例稱取原料加水?dāng)嚢杈鶆颍盅b入搖瓶中，裝液量為搖甁容量的2/5～3/5，將瓶口用棉塞或硅膠塞或?qū)Ｓ猛笟夥饪谀し饪?，并用牛皮紙包扎?.4.4滅菌按7.3.4要求執(zhí)行。7.4.5接種培養(yǎng)檢查、核對(duì)菌種。待培養(yǎng)基冷卻后于消毒過的接種箱或超凈工作臺(tái)上，用經(jīng)火焰消毒并冷卻后的接種針切?。?～5）mm×（3～5）mm的一塊母種迅速轉(zhuǎn)接于待接種搖瓶培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶接種5～6塊。接種結(jié)束后封口，置搖床上震蕩培養(yǎng)，搖床溫度控制在21℃~22℃,震蕩頻率為150rpm～180rpm，培養(yǎng)時(shí)間6d～7d。7.4.6搖瓶液體菌種檢驗(yàn)每日檢查菌液顏色、菌球形態(tài)和氣味，及時(shí)檢出渾濁、異味、泡沫異常的不合格菌種。7.4.7搖瓶菌種質(zhì)量要求菌液澄清，不渾濁，無雜菌、無異味；鏡檢無雜菌、菌絲形態(tài)光滑、豐滿；菌絲球、菌絲片段密集，靜置10min～15min，菌絲球體積占比不低于整個(gè)菌液的80%，可結(jié)束培養(yǎng)。7.5發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)7.5.1容器氣升式不銹鋼發(fā)酵罐，體積根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模自定。7.5.2發(fā)酵罐清洗發(fā)酵罐在每次使用后或再次使用前應(yīng)徹底清洗后才能投料使用。7.5.3發(fā)酵罐空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長(zhǎng)期放置、更換品種等情況出現(xiàn)其一時(shí)，應(yīng)進(jìn)行空消滅菌。發(fā)酵罐內(nèi)層及夾層加水至視鏡中線，啟動(dòng)加熱器加熱。首先排完夾層和內(nèi)層的冷空氣，然后關(guān)閉所有的閥門升溫升壓，在溫度升至100℃、0.05MPa壓力下，打開接種口放氣，排放罐內(nèi)冷空氣。當(dāng)溫度達(dá)到121℃~126℃、壓力在0.12MPa～0.15MPa時(shí)，維持40min。7.5.4空氣過濾系統(tǒng)檢查使用前，檢查空氣過濾系統(tǒng)工作是否正常，檢查空氣濾芯，要求濾芯無油污、無料污、無破損，外殼無污物、無破損。7.5.5培養(yǎng)基配方蔗糖20g/L，豆粕粉4g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸氫二鉀1g/L，消泡劑20uL/L~30uL/L。6DB3708/T51—20247.5.6培養(yǎng)基配制與投料、定容按配方稱取原料。用溫水把豆粕粉攪拌均勻，不能有結(jié)塊，再加入其它配料，攪拌均勻，通過吸管或漏斗加入罐體，加水定容至所需體積。培養(yǎng)基投料量為罐體總?cè)莘e的70%～80%，最后擰緊上料口蓋。7.5.7發(fā)酵罐實(shí)消與培養(yǎng)基滅菌開啟加熱器對(duì)發(fā)酵罐夾層及內(nèi)層加熱，當(dāng)壓力達(dá)到0.05MPa時(shí)，打開接種口放冷氣至接種口蒸汽變直時(shí)關(guān)閉接種口，待培養(yǎng)液溫度升至95℃時(shí)，打開氣泵對(duì)發(fā)酵液攪拌2min，氣泵停止通氣。當(dāng)壓力達(dá)到0.12MPa～0.15MPa、溫度為121℃開始計(jì)時(shí)，維持40min。7.5.8降溫培養(yǎng)基滅菌完畢，迅速通水降溫。降溫過程中發(fā)酵罐要適當(dāng)通氣。一方面攪拌降溫，另一方面加壓，使發(fā)酵罐維持正壓，盡快使培養(yǎng)液溫度降至30℃以下。7.5.9接種接入搖瓶種子，接種量為0.1%～0.3%。將搖瓶接種管和發(fā)酵罐接種口用75%酒精消毒，用95%酒精的火焰圈套在接種口上，輕微打開呼吸器閥門，使發(fā)酵罐壓力為0。點(diǎn)燃火焰圈，搖瓶接種管放在火焰上方。用鑷子去掉接種管上的牛皮紙和棉塞，將膠管插入接種口，打開接種口閥門，將搖瓶菌種注入發(fā)酵罐。關(guān)閉接種閥門，然后拔出接種膠管，去掉火焰圈，打開氣泵。7.5.10培養(yǎng)培養(yǎng)溫度18℃~20℃。根據(jù)菌絲生長(zhǎng)情況，通入適量無菌空氣，通氣量為1:0.8～1:1，使內(nèi)罐壓力穩(wěn)定在0.01MPa～0.03MPa，培養(yǎng)周期為6d～7d。7.5.11發(fā)酵罐液體菌種檢測(cè)接種后第4天進(jìn)行檢測(cè)。先用酒精火焰球灼燒取樣閥30s～40s后，棄掉最初流出的50mL～100mL液體菌種，然后用酒精火焰封口直接放入經(jīng)滅菌的三角瓶中，塞緊棉塞，取樣后用酒精火焰把取樣閥燒干，以免雜菌進(jìn)入造成污染。將樣品帶入接種箱或超凈工作臺(tái)經(jīng)無菌操作分別劃線接于試管斜面或培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基上，放入28℃恒溫培養(yǎng)1d～3d，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長(zhǎng)狀況和有無雜菌污染。若無細(xì)菌、酵母菌、霉菌等雜菌菌落生長(zhǎng)，則表明該樣品無雜菌污染。7.5.12發(fā)酵罐液體菌種質(zhì)量要求按7.4.7要求執(zhí)行。8菌種保存8.1母種置于2℃~4℃冰箱中保存，每隔3～5個(gè)月轉(zhuǎn)管移接一次。8.2搖甁液體菌種置于2℃~4℃冰箱中可保存5d～7d。7DB3708/T51—20248.3發(fā)酵罐液體菌種發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)好后，應(yīng)立即進(jìn)入菌種生產(chǎn)或栽培袋接種使用；不能立即使用時(shí)，應(yīng)在發(fā)酵罐內(nèi)通入無菌空氣降溫保壓處理，保持罐壓0.02MPa～0.04MPa，液溫12℃~15℃,可保存1d～2d。9生產(chǎn)檔案母種、搖瓶液體菌種和發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)的每個(gè)環(huán)節(jié)應(yīng)有完整詳實(shí)的生產(chǎn)檔案。記錄生產(chǎn)投入品、