2012年第五、六章分子生物學研究方法

第五章分子生物學研究方法第一節(jié)、重組DNA技術發(fā)展史上的重大事件第二節(jié)、DNA基本操作技術第三節(jié)、基因克隆的主要載體系統(tǒng)第四節(jié)、基因的分離與鑒定基因操作：DNA的切割和連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉化、核酸序列分析、基因的人工合成、定點突變和PCR擴增。這是分子生物學研究的核心技術?；蚬こ蹋涸隗w外將核酸分子插入載體分子中，使之進入寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。引言引言

跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關系的新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術區(qū)別于其他技術的根本特征?；蚬こ碳夹g區(qū)別于其他技術的根本特征5·1

重組DNA技術史上的重大事件半個世紀以來，分子生物學研究取得了前所未有的進步，主要有3大成就:第一，解決了遺傳的物質基礎問題－－基因的分子載體是DNA;第二，DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制，解決了基因的自我復制和世代交替問題;第三，“中心法則”和操縱子學說，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達機制。DNA分子體外切割與連接技術及核苷酸序列分析技術的進步直接推動了重組DNA技術的產生和發(fā)展。重組DNA的核心是用限制性核酸內切酶和DNA連接酶對DNA分子進行體外切割和連接。這些酶的發(fā)現(xiàn)和應用是現(xiàn)代生物工程技術史上最重要的事件。限制性核酸內切酶能從特定堿基序列位點切開DNA。1972，Boyer實驗室發(fā)現(xiàn)核酸內切酶EcoRI能特異識別GAAUC序列，將DNA在這個位點切開產生具有粘性末端的小片段。5·1重組DNA技術史上的重大事件他們還發(fā)現(xiàn)，EcoRl酶切產生的任何不同來源的DNA片段能通過粘性末端之間堿基互補作用而彼此“粘合”起來。此后，大量類似于EcoRl但具有獨特識別序列的核酸內切酶被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。到目前為止，科學家已經幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電冰技術將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。5·1重組DNA技術史上的重大事件圖D.5限制性核酸內切酶EcoRI識別回文序列并將其切割產生粘性末端。粘性末端具平末端DNA片段之間的連接圖D.6由限制酶和連接酶產生的重組DNA分子。5·1重組DNA技術史上的重大事件5·1重組DNA技術史上的重大事件圖D.9分子克隆的一般過程（質粒大小未按比例畫）5·2DNA基本操作技術1、基本原理：生物大分子在一定pH條件下，通常會帶電荷。將其放置到電場中，就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。分子在電場作用下的遷移速度，與電場強度和電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子的摩擦系數(shù)成反比。摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質粘度的函數(shù)。根據(jù)分子大小、構型或形狀的差異和帶凈電荷數(shù)，可通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離。5·2·1核酸的凝膠電泳在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，呈離子化狀態(tài)，DNA和RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰離子，把它們放置在電場當中，會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構型。這就是應用凝膠電泳技術分離DNA片段的基本原理。5·2DNA基本操作技術5·2·1核酸的凝膠電泳5·2DNA基本操作技術瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。將瓊脂糖粉末加熱到熔點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質。經過化學修飾的低熔點瓊脂糖，在較低的溫度下便會熔化，常用于DNA片段的制備電泳。2、瓊脂糖凝膠電泳5·2DNA基本操作技術2、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2～50kb之間;聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1～1000bp之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。例如，20%的聚丙烯酰胺凝膠可分離1-6bp的DNA小片段，而若要分離1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝膠。再如，2%的瓊脂糖凝膠可分離300bp的雙鏈DNA分子，而分離大片段DNA就要用低濃度(0.3%～1.0%)的瓊脂糖凝膠。2、瓊脂糖凝膠電泳5·2DNA基本操作技術在凝膠電泳中，加入適量嗅化乙錠(ethidiumbromide，簡稱EB)染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光下觀察，檢測靈敏快捷，DNA帶中含0.05μg的微量DNA，可以清晰地檢測出來。EB能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間(圖5-4)，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。把EB直接加到凝膠介質中，染料便會與DNA分子結合，卻不能與凝膠相結合。這樣就只有DNA分子能吸收EB并發(fā)出熒光。在適當?shù)娜旧珬l件下，熒光強度與DNA片段的數(shù)量成正比。5·2DNA基本操作技術2、瓊脂糖凝膠電泳5·2DNA基本操作技術圖D.1DNA凝膠電泳。（a）DNA分子向正極遷移。較小的分子比大分子移動更快。（b）電泳后凝膠經過染色顯示的DNA條帶。5·2DNA基本操作技術2、瓊脂糖凝膠電泳5.2.2核酸的分子雜交將特定的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應的同源區(qū)段（互補）就會退火形成雙鏈結構。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來源的DNA分子，其親緣關系較為密切；反之，其親緣關系則比較疏遠。因此，DNA/DNA的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在著親緣關系，而形成DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。在大多數(shù)核酸雜交反應中，經過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細管或電導作用被轉移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地"吸印"上去的，因此，核酸雜交也被稱為"DNA印跡雜交"。由于該方法是E·M·Southern于1975年首先設計出來的，所以又叫做Southernblotting。雜交中常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜和二乙氨基乙基纖維素濾膜(DEAE)等。5.2.2核酸的分子雜交一、Southernblotting核酸分子雜交包括兩個步驟：第一，將樣品轉移到濾膜（印跡轉移）；第二，將濾膜與DNA或RNA探針進行雜交。具體步驟：1、轉移。2、在80℃下烘烤1～2h或用紫外線交聯(lián)法將DNA片段永久性地固定在濾膜上。3、放入探針溶液中進行核酸雜交。一旦與濾膜上的單鏈DNA雜交之后，就很難再解鏈。4、用漂洗法去掉沒有雜交上的探針分子。放射性同位素標記的探針可檢測2ng；為了安全，我們用DIG（地高辛）標記探針，熒光法檢測雜交信號。5.2.2核酸的分子雜交一、Southernblotting基因組DNA被限制性內切酶酶切為DNA片段；各片段經電泳后在凝膠分為條帶；（c）中由下到上是：玻璃板、一層濾紙、凝膠、濾膜、很多層濾紙、玻璃板、重物。通過毛細管作用將凝膠上的DNA條帶原封不動地"吸印"到濾膜上去。（d）在80℃下烘烤1～2h或用紫外線交聯(lián)法將DNA片段永久性地固定在濾膜上并形成單鏈。(e)

濾膜放入帶標記的DNA或RNA核酸探針溶液中進行核酸雜交。5.2.2核酸的分子雜交一、Southernblotting一、Southernblotting5.2.2核酸的分子雜交5.2.2核酸的分子雜交Southernblotting圖D.2Southern印跡法。探針與互補序列條帶結合而讓它能被看到。二、Northernblotting

1、Northern印跡雜交是檢測特定基因是否轉錄和轉錄的強弱情況。它不但用于基因工程中檢測目的基因的轉錄情況，而且也廣泛用于功能基因調控的研究。具體方法是從細胞中提取mRNA，經電泳將不同大小的mRNA分子分開后，印跡轉移于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，與特定的探針DNA雜交后，洗去未雜交上的標記探針DNA。經放射自顯影顯帶，根據(jù)帶密度的強弱就可確定其表達的相對值。

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其它化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與Southern印跡雜交技術十分類似，所以叫做Northern印跡雜交技術（Northernblotting）。二、Northernblotting2、Northern雜交原理

將變性的RNA或mRNA（用甲醛、乙二醇，防止RNA形成二級結構）用瓊脂糖膠電泳分離，轉移吸印到特殊（疊氮化的或其它化學修飾的）的活性濾膜或濾紙上，通過共價交聯(lián)作用而使它們永久地結合在一起，與標記的探針RNA或DNA雜交，然后放射自顯影以分析RNA（大小、數(shù)量）的方法，這種方法同薩瑟恩的DNA印跡雜交技術十分類似，所以叫做諾塞恩RNA吸印雜交技術（Northernblotting）。二、Northernblotting三、Westernblotting

將蛋白質從電泳凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質的抗體進行反應，這種技術叫做韋斯頓蛋白質雜交技術（Westernblotting）。

（一）、概念三、Westernblotting（二）、原理：蛋白質印跡(Westernblotting)是將蛋白質轉移并固定在化學合成膜的支撐物上，然后以特定的親和反應、免疫反應或結合反應及顯色系統(tǒng)分析此印跡。三、Westernblotting（三）蛋白質印跡步驟：1、固定(immobilization)：蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并從膠上轉移到硝酸纖維素膜上。2、封閉(blocked)：保持膜上沒有特殊抗體結合的場所，使場所處于飽和狀態(tài)，用以保護特異性抗體結合到膜上,并與蛋白質反應。3、初級抗體(第一抗體)是特異性的。4、第二抗體或配體試劑對于初級抗體是特異性結合并作為指示物。5、適當保溫后的酶標記蛋白質區(qū)帶，產生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應。三、Westernblotting（四）、蛋白質印跡實驗流程三、Westernblotting特異抗體的制備（a）及其它們與不同蛋白質的特異性結合（b）。

三、WesternblottingWestern印跡法。標記的抗體與蛋白質特異條帶結合而讓它顯示出來。免疫共沉淀法分離蛋白質細胞提取物直接與針對該蛋白的抗體混合。同時加入另一種與抗體結合的蛋白，它能使抗體發(fā)生聚集，那些與抗體結合的細胞提取物中的蛋白也會因此而聚集在一起。這種抗體與目標蛋白之間的聚集會產生沉淀。該沉淀可以用凝膠對目標蛋白進行鑒定。

免疫共沉淀過程圖

免疫共沉淀DNA芯片

一種生物的幾千個基因以獨特的方式被體現(xiàn)在一塊小的芯片上，每個基因占據(jù)一個點。每個點含有一種高濃度的寡聚物，它只與對應的基因互補。之后從處于一種條件下的細胞中提取mRNA。通過反轉錄將mRNA轉變成DNA并帶上紅色標記。然后，從處于另一條件下的細胞中提取mRNA。將此mRNA轉變成DNA并帶上綠色標記。

DNA芯片

DNA芯片技術的原理

X射線晶體衍射

用X射線轟擊得到的蛋白質晶體。由于X射線的波長與原子的大小差不多，因而會發(fā)生一種稱為衍射的現(xiàn)象，衍射現(xiàn)象使X射線波分開。衍射的樣式可以用計算機程序進行分析，從而在原子水平上給出非常清晰的蛋白質3-D排列圖象。晶體結構是很難獲得的，主要原因是每種蛋白質的結晶條件不一樣并且很難確定。對那些膜蛋白和具有松弛、非結構化區(qū)域的蛋白質進行結晶尤其困難。X射線晶體衍射確定某種蛋白在細胞中位置的最有效方法是讓該蛋白帶上熒光標記或放射性標記。熒光蛋白暴露在一定波長的光下時能發(fā)射出不同波長的光，這種光能用特殊的顯微鏡在很高的放大倍數(shù)下進行檢測。讓蛋白質帶上熒光標記最通行的方法是將它與一個小的熒光蛋白融合（圖D.19）。常用的是綠色熒光蛋白（GFP）?？梢詰没蚬こ痰姆椒▽⑷魏位蚺cGFP基因進行組合。當這樣的重組基因在細胞中表達的時候，該基因的蛋白質將與GFP融合在一起。一般情況下，GFP是掛在該蛋白的一個末尾上，不會明顯地改變該蛋白的功能。蛋白質定位蛋白質位置的測定。（a）制備融合蛋白。（b）用GFP做標簽使蛋白質的亞細胞位置可見。（來源：www.）蛋白質定位酵母雙雜交

用來檢查兩種蛋白之間的結合。轉錄激活蛋白是模塊化的蛋白，它們具有一個DNA結合結構域，又有一個分開的激活轉錄的功能域。在激活一個基因的轉錄時，這兩個域都是需要的。在雙雜交分析中，將一種供試蛋白與某種激活蛋白的DNA結合域融合。而將另一種供試蛋白與該激活蛋白的激活域融合。之后讓兩種蛋白都在具有一種報告基因的酵母細胞中表達。如果該報告基因受到激活蛋白的刺激，它能產生一種信號（一般是某種顏色）。兩種融合蛋白中的任何一種都不能夠激活轉錄。但是，如果這兩種供試蛋白能夠互相結合在一起，那么DNA結合域就能與轉錄激活域連接在一起。這樣，這種重新組織起來的激活蛋白就能夠啟動報告基因的轉錄。

酵母雙雜交

酵母雙雜交2-DE技術蛋白質組學（proteomics）概念：是從整體角度分析生物體蛋白質組動態(tài)變化的一門科學。研究內容：蛋白質的識別、定量；蛋白質的定位、修飾；蛋白質之間的相互作用并根據(jù)這些研究最終確定它們的功能。蛋白質雙向電泳-2-DE技術蛋白質2維電泳1個方向是SDS-聚丙烯酰胺凝膠主要是把蛋白質按照分子量分開1個方向是等點聚焦把蛋白質按照等電點的不同分開這樣就可以把不同的蛋白質盡可能的分開可以結合質譜對細胞進行蛋白質組的研究例如我們研究癌細胞和癌旁細胞利用這個方法就可以知道兩種細胞都有哪些蛋白質表達的不同。2-DE技術流程雙向電泳(2DE/DIGE)目前進行蛋白質組學分析的最常規(guī)實驗技術能實現(xiàn)多達10000種不同蛋白質進行分離分析雙向電泳示意圖2-DE圖譜DIGE圖譜蛋白質雙向電泳-2-DE技術5·2·3細菌轉化

細菌轉化：一種細菌菌株由于捕獲了外源DNA導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。大腸桿菌是分子生物學家常用的實驗材料，也是基因工程重要的實驗菌株。將快速生長中的大腸桿菌置于經低溫(0℃)預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹(形成原生質球)，并與轉化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復合物。立即將該體系轉移到42℃下做短暫的熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。發(fā)生了遺傳改變的菌株帶著變異而遺傳。5·2·4核苷酸序列分析儀器分析發(fā)展很快。如果將來做測序工作，有了分子生物學基礎，就可以做。如果將來工作中需要測序，一般送到公司去測。下面介紹測序的基本原理。5·2·4核苷酸序列分析5·2·5基因擴增

聚合酶鏈式反應，即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它可以在試管中建立反應，經數(shù)小時之后，就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數(shù)十萬乃至千百萬倍。5·2·5基因擴增首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補鏈。因為DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動("引導")新鏈的合成，所以，新合成的DNA鏈的起點，由加入到反應混合物中的一對寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火決定的。PCR技術的原理5·2·5基因擴增PCR反應的全過程

DNA解鏈(變性)、引物與模板DNA相結合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不斷重復。多次循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA數(shù)，即兩條引物位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值是2n。具體說：首先將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫(約94℃)環(huán)境下加熱1min，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA；然后降低反應溫度(約56℃)制冷1min，使引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上；最后，72℃左右保溫1至數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3’-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板按5’→3’方向延伸，合成新生DNA互補鏈。以上循環(huán)在同一個PCR管中進行。反應物加完后，溫度由PCR儀調整，程序完成后可以拿到產物。PCR反應的全過程5·3基因克隆的主要載體系統(tǒng)細菌質粒是存在于細胞質中的一類獨立于染色體并能自主復制的遺傳成分，質粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復制子（有少量線性質粒、RNA質粒報道）。質粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

5·3·1質粒DNA及其分離純化質粒用作基因克隆的載體分子，獲得大量純化的質粒DNA分子很重要。寄主細胞的裂解是分離質粒DNA的關鍵步驟，加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉(SDS)來促使大腸桿菌細胞裂解。細胞裂解反應需要相當溫和，同時實驗操作又十分謹慎仔細，這樣，絕大部分的染色體DNA分子都將以高分子量的形式釋放出來，可以用高速離心的方法使之與細胞碎片一起被沉淀除去，得到高純度的質粒DNA。5·3·1質粒DNA及其分離純化5·3·1·1氯化鉛密度梯度離心法質粒DNA一般僅占細胞總DNA的l%～2%左右，而且其化學結構與寄主染色體DNA之間并沒有什么差別，所以，質粒DNA的純化須從兩者高級結構上的差異尋找依據(jù)。在細胞裂解及DNA分離的過程中，大分子質量的細菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應的線性片段，而質粒DNA則由于其分子量較小、結構緊密，大部分仍能保持完整的環(huán)狀結構。方法：將含有EtBr的CsCl溶液加到大腸桿菌裂解液中，EtBr分子便會通過嵌入作用而結合到DNA鏈上，導致雙螺旋結構發(fā)生解旋反應。大腸桿菌染色體DNA片段具有游離的末端而易于解旋，會結合大量的EtBr分子。共價閉合環(huán)狀的DNA分子質粒，只能發(fā)生有限的解旋反應，限制了EtBr分子的結合數(shù)量，染色體DNA片段比質粒DNA結合更多的EtBr分子。在DNA-EtBr復合物中，結合的EtBr分子數(shù)量越多，其密度也就越低。因此，在EtBr達到飽和濃度的條件下，質粒DNA就要比線性的染色體DNA片段具有更高的密度。通過氯化銫密度梯度離心之后，它們就會被平衡在不同的位置，從而達到純化質粒DNA的目的。5·3·1·1氯化鉛密度梯度離心法5·3·1·1氯化鉛密度梯度離心法5·3·1·2堿變性法在pH值介于12.0～12.5的條件下加熱DNA溶液，線性DNA會被變性，而閉合環(huán)狀質粒DNA則不會被變性，盡管在這樣的條件下連接DNA互補鏈之間的氫鍵也會斷開，但由于閉合環(huán)狀質粒DNA的雙螺旋主鏈骨架的彼此盤繞作用，互補的兩條鏈仍然會緊密地結合在一起。與此相反，線性DNA的兩條鏈則會完全分開。若用制冷或恢復中性的方法處理DNA混合物，質粒DNA能迅速而準確地復性，但隨機斷裂產生的線性染色體DNA分子，彼此已經分離的互補鏈之間的復性作用就不會那么迅速而準確，往往聚集形成網狀結構，與變性的蛋白質及RNA一道被離心沉淀下來?？梢杂镁凭恋矸ㄊ占匀粶粼谏锨逡褐械馁|粒DNA。這目前最流行的方法。5·3·2

重要的大腸桿菌質粒載體

5·3·2·1pSC101質粒載體pSC101是低拷貝數(shù)的大腸桿菌質粒載體，平均每個寄主細胞僅有1～2個拷貝。其分子大小為9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因(tetr)。該質粒具有EcoRI、HindⅢ、BamHI、SalI、XhoI、PvuⅡ以及SmaI等7種限制性核酸內切酶的單切割位點，在HindⅢ、BamHI和SalI等3個位點克隆外源DNA，都會導致tetr基因失活。pSClO1質粒具有可插人外源DNA的多個限制性核酸內切酶的單克隆位點，還具有四環(huán)素抗性的強選擇記號，便于篩選。因此，它第一個被選為真核基因的克隆載體。這個質粒載體有其明顯的缺點，它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質粒，從帶有該質粒的寄主細胞中提取pSClOlDNA，其產量就要比其他質粒載體低得多。5·3·2·1pSC101質粒載體5·3·2·2pBR322質粒載體為改進轉化子篩選技術，有必要用人工的方法構建一種既帶有多種抗藥性的強選擇記號，又具有低分子質量、高拷貝以及外源DNA插入不影響復制功能的多種限制性核酸內切酶單切割位點等優(yōu)點的新的質粒載體。目前，在基因克隆中廣泛使用的pBR322質粒，就是按這種設想構建的一種大腸桿菌質粒載體。pBR322質粒是由3個不同來源的部分組成的:含有氨卡青霉素抗性基因（ampr)、四環(huán)素抗性基因(tetr)和DNA復制起點(ori)(圖5-22)。

pBR322質粒載體較小,其長度為4363bp。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段較大（6-8kb）的外源DNA片段，操作起來仍較為便利。5·3·2·2pBR322質粒載體pBR322質粒載體具有兩種抗生素抗性基因以用作轉化子的選擇記號，方便選擇。如：將外源DNA克隆在BamHI位點上，將這樣的重組質粒轉化到野生型大腸桿菌細胞中，并涂布在含氨卡青霉素的選擇性培養(yǎng)基平板上，那么存活下來的菌落都將具有Ampr的表型，它們必定是獲得了編碼有這種抗性基因的轉化子。第三個優(yōu)點是具較高的拷貝數(shù)，若經過氯霉素擴增，每個細胞中可累積1000～3000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。5·3·2·2pBR322質粒載體5·3·3λ噬菌體載體噬菌體是一類細菌病毒的總稱，英文名叫作bacteriophage，來源于希臘文“phagos”，系指吞噬之意。如同質粒分子一樣，噬菌體也可以用于克隆和擴增特定的DNA片段，是一種良好的基因克隆載體。作為細菌寄生物的噬菌體，它可以在脫離寄主細胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但一旦脫離了寄主細胞，就既不能生長也不能復制，這是因為大多數(shù)的噬菌體只能利用寄主核糖體、合成蛋白質的因子、各種氨基酸及能量代謝體系進行生長和增殖。噬菌體有兩種類型：1、溶菌周期（烈性噬菌體）：噬菌體將其感染的寄主細胞轉變成為噬菌體的“制造廠”，產生出大量的子代噬菌體顆粒。2、溶源生長周期（溫和噬菌體）：在感染過程中沒有產生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA被整合到寄主細胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分。5·3·3λ噬菌體載體以噬菌體DNA分子作載體，克隆含有目的基因的外源DNA片段，只要不導致重要的噬菌體基因失活，這種重組的噬菌體DNA感染了寄主細胞之后，插入的外源DNA片段便會隨著噬菌體DNA分子一道增殖?？砂凑疹愃朴谥苽滟|粒DNA的方法，分離到大量的重組體噬菌體DNA，實現(xiàn)克隆基因的擴增。5·3·3λ噬菌體載體λ噬菌體的分子為48.5kb，是一種中等大小的溫和噬菌體。迄今已經定位的λ噬菌體基因至少有61個，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的調控（必需基因）;另一部分基因則被稱為非必需基因；當它們被外源基因取代之后，不影響噬菌體的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重組噬菌體DNA，可以隨寄主細胞一起被復制和增殖。5·3·3λ噬菌體載體

在λ噬菌體線性雙鏈DNA分子的兩端，各有一條由12個核苷酸組成的彼此完全互補的5‘單鏈突出序列（粘性末端）。當λ噬菌體的線性DNA分子注入到被感染寄主細胞內時，會通過粘性末端之間的互補作用，形成環(huán)形雙鏈DNA分子。隨后在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5’-P和3'-OH基團封閉起來。這種粘性末端結合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點cohesive-endsite，粘性末端位點)。5·3·3λ噬菌體載體野生型的λ噬菌體DNA具有太多的常用限制性核酸內切酶切割位點（5個EcoRI酶切位點和7個HindⅢ酶切位點）。這使它不適于用作基因克隆的載體，想辦法從野生型λ噬菌體基因組DNA上消去一些多余的酶切位點并切除非必要區(qū)段，將它改造成適用于基因克隆的載體。介紹改造后的兩種類型：1·插入型載體外源DNA克隆到插入型λ載體分子上，就會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應。根據(jù)插入失活效應的特異性，可分為以下兩種亞型。5·3·3λ噬菌體載體(1)免疫功能失活插入型載體：載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種限制性內切酶的單切割位點。當外源DNA片段插入到這種位點上時，阻礙其進入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插人的λ重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會形成混濁的噬菌斑。這種形態(tài)學上的差異，為分離重組體分子提供了方便的標志。5·3·3λ噬菌體載體(2)β-半乳糖苷酶失活插入型載體：這種載體的基因組中含有大腸桿菌的lacZ區(qū)段，編碼β-半乳糖苷酶。由這種載體感染大腸桿菌的lac-指示菌，涂布在補加有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基平板上，會形成藍色的噬菌斑，但在克隆過程中，如果外源DNA插入到lac5區(qū)段上，阻斷了β-半乳糖苷酶基因lacZ的編碼序列，那么由這種重組體感染的lac-指示菌，由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成無色的噬菌斑。5·3·3λ噬菌體載體2·替換型載體又叫作取代型載體（substitutionvector)，是在λ噬菌體基礎上改建的，在其中央部分有一個可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段。當外源DNA插人此類載體時，一對克隆位點之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。在λNM781替換型載體中，可取代的EcoRI片段，編碼有一個supE基因，這種λNM781噬菌體感染細胞后，其lacZ基因的突變琥珀被抑制，因此能在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產生出藍色的噬菌斑。但是，如果這個具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述指示培養(yǎng)基上只能產生出無色的噬菌斑。2·替換型載體5·3·4柯斯質粒載體“Cosmid”一詞是由英文“cossite-carringplasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點的質粒?？滤官|粒是一類由人工構建的含有λDNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體?？滤官|粒載體pHC79質粒兼具了λ噬菌體載體和pBR322質粒載體兩方面的優(yōu)點，其克隆能力為31～45kb，而且能夠被包裝成為具有感染能力的噬菌體顆粒。5·3·4柯斯質粒載體第一，具有λ噬菌體的特性。在克隆了合適長度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效轉染對λ噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。進入寄主細胞之后的柯斯質粒DNA分子，能按照λ噬菌體DNA同樣的方式環(huán)化。第二，具有質粒載體的特性?？滤官|粒載體具有質粒復制子，因此能像質粒DNA一樣在寄主細胞內進行復制，并且能在氯霉素作用下，獲得進一步擴增?？滤官|粒載體的特點第三，具有抗菌素抗性基因，可供重組體分子選擇。第四，具有高容量的克隆能力?？滤官|粒載體的分子僅具有一個復制起點，一兩個選擇記號和cos位點等三個組成部分，其分子較小，一般只有5～7kb左右。因此，可以插入到載體上并能被包裝成λ噬菌體顆粒的最大外源DNA片段，克隆極限可達45kb左右?？滤官|粒載體的特點5·3·4柯斯質粒載體5·4基因的分離與鑒定生命科學各個研究，“克隆”（clone)被廣泛使用。通?？寺∈菬o性繁殖。在不同層面的含義：在多細胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體；從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子屬于同一克隆。在細胞水平上，克隆是指由同一個祖細胞分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。在分子生物學上，將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆。基因克隆包含待研究的目的基因的分離和鑒定兩個主要內容，整個過程包括如下4個基本步驟:(1)用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化;(2)外源DNA片段與載體分子的體外連接反應;(3)將人工重組的DNA分子導人它們能夠進行正常復制的寄主細胞;(4)重組體分子的轉化子克隆的選擇或篩選。5·4基因的分離與鑒定5·4·lDNA片段的產生與分離從實驗材料中制備包括“目的基因”在內的DNA片段群體，必須包容整個基因組的全部序列，DNA片段的大小要適合于基因操作的要求。鳥槍法(shot-gunapproach)：限制性內切酶消化供體基因組DNA，直接將消化產物與載體分子相連接。重組體分子帶有大小不同的插入片段。真核基因組龐大，載體承受外源DNA插入為1000～3000bp，將產生幾十萬個大小不同的DNA片段，這些大小不同的DNA片段形成的重組體分子組成相應克隆群體。要想從如此巨大的群體中選出帶有目的基因的克隆太費事。5·4·lDNA片段的產生與分離局部雙酶消化法可以保證DNA產物大小在10～30kb左右，通過離心或制備凝膠電泳技術，得到約為20kb的隨機群體并將其克隆到合適的載體上，克服鳥槍法的困難。5·4·lDNA片段的產生與分離5·4·2重組體DNA分子的構建1·外源DNA片段定向插入載體分子：載體分子和待克隆的DNA分子都是用同一對(NE1和NE2)切割，二者將按一種取向退火形成重組DNA分子，保證外源DNA片段定向插入載體分子。若載體分子和外源DNA插入片段不能產生出互補的粘性末端，則采用附加銜接物的辦法來提高平末端之間的連接效率。

5·4·2重組體DNA分子的構建2·最佳連接反應經限制性內切酶切割后的線性載體分子的自身不允許再環(huán)化。采用堿性磷酸酯酶處理由內切酶消化產生的線性載體分子，除去該DNA的5’-P末端，而留下一個5’-OH基團。當插入了外源DNA片段，其5’為-P末端，從而能有效重組。在連接反應中，使用正確的載體DNA和外源DNA的比例，是獲得高產重組轉化子的重要因素。用λ噬菌體或柯斯質粒作載體時，配制高比值的載體DNA/供體DNA的連接反應體系有利于重組分子的形成。用質粒作為克隆載體，其重組體分子由一個載體分子和一個供體DNA片段連接環(huán)化而成，當載體DNA與供體DNA的比值為1時，有利于這類重組體分子的形成。2·最佳連接反應3·重組體分子導入受體細胞的途徑將外源重組體分子導入受體細胞的主要途徑包括轉化(或轉染)、轉導、顯微注射和電穿孔等。轉化和轉導主要適用于細菌一類原核細胞和酵母等低等真核細胞，而顯微注射和電穿孔則主要應用于高等動物的真核細胞。在基因工程中有詳細介紹。5·4·3cDNA基因克隆真核生物基因組DNA大，含有大量的重復序列和內含子，難以直接分離到目的基因。通過RT-PCR可以部分解決。高等生物一般具有3～5萬種左右不同的基因，在一定時間階段的單個細胞或組織中，僅有15%左右的基因得以表達，產生出約5000～10000種不同的mRNA分子。