生物醫(yī)學(xué)電鏡樣本超薄切片技術(shù)規(guī)程征求意見稿

1生物醫(yī)學(xué)電鏡樣本超薄切片技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了生物醫(yī)學(xué)電鏡樣本中，組織樣本、細(xì)胞學(xué)樣本、血液樣本超薄切片技術(shù)相關(guān)的術(shù)語和定義，以及取材、固定、浸洗、脫水、滲透包埋、超薄切片、染色的操作規(guī)程。本文件適用于生物醫(yī)學(xué)電鏡樣本超薄切片技術(shù)中，組織樣本、細(xì)胞學(xué)樣本、血液樣本的操作規(guī)程。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件3.1電子顯微鏡electronmicroscope一種基于電子顯微技術(shù)的高端科學(xué)儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)對微觀世界的觀測和分析，簡稱“電3.2取材sampling對生物樣本采集的過程。3.3固定specimensfixed應(yīng)用適宜的試劑使組織細(xì)胞的生物活性終止，使其盡可能保持原有形態(tài)結(jié)構(gòu)和所含各種物質(zhì)成分的過程。3.4浸洗rinse應(yīng)用適宜的試劑去除組織細(xì)胞中的殘留固定液的過程。3.5脫水dehydration應(yīng)用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑逐漸將樣本中的游離水完全取代的過程。3.6滲透包埋penetrationembedding使包埋劑逐漸取代脫水劑，并把液態(tài)包埋介質(zhì)聚合成質(zhì)地均勻、硬度適宜的固態(tài)的過程。3.72超薄切片ultrathinsection對經(jīng)過包埋后的樣本進(jìn)行精準(zhǔn)定位修塊，再采用超薄切片機(jī)，將其切成厚度為70nm左右的薄片的過程。3.8染色stain利用重金屬鹽的高分子密度與組織細(xì)胞內(nèi)的細(xì)微結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的結(jié)合，提高樣本切片細(xì)節(jié)之間的電子散射強(qiáng)弱對比，在透射電鏡觀察時(shí)，重金屬染色的區(qū)域會(huì)吸收更多的電子，形成較暗的區(qū)域，而未染色的區(qū)域則相對較亮，從而增強(qiáng)了樣品的對比度。4儀器設(shè)備4.1包埋聚合器用于對完成滲透的樣本進(jìn)行聚合硬化。4.2體視顯微鏡用于觀察輔助對聚合完成及定位完成的樣本進(jìn)行修塊。4.3超薄切片機(jī)用于對修塊完成的樣本進(jìn)行半薄及超薄切片。4.4恒溫加熱板用于對半薄切片進(jìn)行烤片。4.5光學(xué)顯微鏡用于觀察輔助對半薄切片進(jìn)行定位。5試劑和材料5.10.2mol/L磷酸緩沖液貯存液（試劑配方見附錄A表A.1）。5.20.1mol/L磷酸緩沖液工作液（試劑配方見附錄A表A.2）。5.3戊二醛固定液（試劑配方見附錄A表A.3）。5.4灌注固定液（試劑配方見附錄A表A.4）。5.52%四氧化鋨固定液貯存液（試劑配方見附錄A表A.5）。5.61%四氧化鋨固定液工作液（試劑配方見附錄A表A.6）。5.7Epon812包埋劑（試劑配方見附錄A表A.7）。5.81%甲苯胺藍(lán)染液（試劑配方見附錄A表A.8）。5.9乙酸雙氧鈾染液（試劑配方見附錄A表A.9）。5.10檸檬酸鉛染液（試劑配方見附錄A表A.10）。6技術(shù)流程6.1技術(shù)流程圖3技術(shù)流程示意圖見附錄B。6.2取材6.2.1組織樣本6.2.1.1直接解剖取材動(dòng)物麻醉，暴露所需臟器，確定取材位點(diǎn)，用鋒利刀片切割下小塊組織，用0.1mol/L磷酸緩沖液迅速?zèng)_洗組織液、血液等污物。在預(yù)先準(zhǔn)備好的蠟盤上面滴一滴2.5%戊二醛固定液，將離體組織快速置入液滴內(nèi)，根據(jù)組織的大小、形狀要求，用雙面刀片把組織塊切成幾個(gè)1mm3的樣本顆粒、1mm2×3mm樣本條或厚度小于1mm的樣本薄片。6.2.1.2灌注固定取材動(dòng)物麻醉，暴露心臟，剪開左心室，將針管插入升主動(dòng)脈，開始緩慢注入生理鹽水，同時(shí)剪開右心房或回流靜脈放血。待右心房流出的液體為無色或略帶紅色時(shí)終止灌洗，同時(shí)打開灌注固定液。待被灌流的組織適度硬化后，用鋒利刀片切割下小塊組織，根據(jù)組織的大小、形狀要求，用雙面刀片把組織塊切成幾個(gè)1mm3的樣本顆粒、1mm2×3mm樣本條或厚度小于1mm的樣本薄片。6.2.1.3原位固定取材動(dòng)物麻醉，邊解剖邊將2.5%戊二醛固定液滴加到取材位點(diǎn)，待組織達(dá)到適當(dāng)硬度后，切取下來用鋒利刀片切割下小塊組織，根據(jù)組織的大小、形狀要求，用雙面刀片把組織塊切成幾個(gè)1mm3的樣本顆粒、1mm2×3mm樣本條或厚度小于1mm的樣本薄片。6.2.2細(xì)胞學(xué)標(biāo)本將液體倒入2ml離心管內(nèi)，使用水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)，以1000r/min低速離心5min，使離心管底部形成細(xì)胞團(tuán)；棄上清，加入緩沖液，5000r/min，離心10min，在管底形成致密細(xì)胞團(tuán)塊，確保牙簽小心挑起細(xì)胞團(tuán)塊而不散，若收集到的細(xì)胞團(tuán)塊較大，應(yīng)分割成1.5mm3的小塊；棄上清，輕輕注入2.5%戊二醛固定液。6.2.3血液標(biāo)本抗凝管采血，使用水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)，將抗凝全血以1000r/min低速離心15min，離心管抗凝血液析出三層細(xì)胞，底層紅色的是紅細(xì)胞，中間層白色的是白細(xì)胞和血小板，上層透明的是血漿，用吸管緩慢吸取上清液，再根據(jù)需求吸取對應(yīng)分層的細(xì)胞，參照6.1.2的流程收集細(xì)胞團(tuán)塊。6.3前固定取材后，用牙簽挑起其中2-3粒樣本，移至盛有1-2ml2.5%戊二醛固定液的小瓶，4℃固定2-4h。6.4浸洗0.1mol/L磷酸緩沖液充分浸洗3次，4℃,10min/次。6.5后固定1%四氧化鋨固定液進(jìn)行后固定，4℃,2h。6.6浸洗雙蒸水浸洗3次，4℃,10min/次。6.7脫水430%乙醇1次，室溫，10min/次；50%乙醇1次，室溫，10min/次；70%乙醇1次，室溫，10min/次；90%乙醇1次，室溫，10min/次；100%乙醇2次，室溫，10min/次；100%丙酮2次，室溫，10min/次。6.8滲透包埋6.8.1梯度滲透推薦使用環(huán)氧樹脂Epon812作為包埋劑。100%丙酮:包埋劑=3:1，室溫，0.5h；100%丙酮:包埋劑=1:1，室溫，0.5h；100%丙酮:包埋劑=1:3，室溫，1h；純包埋劑，室溫，過夜。6.8.2包埋聚合包埋膠囊或包埋板提前放入60℃干燥箱烘干備用，用注射器吸取備好的包埋劑，灌滿包埋膠囊或包埋板，并在一側(cè)放入樣本標(biāo)簽紙，用牙簽挑起組織塊，放入包埋膠囊或包埋板的頂端，隨后一起放入恒溫箱，逐級加溫聚合，一般采用37℃,6h；45℃12h；60℃,24h。6.9超薄切片6.9.1半薄切片定位6.9.1.1粗修塊將包埋塊夾在專用夾持器中，放在體視顯微鏡下面，采用單面刀片首先修去頂面多余樹脂，直到暴露出黑色樣本，再以此樣本平面為中心，用單面刀片傾斜45°角修出4個(gè)斜面，去掉多余樹脂，將頂面修成梯形或長方形，四周修成金字塔狀，隨后在超薄切片機(jī)上，將修好的包埋塊固定在超薄切片機(jī)樣本夾槽中，頂端露出約2mm，用無水槽玻璃刀修平頂面，直至切出一張完整的切片。6.9.1.2半薄切片換用新刀口，切出數(shù)張0.5-1μm后的半薄切片，用撈片環(huán)撈取切片，提前準(zhǔn)備好潔凈的載玻片，滴加雙蒸水備用，將撈取的切片轉(zhuǎn)移至雙蒸水液滴上，60℃恒溫加熱板上烤干。6.9.1.3半薄切片染色將甲苯胺藍(lán)染液滴于載玻片的半薄切片上，邊加熱邊染色約3min，傾去染液，注意勿使切片干燥，自來水沖洗多余染液后用雙蒸水進(jìn)行漂洗，隨后用濾紙吸取切片周圍水分，烘干封片，光鏡下觀察并定位。6.9.1.4細(xì)修塊再次將包埋塊夾在專用夾持器中，放在體視顯微鏡下面，根據(jù)光鏡定位位置，保留定位位置的組織平面，以此位置平面為中心，用單面刀片傾斜45°角修去四周多余組織。6.9.2超薄切片前準(zhǔn)備6.9.2.1安裝包埋塊將經(jīng)過半薄切片定位后修好的包埋塊固定在超薄切片機(jī)樣本夾槽中，頂端露出約2mm，居于切片上限及下限范圍內(nèi)。6.9.2.2安裝鉆石刀或玻璃刀將鉆石刀或帶有水槽的玻璃刀放置于刀臺(tái)夾縫中固定緊，使刀刃與刀臺(tái)夾縫旁邊的標(biāo)尺等高。56.9.2.3對刀調(diào)整超薄切片機(jī)雙目鏡位置及倍數(shù)，看清刀口與樣本頂面的位置關(guān)系，打開超薄切片機(jī)的暗視野底光，使樣本頂面產(chǎn)生反光，判斷刀口與樣本之間的距離，在低倍鏡視野下進(jìn)行粗調(diào)，使刀口快速靠近樣本，再在高倍鏡視野下進(jìn)行細(xì)調(diào)，使刀口更加貼近樣本，直到最后刀刃與樣本間細(xì)小的亮縫剛剛消失為止。6.9.2.4設(shè)置切片窗調(diào)節(jié)樣本臂使所切樣本平面的底邊略高于刀刃5-8mm處，按“START”鍵設(shè)置切片起始位置，隨后調(diào)節(jié)樣本臂使所切樣本平面的頂邊略低于刀刃3-5mm處，按“END”鍵設(shè)置切片結(jié)束位置。6.9.2.5調(diào)節(jié)水槽液面：轉(zhuǎn)動(dòng)超薄切片機(jī)中樣本臂使樣本頭低于刀刃，將雙蒸水加到刀槽里，使之略高于刀刃和刀槽，隨后用注射器緩慢抽吸液體降低液面，使液面剛剛浸潤到刀刃，超薄切片機(jī)雙目鏡下可見刀刃處有較亮的反光面。6.9.2.6設(shè)置超薄切片速率鉆石刀切片速率建議1mm/s為宜，玻璃刀切片速率建議2-5mm/s為宜。6.9.2.7設(shè)置超薄切片厚度50-70nm為宜。6.9.3啟動(dòng)進(jìn)行超薄切片按照6.8.2中調(diào)整好的位置以及設(shè)定好的參數(shù)，啟動(dòng)設(shè)備，開始自動(dòng)進(jìn)行切片，所得超薄切片被收集到鉆石刀或玻璃刀所帶的水槽中，在超薄切片機(jī)目鏡下觀察超薄切片的收集情況，通過顏色判定切片厚度是否符合設(shè)置要求，并用睫毛筆挑掉不完整切片（切片顏色與切片厚度判定對照表見附錄C）。6.9.4撈片用彎頭精密鑷子夾住載網(wǎng)邊緣輕輕彎折一下，使載網(wǎng)有支持膜的一面向下，與切片成45°角，快速輕觸切片，使切片平整貼附在載網(wǎng)的支持膜上，提起鑷子，用濾紙接觸載網(wǎng)邊緣，吸干水分。6.10染色6.10.1乙酸雙氧鈾染色根據(jù)樣本數(shù)量，將封口膜裁剪到合適大小，潔凈面向上，置于培養(yǎng)皿中央。用滴管吸取乙酸雙氧鈾染液，滴在封口膜上，液滴間距適中，用彎頭精密鑷子夾住載網(wǎng)，確認(rèn)切片面向下，輕置于液滴上，蓋好培養(yǎng)皿，避光，室溫染色20min。6.10.2清洗準(zhǔn)備3個(gè)盛有25ml雙蒸水的燒杯，用彎頭精密鑷子在乙酸雙氧鈾染液表面夾住載網(wǎng)，快速插入燒杯內(nèi)雙蒸水中，在水面提升浸入，反復(fù)30次，依次在3個(gè)燒杯中進(jìn)行，用濾紙吸干水分，室溫晾干。6.10.3檸檬酸鉛染色根據(jù)樣本數(shù)量，將封口膜裁剪到合適大小，潔凈面向上，置于培養(yǎng)皿中央，在封口膜四周放置固體氫氧化鈉，用滴管吸取檸檬酸鉛染液，滴在封口膜上，液滴間距適中，用彎頭精密鑷子夾住載網(wǎng)，確認(rèn)切片面向下，輕置于液滴上，蓋好培養(yǎng)皿，避光，室溫染色7min。6.10.4清洗準(zhǔn)備3個(gè)盛有25ml雙蒸水的燒杯，用彎頭精密鑷子在檸檬酸鉛染液表面夾住載網(wǎng)，快速插入燒杯內(nèi)雙蒸水中，在水面提升浸入，反復(fù)30次，依次在3個(gè)燒杯中進(jìn)行，用濾紙吸干水分，室溫晾干。6常用試劑配方0.2mol/L磷酸緩沖液貯存液配方見表A.1。表A.10.2mol/L磷酸緩沖液貯存液A液（0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液）B液（0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液）NaH2PO4·H2O27.60gNa2HPO4·2H2O35.61g或NaH2PO4·2H2O31.21g或Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·2H2O71.64g去離子水1000ml，混勻后4℃保存去離子水1000ml，混勻后4℃保存0.1mol/L磷酸緩沖液工作液配方見表A.2。表A.20.1mol/L磷酸緩沖液工作液pH值7.07.17.27.37.47.57.6A液/ml19.5016.5014.0011.509.508.006.50B液/ml30.5033.5036.0038.5040.5042.0043.50去離子水/ml50.0050.0050.0050.0050.0050.0050.00戊二醛固定液配方見表A.3。表A.3戊二醛固定液戊二醛終濃度/%2.02.53.04.00.2mol/L磷酸緩沖液/ml25%戊二醛水溶液/ml468去離子水/ml灌注固定液配方見表A.4。表A.4灌注固定液（多聚甲醛-戊二醛混合固定液）7試劑名稱所需體積(ml)10%多聚甲醛溶液0.2mol/L磷酸緩沖液25%戊二醛溶液去離子水2%四氧化鋨固定液貯存液配方見表A.5。表A.52%四氧化鋨固定液貯存液試劑名稱所需劑量四氧化鋨0.5g去離子水25ml將0.5g包裝的四氧化鋨安剖瓶放入清水中浸泡，去除瓶上的標(biāo)簽并洗凈外壁的有機(jī)物質(zhì)。準(zhǔn)備一棕色試劑瓶，充分洗凈后加入25ml去離子水。用小砂輪劃割安剖瓶，放入棕色試劑瓶中，用潔凈玻璃棒搗破安剖瓶，快速蓋上瓶蓋，用封口膜將瓶口密封，黑紙包裹4℃避光保存。1%四氧化鋨固定液工作液配方見表A.6。表A.61%四氧化鋨固定液工作液試劑名稱所需劑量2%四氧化鋨固定液貯存液0.2mol/L磷酸緩沖液Epon812包埋劑配方見表A.7。表A.7Epon812包埋劑A液：B液劑量/ml104010401040108Epon812/ml5.0320.125.0820.325.1120.445.1320.525.1620.64DDSA/ml4.360.903.600.773.080.672.680.542.16MNA/ml3.8815.524.0216.084.1216.484.1916.784.30DMP-30/ml0.150.600.150.600.150.600.150.600.150.60備注A液（Epon812、DDSAB液（Epon812、MNA）1%甲苯胺藍(lán)染液配方見表A.8。表A.81%甲苯胺藍(lán)染液