微生物學試驗教程

微生物學試驗教程

《微生物學實驗》是配合武漢大學、復(fù)旦大學編的《微生物學》一書的實驗教材。第二

版做了較大修改，增添了許多新技術(shù)與方法，實驗由原先的40個增至63個，并按類規(guī)納成

15個部分。每一部分冠以綜合性說明，簡單介紹該部分內(nèi)容及其在微生物學工作中的作用。

第二版仍著重微生物學實驗的基本操作與技能訓(xùn)練。為方便教學，每一實驗基本上仍按

照目的要求、基本原理、器材、操作步驟及實驗報告(包含實驗結(jié)果與思考題)五部分。書

后附有染色液、培養(yǎng)基、試劑與溶液的配制方法、本書使用的菌種名稱，微生物學中常用的

計量單位及要緊參考書目。

第二版實驗內(nèi)容較多，各?？筛鶕?jù)具體條件酌情選做。

第一版前言

《微生物學實驗》一書是根據(jù)1977年10月成都綜合性大學生物類教材會議制定的大綱

編寫的。在編寫過程中，為配合武漢大學、復(fù)旦大學編的《微生物學》教材，在內(nèi)容上有所

增加與修改。

本書共有實驗40個，內(nèi)容較多，其中包含與《微生物學》相配合、印證理論與進行微

生物實驗所需的基本操作與技能的訓(xùn)練兩大部分。各?？筛鶕?jù)具體條件酌情選做。

本書為方便教學，每一實驗基本上都按目的要求、基本原理、器材、操作步驟及結(jié)果與

思考題等五個部分來編寫的，各實驗所用染料、培養(yǎng)基、溶液與懸液等的配制均列在附錄內(nèi)。

由于編者水平所限，在取材、實驗方法與編排等方面確信有很多缺點與錯誤，希望讀者

批判指正。

在編寫過程中承武漢大學生物系微生物教研室基礎(chǔ)微生物學教學小組的大力支持，武漢

大學生物系陳寶聯(lián)同志繪制插圖，在此一并表示感謝。

范秀容沈萍

第二版前言

《微生物學實驗》第一版自1980年出版以來已有七八年了，在此期間，通過多次印刷,

印數(shù)已達十余萬冊。它在微生物學的教學與穩(wěn)固教學秩序方面起了積極的作用，但是也存在

很多缺點，加上近年來微生物學技術(shù)進展迅速，因此我們進行了出版第二版的修訂工作。

修訂內(nèi)容與特點如下：

1.將繁多的實驗按類歸納成15個部分，以求條理清晰，概念分明。每一部分冠以綜合

性說明，要緊簡單介紹該部分的內(nèi)容，闡述其在整個微生物學工作中的作用等。再在每一部

分選擇有代表性的重點，列出實驗，進行操作。

2.繼續(xù)著重微生物學實驗的基本操作與技能的訓(xùn)練。

3.實驗內(nèi)容做如下調(diào)整：

(1)為了加強學生對微生物及其應(yīng)用與無菌概念重要性的認識，與對實驗工具的質(zhì)量要

求與洗滌方法的熟悉，增加了“微生物學實驗室常用的器皿”、“環(huán)境中的微生物”與“食

品微生物學”等部分。

(2)使一些領(lǐng)域的內(nèi)容更加全面，比如在“顯微鏡的結(jié)構(gòu)、性能與使用方法”部分增加

了相差顯微鏡與電子顯微鏡；“微生物的純培養(yǎng)”部分增加了厭氧培養(yǎng)；微生物的遺傳方面

增加了藥物抗性菌的分離與細菌的接合作用等實驗。

(3)適當增加新技術(shù)的介紹，比如生化反應(yīng)中的微量簡易診檢系統(tǒng)；菌種保藏中的液氮

冷凍保藏法；水的微生物學檢查中增加了濾膜法等。

(4)此外，在基本操作訓(xùn)練方面集中介紹了動物的幾種不一致途徑的注射方法。

(5)由于“環(huán)境中的微生物”包含了空氣中微生物的檢查，故沒有再單獨設(shè)實驗，此外

還刪去了“巴斯德效應(yīng)”實驗。

第二版的實驗內(nèi)容較多，有些內(nèi)容由于實驗條件與學時的限制，可作為學生日后進一步

工作的參考。因此各?？筛鶕?jù)具體條件酌情選做。

4.第二版將實驗報告分為實驗結(jié)果與思考題兩部分。實驗結(jié)果盡量使用繪圖與表格形

式，并要求在表格內(nèi)用簡單符號與數(shù)字填寫，以使作業(yè)規(guī)范化，便于學生記錄與教師批改。

5.增加了部分插圖。

第二版要緊由范秀容、李廣武、沈萍同志編寫，彭珍榮同志參加編寫了部分實驗。

插圖除沿用第一版由陳寶聯(lián)同志繪制的以外，其余大部分插圖由熊定榮同志繪制，個別

插圖由劉啟融同志繪制，在此一并致謝。

由于編者的水平有限，本版的缺點與錯誤在所難免，尚請各位同仁與讀者提出寶貴意見。

編者

1988.6.

實驗須知

普通微生物學實驗課的目的是：訓(xùn)練學生掌握微生物學最基本的操作技能；熟悉微生物

學的基本知識；加深懂得課堂講授的某些微生物學理論。同時，通過實驗，培養(yǎng)學生觀察、

思考、分析問題與解決問題的能力；實事求是、嚴肅認確實科學態(tài)度與勤儉節(jié)約、愛護公物

的良好作風。

為了上好微生物學實驗課，并保證安全，特提出如下注意事項：

1.每次實驗前務(wù)必對實驗內(nèi)容進行充分預(yù)習，以熟悉實驗的目的、原理與方法，做到

心中有數(shù)，思路清晰。

2.認真及時做好實驗記錄，關(guān)于當時不能得到結(jié)果而需要連續(xù)觀察的實驗，則需記下

每次觀察的現(xiàn)象與結(jié)果，以便分析。

3.實驗室內(nèi)應(yīng)保持整潔，勿高聲談話與隨便走動，保持室內(nèi)安靜。

4.實驗時小心認真，全部操作應(yīng)嚴格按操作規(guī)程進行，萬一遇有盛菌試管或者瓶不慎

打破、皮膚破傷或者菌液吸入口中等意外情況發(fā)生時，應(yīng)立即報告指導(dǎo)教師，及時處理，切

勿隱瞞。

5.實驗過程中，切勿使酒精、乙醛、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險，應(yīng)先關(guān)掉

火源，再用濕布或者沙土掩蓋滅火。必要時用滅火機。

6.使用顯微鏡或者其他貴重儀器時，要求細心操作，特別愛護。對消耗材料與藥品等

要力求節(jié)約，用畢后仍放回原處。

7.每次實驗完畢后，務(wù)必把所用儀器抹凈放妥，將實驗室收拾整齊，擦凈桌面，如有

菌液污染桌面或者其他地方時，可用3%來蘇爾液或者5%石炭酸液覆蓋其上半小時后擦去,

如系芽抱桿菌，應(yīng)適當延長消毒時間。凡帶菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗滌前須浸

泡在3%來蘇爾液中進行消毒。

8.每次實驗需進行培養(yǎng)的材料，應(yīng)標明自己的組別及處理方法，放于教師指定的地點

進行培養(yǎng)。實驗室中的菌種與物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。

9.每次實驗的結(jié)果，應(yīng)以實事求是的科學態(tài)度填入報告表格中，力求簡明準確，并連

同思考題及時匯交教師批閱。

10.離實驗室前應(yīng)將手洗凈，注意關(guān)閉門窗、燈、火、煤氣等。

I、微生物學實驗室常用的器皿

微生物學實驗室所用的玻璃器皿，大多要進行消毒、滅菌與用來培養(yǎng)微生物，因此對其

質(zhì)量、洗滌與包裝方法均有一定的要求。通常，玻璃器皿的質(zhì)量要求硬質(zhì)玻璃，才能承受高

溫與短暫燒灼而不致破舊；器皿的游離堿含量要少，否則會影響培養(yǎng)基的酸堿度；對玻璃器

皿的形狀與包裝方法的要求，以能防止污染雜菌為準；洗滌方法不恰當也會影響實驗結(jié)果。

本節(jié)將對這幾方面作全面介紹。

一、器皿的種類、要求與應(yīng)用

1.試管（testtube）

微生物學實驗室所用玻璃試管,其管壁務(wù)必比化學實驗室用的厚些,這樣在塞棉花塞時,

管口才不可能破舊。試管的形狀要求沒有翻口（圖IT,A）,不然，微生物容易從棉塞與

管口的縫隙間進入試管（圖IT,B）而造成污染。此外，現(xiàn)在有不用棉塞而用鋁制或者塑

料制的試管帽（圖IT,C）,若用翻口試管也不便于蓋試管帽。有的實驗要求盡量減低蒸

發(fā)試管內(nèi)的水分，則需使用螺口試管（圖IT,D）,蓋以螺口膠木或者塑料帽。

試管的大小可根據(jù)用途的不一致，準備下列三種型號。

(1)大試管(約18X180mni)可盛倒培養(yǎng)皿用的培養(yǎng)基；亦可作制備瓊脂斜面用(需

要大量菌體時用)。

(2)中試管(約13—15X100—150mm)盛液體培養(yǎng)基或者做瓊脂斜面用，亦可用于病

毒等的稀釋與血清學試驗。

(3)小試管(10—12X100mm)通常用于糖發(fā)酵試驗或者血清學試驗，與其他需要節(jié)約

材料的試驗

2.德漢氏試管(Durhamtube)

觀察細菌在糖發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)氣情況時，通常在小試管內(nèi)再套一倒置的小套管(約6

X36mm)(圖1-2),此小套管即為德漢氏試管，又稱發(fā)酵小套管。

3.吸管(又稱移液管，pipette)

(1)玻璃吸管(glasspipette)微生物學實驗室通常要準備1、5、10ml的刻度玻璃

吸管(圖1-3,A)。與化學實驗室所用的不一致，其刻度指示的容量往往包含管尖的液體

體積，亦即使用時要注意將所吸液體吹盡，故有的時候稱之“吹出”吸管。市售細菌學用吸

管，有的在吸管上端刻有“吹”字。

除有刻度的吸管外，有的時候需用不計量的毛細吸管，又稱滴管(圖1-3,B),來吸

取動物體液與離心上清液與滴加少量抗原、抗體等。

(2)活塞吸管(pistonpipette)要緊用來吸取微量液體，故又稱微量吸液器或者微

量加樣器。其外形與結(jié)構(gòu)如圖1-4,除塑料外殼外，要緊部件有按鈕、彈簧、活塞與可裝卸

的吸嘴。按動按鈕，通過彈簧使活塞上下活動，從而吸進與放出液體。其特點是容量固定,

使用時不用觀察刻度，操作方便、迅速。國內(nèi)產(chǎn)品通常每個活塞吸管固定一種容量，分別有

5、10、20、25、50、100、200、500、1000口1等不一致容量。而精制的活塞吸管每個在一

定的范圍內(nèi)可調(diào)節(jié)幾個容積，比如在5—25口1的范圍內(nèi)，可調(diào)節(jié)5、10、15、20、25u1

五個不一致的量，使用時按需要調(diào)節(jié)，但當調(diào)節(jié)固定后，每吸一次，容量仍是固定的。用畢

只需調(diào)換吸嘴或者將吸嘴洗凈，消毒后再行使用。

活塞吸管是國外70年代后半期才開始生產(chǎn)與應(yīng)用的，近年來國內(nèi)亦日益廣泛應(yīng)用于免

疫學與使用同位素等的科學實驗中。

4.培養(yǎng)皿(petridish)

常用的培養(yǎng)皿(圖1-5),皿底直徑90mm,高15mm。培養(yǎng)皿通常均為玻璃皿蓋，但有

特殊需要時，可使用陶器皿蓋，因其能汲取水分，使培養(yǎng)基表面干燥，比如測定抗生素生物

效價時，培養(yǎng)皿不能倒置培養(yǎng)，則用陶器皿蓋為好。

在培養(yǎng)皿內(nèi)倒入適量固體培養(yǎng)基制成平板，用于分離、純化、鑒定菌種、微生物計數(shù)與

測定抗生素、噬菌體的效價等。

5.三角燒瓶(Erlenmeyerflask)與燒杯(beaker)

三角燒瓶有100、250、500.1000ml等不一致的大小，常用來盛無菌水、培養(yǎng)基與搖瓶

發(fā)酵等。常用的燒杯有50、100、250、500、1000ml等，用來配制培養(yǎng)基與藥品。

6.注射器(injector)

通常有1、2、5、10、20、50ml等不一致容量的注射器。注射抗原于動物體內(nèi)可根據(jù)需

要使用1、2與5ml的；抽取動物心臟血或者綿羊靜脈血可使用10、20、50ml的。

微量注射器有10、20、50、100口1等不一致的大小。通常在免疫學或者紙層析等實驗

中滴加微量樣品時應(yīng)用。

7.載玻片(slide)與蓋玻片(coverslip)

普通載玻片大小為75X25mm,用于微生物涂片、染色，作形態(tài)觀察等。蓋玻片為18X

18mm。

凹玻片是在一塊厚玻片的當中有一圓形凹窩(圖I-6),作懸滴觀察活細菌與微室培養(yǎng)

用。

8.雙層瓶(doublebottle)

由內(nèi)外兩個玻璃瓶構(gòu)成(圖I-7),內(nèi)層小錐形瓶盛放香柏油，供油鏡頭觀察微生物時

使用，外層瓶盛放二甲苯，用以擦凈油鏡頭。

9.滴瓶(dropperbottle)

用來裝各類染料、生理鹽水等(圖1-8)。

10.接種工具

接種工具有接種環(huán)(inoculatingloop)、接種針(inocula-tingneedle)＞接種鉤

(inoculatinghook)、接種鏟(inocula-tingshovel)、玻璃涂布器(glassspreader)

等(圖1-9)。制造環(huán)、針、鉤、鏟的金屬可用鉗或者鏢，原則是軟硬適度，能經(jīng)受火焰反

復(fù)燒灼，又易冷卻。接種細菌與酵母菌用接種環(huán)與接種針，其伯絲或者銀絲的直徑以0.5mm

為適當，環(huán)的內(nèi)徑約2mm,環(huán)面應(yīng)平整。接種某些不易與培養(yǎng)基分離的放線菌與真菌，有的

時候用接種鉤或者接種鏟，其絲的直徑要求粗一些，約1mm。用涂布法在瓊脂平板上分離單

個菌落時需用玻璃涂布器，是將玻棒彎曲或者將玻棒一端燒紅后壓扁而成。

二、玻璃器皿的清洗方法

清潔的玻璃器皿是實驗得到正確結(jié)果的先決條件，因此，玻璃器皿的清洗是實驗前的一

項重要準備工作。清洗方法根據(jù)實驗?zāi)康摹⑵髅蟮姆N類、所盛放的物品、洗滌劑的類別與沾

污程度等的不一致而是完全不一致的?，F(xiàn)分述如下：

1.新玻璃器皿的洗滌方法

新購置的玻璃器皿含游離堿較多，應(yīng)在酸溶液內(nèi)先浸泡數(shù)小時。酸溶液通常用2%的鹽

酸或者洗滌液(見本小節(jié)“3”)。浸泡后用自來水沖洗干凈。

2.使用過的玻璃器皿的洗滌方法

(1)試管、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、燒杯等可用瓶刷或者海綿沾上肥皂或者洗衣粉或者去污

粉等洗滌劑刷洗，然后用自來水充分沖洗干凈。熱的肥皂水去污能力更強，可有效地洗去器

皿上的油污。洗衣粉與去污粉較難沖洗干凈而常在器壁上附有一層微小粒子，故要用水多次

甚至10次以上充分沖洗，或者可用稀鹽酸搖洗一次，再用水沖洗，然后倒置于鐵絲框內(nèi)或

者有空心格子的木架(圖IT0)上，在室內(nèi)晾干。急用時可盛于框內(nèi)或者搪瓷盤上，放烘

箱烘干。

玻璃器皿經(jīng)洗滌后，若內(nèi)壁的水是均勻分布成一薄層，表示油垢完全洗凈，若掛有水珠,

則還需用洗滌液浸泡數(shù)小時，然后再用自來水充分沖洗。

裝有固體培養(yǎng)基的器皿應(yīng)先將其刮去，然后洗滌。帶菌的器皿在洗滌前先浸在2%煤酚

皂溶液(來蘇爾)或者0.25%新潔爾滅消毒液內(nèi)24小時或者煮沸半小時，再用上法洗滌。

帶病原菌的培養(yǎng)物最好先行高壓蒸汽滅菌，然后將培養(yǎng)物倒去，再進行洗滌。

盛放通常培養(yǎng)基用的器皿經(jīng)上法洗滌后，即可使用，若需精確配制化學藥品，或者做科

研用的精確實驗，要求自來水沖洗干凈后，再用蒸鐳水淋洗三次，晾干或者烘干后備用。

(2)玻璃吸管吸過血液、血清、糖溶液或者染料溶液等的玻璃吸管(包含毛細吸管)，

使用后應(yīng)立即投入盛有自來水的量筒或者標本瓶內(nèi)，免得干燥后難以沖洗干凈。量筒或者標

本瓶底部應(yīng)墊以脫脂棉花，否則吸管投入時容易破舊。待實驗完畢，再集中沖洗。若吸管頂

部塞有棉花，則沖洗前先將吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，用水將棉花沖出，然后

再裝入吸管自動洗滌器內(nèi)沖洗，沒有吸管自動洗滌器的實驗室可用沖出棉花的方法多沖洗片

刻。必要時再用蒸儲水淋洗。洗凈后，放搪瓷盤中晾干，若要加速干燥，可放烘箱內(nèi)烘干。

吸過含有微生物培養(yǎng)物的吸管亦應(yīng)立即投入盛有2%煤酚皂溶液或者0.25%新潔爾滅

消毒液的量筒或者標本瓶內(nèi)，24小時后方可取出沖洗。

吸管的內(nèi)壁假如有油垢，同樣應(yīng)先在洗滌液內(nèi)浸泡數(shù)小時，然后再行沖洗。

(3)載玻片與蓋玻片用過的載玻片與蓋玻片如滴有香柏油，要先用皺紋紙擦去或者浸在

二甲苯內(nèi)搖晃幾次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5-10分鐘，用軟布或者脫脂棉花擦試,

立即用自來水沖洗，然后在稀洗滌液中浸泡0.5—2小時，自來水沖去洗滌液，最后用蒸儲

水換洗數(shù)次，待干后浸于95%酒精中儲存?zhèn)溆?。使用時在火焰上燒去酒精。用此法洗滌與

儲存的載玻片與蓋玻片清潔透亮，沒有水珠。

檢查過活菌的載玻片或者蓋玻片應(yīng)先在2%煤酚皂溶液或者0.25%新潔爾滅溶液中浸

泡24小時，然后按上法洗滌與儲存。

3.洗滌液的配制與使用

（1）洗滌液的配制洗滌液分濃溶液與稀溶液兩種，配方如下：

濃溶液重銘酸鈉或者重銘酸鉀（工業(yè)用）50g

自來水150ml

濃硫酸（工業(yè)用）800ml

稀溶液重格酸鈉或者重銘酸鉀（工業(yè)用）50g

自來水850ml

濃硫酸（工業(yè)用）100ml

配法都是將重格酸鈉或者重銘酸鉀先溶解于自來水中，可慢慢加溫，使溶解，冷卻后徐

徐加入濃硫酸，邊加邊攪動。

配好后的洗滌液應(yīng)是棕紅色或者桔紅色。貯存于有蓋容器內(nèi)。

（2）原理重銘酸鈉或者重銘酸鉀與硫酸作用后形成銘酸（chro-micacid）,酪酸的

氧化能力極強，因而此液具有極強的去污作用。

（3）使用注意事項（a）洗滌液中的硫酸具有強腐蝕作用，玻璃器皿浸泡時間太長，

會使玻璃變質(zhì)，因此切忌到時不記得將器皿取出沖洗。其次，洗滌液若沾污衣服與皮膚應(yīng)立

即用水洗，再用蘇打水或者氨液洗。假如濺在桌椅上，應(yīng)立即用水洗去或者濕布抹去；（b）

玻璃器皿投入前，應(yīng)盡量干燥，避免洗滌液稀釋；（c）此液的使用僅限于玻璃與瓷質(zhì)器皿,

不適用于金屬與塑料器皿；（d）有大量有機質(zhì)的器皿應(yīng)先行擦洗，然后再用洗滌液，這是

由于有機質(zhì)過多，會加快洗滌液失效，此外，洗滌液雖為很強的去污劑，但也不是所有的污

跡都可清除；（e）盛洗滌液的容器應(yīng)始終加蓋，以防氧化變質(zhì)；（f）洗滌液可反復(fù)使用，

但當其變?yōu)槟G色時即已失效，不能再用。

三、空玻璃器皿的包裝

1.培養(yǎng)皿的包裝

培養(yǎng)皿常用舊報紙密密包緊，通常以5—8套培養(yǎng)皿作一包，少于5套工作量太大，多

于8套不易操作。包好后行于熱滅菌。如將培養(yǎng)皿放入銅筒內(nèi)進行干熱滅菌，則不必用紙包,

銅筒有一圓筒形的帶蓋外筒，里面放一裝培養(yǎng)皿的帶底框架（圖IT1）,此框架可自圓筒

內(nèi)提出，以便裝取培養(yǎng)皿。

2.吸管的包裝

準備好干燥的吸管，在距其粗頭頂端約0.5cm處，塞一小段約1.5cm長的棉花，以免

使用時將雜菌吹入其中，或者不慎將微生物吸出管外。棉花要塞得松緊恰當，過緊，吹吸液

體太費力；過松，吹氣時棉花會下滑。然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報紙條的近左端,

與報紙約呈45度角（圖IT2）,并將左端多余的一段紙覆折在吸管上，再將整根吸管卷入

報紙，右端多余的報紙打一小結(jié)。如此包好的很多吸管可再用一張大報紙包好，進行干熱滅

菌。

假如有裝吸管的銅筒（圖1-13）,亦可將分別包好的吸管一起

裝入銅筒，進行干熱滅菌；若估計一筒滅菌的吸管可一次用完，亦可不用報紙包而直接

裝入銅筒滅菌，但要求將吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用時，銅筒臥放在桌上，用

手持粗端拔出。

3.試管與三角燒瓶等的包裝

試管管口與三角燒瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的方法見實驗十九），然后在棉花塞與管

口與瓶口的外面用兩層報紙（不可用油紙）與細線包扎好，進行干熱滅菌。試管塞好棉花塞

后也可一起裝在鐵絲簍中，用大張報紙將一簍試管口做一次包扎，包紙的目的在于儲存期避

免灰塵侵入。

空的玻璃器皿通常用干熱滅菌，若需濕熱滅菌，則要多用幾層報紙包扎，外面最好再加

一層牛皮紙。

假如試管是蓋的鋁帽，則不必包紙，可直接干熱滅菌。用塑料帽，則宜濕熱滅菌。

II.環(huán)境中的微生物

由于微生物是肉眼看不見的，因此初學微生物學的學生常不明白外界環(huán)境與所有與外界

接觸的身體各部位均有微生物的存在。實際上它們廣泛分布于室內(nèi)外的空氣、水與土壤中，

桌、椅與板凳的表面，衣服與身體的皮膚、粘膜（比如鼻腔、口腔、喉頭等的粘膜）等處,

因此，能夠說微生物是無縫不鉆，無孔不入的。在學生第一次進入微生物學實驗室時，建立

起“微生物無所不在”這一概念是特別重要的，由于這樣才能體會到無菌技術(shù)與環(huán)境衛(wèi)生的

必要性，才能防止外界微生物對培養(yǎng)物的污染，才能防止病原性細菌或者病毒通過手或者衣

服進入人體而引起傳染。

從周圍環(huán)境與體表各部取樣生長出來的微生物，盡管大多數(shù)屬正常菌群，但當進入破舊

的皮膚或者傳入口內(nèi)或者眼睛等處也會引起傳染，這一方面是由于通過培養(yǎng)，微生物的量大;

另一方面，有些微生物在一定的部位是非致病菌，但當條件改變時也可能致?。ǚQ之條件致

病菌），因此務(wù)必全面閱讀操作步驟與聽從指導(dǎo)者的說明，特別是用過的棉簽與工作完畢后

的培養(yǎng)物等均要放在指定的容器內(nèi)，接種環(huán)不僅在用前務(wù)必燒灼滅菌，而且用后也應(yīng)立即燒

灼。這是整個微生物學實驗課程與今后進行微生物學實驗時均需注意的。

下面的實驗就是從實驗室空氣、實驗臺、門的旋扭（或者把手）與人的頭發(fā)、皮膚、洗

手前后的手指與鼻腔粘膜等處取樣，接種于瓊脂平板上，經(jīng)培養(yǎng)1—2天后，觀察并比較不

一致來源的微生物生長的數(shù)量與類型。

實驗一實驗室環(huán)境與人體表面微生物的檢查

一、目的要求

1.證明實驗室環(huán)境與體表存在微生物。

2.比較來自不一致場所與不一致條件下細菌的數(shù)量與類型。

3.體會無菌操作的重要性。

二、基本原理

平板培養(yǎng)基含有細菌生長所需要的營養(yǎng)成分，當取自不一致來源的樣品接種于培養(yǎng)基

上，在37c溫度下培養(yǎng)，1一2天內(nèi)每一菌體即能通過很多次細胞分裂而進行繁殖，形成一

個可見的細胞群體的集落，稱之菌落。每一種細菌所形成的菌落都有它自己的特點，比如菌

落的大小，表面干燥或者濕潤、隆起或者扁平、粗糙或者光滑，邊緣整齊或者不整齊，菌落

透明或者半透明或者不透明，顏色與質(zhì)地疏松或者緊密等。因此，可通過平板培養(yǎng)來檢查環(huán)

境中細菌的數(shù)量與類型。

三、器材

肉膏蛋白陳瓊脂平板，無菌水，滅菌棉簽（裝在試管內(nèi)），接種環(huán)，試管架，酒精燈或

者煤氣燈，記號筆（或者蠟筆），廢物缸。

四、操作步驟

每組在“實驗室”與“人體”兩大部分中各選擇一個內(nèi)容做實驗，或者由教師指定分配,

最后結(jié)果供全班討論。

1.寫標簽

任何一個實驗，在動手操作前均需首先將器皿用記號筆做上記號，培養(yǎng)皿的記號通常寫

在皿底上。假如寫在皿蓋上，同時觀察兩個以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開皿蓋時，容易混淆。用

記號筆寫上班級、姓名、日期，本次實驗還要寫上樣品來源（如實驗室空氣或者無菌室空氣

或者頭發(fā)等），字盡量小些，寫在皿底的一邊，不要寫在當中，以免影響觀察結(jié)果。

2.實驗室細菌檢查

（1）空氣將一個肉膏蛋白陳瓊脂平板放在當時做實驗的實驗室，移去皿蓋，使瓊脂培

養(yǎng)基表面暴露在空氣中；將另一肉膏蛋白陳瓊脂平板放在無菌室或者無人走動的其他實驗

室，移去皿蓋。一小時后蓋上兩個皿蓋。

（2）實驗臺與門的旋鈕

（a）用記號筆在皿底外面中央畫一直線，再在此線中間處畫一垂直線，如圖HT。

（b）取棉簽左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣與小指、無名指夾持

棉塞（或者試管帽），將其取出（圖n-2,B）,將管口很快地通過煤氣燈（或者酒精燈）

的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指與食指將棉簽小心地取出（圖n-2,c）o

放回棉塞（或者試管帽）（圖n-2,D）,并將空試管放在試管架上。

（c）弄濕棉簽左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞（或者試管帽）并燒灼管口，將棉

簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管

口，放回棉塞（或者試管帽），并將滅菌水試管放在試管架上。

（d）取樣將濕棉簽在實驗臺面或者門旋鈕上擦拭約2平方厘米的范圍。

（e）接種按圖11-3,A在火焰旁用左手拇指與食指或者中指使平皿開啟成一縫。再將

棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動一下）（圖II-3,B）,立即閉合皿蓋。并按圖H-2,

E與F,將原放棉簽的空試管拔出棉塞（或者試管帽），燒灼管口，插入用過的棉簽，將試

管放回試管架。

（f）劃線另取接種環(huán)在火焰上滅菌，如圖n-4,先將環(huán)端燒熱（圖n-4,1）,然后

將接種環(huán)提起垂直放在火焰上（圖II-4,2）,以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種

環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養(yǎng)皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快

地來回通過火焰數(shù)次（圖n-4,3）o

左手拿起平板，同樣開啟一縫，將滅過菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊緣空白處

試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙），通過瓊脂頂端的接種區(qū)，向下劃線，直到平板的一半

處（圖II-3,C）o注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動的壓力不能太大，否則會刺

破瓊脂。

閉合皿蓋，左手將平板向左轉(zhuǎn)動至空白處，右手拿的接種環(huán)再在火焰上燒灼，使冷。接

種環(huán)通過前面劃的線條再在瓊脂的另一半，按圖n-3,D從上向下來回劃線至1/2處。

燒灼接種環(huán)，轉(zhuǎn)動平板，按圖II-3,E,劃最后1/4,立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放

回原處。

整個劃線操作均要求無菌操作，即靠近火焰，而且動作要快。

3.人體細菌的檢查

（1）手指（洗手前與洗手后）

（a）分別在兩個瓊脂平板上標明洗手前與洗手后（當然，班級、姓名、日期各項在每

次寫標簽時是必不可少的）。

（b）移去皿蓋，將未洗過的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來回劃線，蓋上皿蓋。

（c）用肥皂與刷子，用力刷手，在流水中沖洗干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來

回移動，蓋上皿蓋。

（2）頭發(fā)在掀開皿蓋的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動數(shù)次，使細菌降落到瓊

脂平板表面，然后蓋上皿蓋。

（3）咳嗽將去蓋瓊脂平板放在離口約6—8cm處，對著瓊脂表面用力咳嗽，然后蓋上

皿蓋。

（4）鼻腔

（a）按照實驗臺檢查法的步驟（b）與（c）,取出棉簽，并將其弄濕。

（b）用濕棉簽在鼻腔內(nèi)滾動數(shù)次。

（c）按實驗臺檢查法的步驟（e）與（f）,接種與劃線，然后蓋上皿蓋。

4.將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底在上，放37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1—2天。

5.結(jié)果記錄方法

（1）菌落計數(shù)在劃線的平板上，假如菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后1/4面積內(nèi)的菌

落數(shù)。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)1/4面積的菌落數(shù)。

（2）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不一致的菌落類型。但要注意，假

如細菌數(shù)量太多，會使很多菌落生長在一起，或者者限制了菌落生長而變得很小，因而外觀

不典型，故觀察菌落的特點時，要選擇分離得很開的單個菌落。

菌落特征描寫方法如下：

（a）大小大、中、小、針尖狀。可先將整個平板上的菌落粗略觀察一下，再決定大、

中、小的標準，或者由教師指出一個大小范圍。

（b）顏色黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。

（c）干濕情況干燥、濕潤、粘稠。

（d）形態(tài)圓形、不規(guī)則等。（e）高度扁平、隆起、凹下。

（f）透明程度透明、半透明、不透明。

（g）邊緣整齊、不整齊。

五、實驗報告

1.結(jié)果

（1）將你自己的平板結(jié)果記錄于下表中。

樣品菌落數(shù)菌落特征描寫

來源（近似值）類型大小形態(tài)干濕圖度透明度顏色邊絳

1.1

2

3

4

5

2.1

2

3

4

5

（2）與其他同學所做的結(jié)果進行比較。

2.思考題

（1）比較各類來源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類型最多？

（2）人多的實驗室與無菌室（或者無人走動的實驗室）相比，平板上的菌落數(shù)與菌落

類型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？

（3）洗手前后的手指平板，菌落數(shù)有無區(qū)別？

（4）通過本次實驗，在防止培養(yǎng)物的污染與防止細菌的擴散方面，你學到些什么？有

什么體會？

m.顯微鏡的構(gòu)造、性能與使用方法

由于微生物個體細小，因此我們務(wù)必用顯微鏡來研究它們的個體形態(tài)與細胞結(jié)構(gòu)。熟悉

顯微鏡與掌握顯微鏡的操作技術(shù)是研究微生物不可缺少的手段。

現(xiàn)代顯微鏡通常能夠分為兩大類，一類是光學顯微鏡，另一類是非光學顯微鏡。這兩類

顯微鏡又可根據(jù)不一致的情況分成若干類型，現(xiàn)列表如下：

明視野顯微鏡

按照明技術(shù)暗視野顯微鏡

熒光顯微鏡

'相差顯微鏡

可見光顯微鏡按像的形成分干涉相差顯微鏡

,偏光顯微鏡

光學顯微鏡

顯.倒置顯微鏡

微按鏡體結(jié)構(gòu)分實體顯微鏡

鏡比較顯微鏡

.紫外光顯微鏡

不可見光顯微鏡紅外光顯微鏡

姍線顯微鏡

透射電子顯微鏡

電子顯微鏡

非光學顯微鏡掃描電子顯微鏡

超聲波顯微鏡

本部分包含普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡與電子顯微鏡四個實驗。目的

在于使同學們通過這四個實驗，對兩種類型的顯微鏡有較全面的熟悉，并重點掌握明視野普

通光學顯微鏡的使用。關(guān)于電子顯微鏡則著重熟悉其工作原理，并要求掌握制作電子顯微鏡

標本的基本技術(shù)。

實驗二普通光學顯微鏡

一、目的要求

1.熟悉普通光學顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。2.學習并掌握油鏡的原理與使用方法。

二、顯微鏡的基本構(gòu)造

顯微鏡由機械裝置與光學系統(tǒng)兩大部分構(gòu)成(圖IIIT)。

1.機械裝置

鏡座(base)與鏡臂(arm)鏡座位于顯微鏡底部，呈馬蹄形，它支持全鏡。鏡臂有固

定式與活動式兩種，活動式的鏡臂可改變角度。鏡臂支持鏡筒。

鏡筒(bodytube)是由金屬制成的圓筒，上接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器。鏡筒有單筒與雙筒

兩種，單筒又可分為直立式與后傾式兩種。而雙筒則都是傾斜式的，傾斜式鏡筒傾斜45°。

雙筒中的一個目鏡有屈光度調(diào)節(jié)裝置，以備在兩眼視力不一致的情況下調(diào)節(jié)使用。

轉(zhuǎn)換器(nosepiece)為兩個金屬碟所合成的一個轉(zhuǎn)盤，其上裝3—4個物鏡，可使每

個物鏡通過鏡筒與目鏡構(gòu)成一個放大系統(tǒng)。

載物臺(stage)又稱鏡臺，為方形或者圓形的盤，用以載放被檢物體，中心有一個通

光孔。在載物臺上有的裝有兩個金屬壓夾稱標本夾，用以固定標本；有的裝有標本推動器,

將標本固定后，能向前后左右推動。有的推動器上還有刻度，能確定標本的位置，便于找到

變換的視野。

調(diào)焦裝置是調(diào)節(jié)物鏡與標本間距離的機件，有粗動螺旋(coarseadjustment)即粗調(diào)

節(jié)器與微動螺旋(fineadjustment)即細調(diào)節(jié)器，利用它們使鏡筒或者鏡臺上下移動，當

物體在物鏡與目鏡焦點上時，則得到清晰的圖像。

2.光學系統(tǒng)

物鏡(objective)物鏡安裝在鏡筒下端的轉(zhuǎn)換器上，因接近被觀察的物體，故又稱接

物鏡。其作用是將物體作第一次放大，是決定成像質(zhì)量與分辨能力的重要部件。物鏡上通常

標有數(shù)值孔徑、放大倍數(shù)、鏡筒長度、焦距等要緊參數(shù)。如：NA0.30；10X；160/0.17；

16mm。其中"NA0.30”表示數(shù)值孔徑(numericalaperture,簡寫為NA),"10X"表示

放大倍數(shù)，“160/0.17”分別表示鏡筒長度與所需蓋玻片厚度(mm),16mm表示焦距。

目鏡(ocularlens)裝于鏡筒上端，由兩塊透鏡構(gòu)成。鏡把物鏡造成的像再次放大,

不增加分辨力，上面通常標有7X、10X、15X等放大倍數(shù)，可根據(jù)需要選用。通常可按與

物鏡放大倍數(shù)的乘積為物鏡數(shù)值孔徑的500—700倍，最大也不能超過1000倍的選擇。目鏡

的放大倍數(shù)過大，反而影響觀察效果。

聚光器(condenser)光源射出的光線通過聚光器匯聚成光錐照射標本，增強照明度與

造成適宜的光錐角度，提高物鏡的分辨力。聚光器由聚光鏡與虹彩光圈(irisdiaphragm)

構(gòu)成，聚光鏡由透鏡構(gòu)成，其數(shù)值孔徑可大于1,當使用大于1的聚光鏡時，需在聚光鏡與

載玻片之間加香柏油，否則只能達到1.0。虹彩光圈由簿金屬片構(gòu)成，中心形成圓孔，推

動把手可隨意調(diào)整透進光的強弱。調(diào)節(jié)聚光鏡的高度與虹彩光圈的大小，可得到適當?shù)墓庹?/p>

與清晰的圖像。

光源(lightsource)較新式的顯微鏡其光源通常是安裝在顯微鏡的鏡座內(nèi)，通過按鈕

開關(guān)來操縱；老式的顯微鏡大多是使用附著在鏡臂上的反光鏡，反光鏡是一個兩面鏡子，一

面是平面，另一面是凹面。在使用低倍與高倍鏡觀察時，用平面反光鏡；使用油鏡或者光線

弱時可用凹面反光鏡。

濾光片(filter)可見光是各類顏色的光構(gòu)成的，不一致顏色的光線波長不一致。如只

需某一波長的光線時，就要用濾光片。選用適當?shù)臑V光片，能夠提高分辨力，增加影像的反

差與清晰度。濾光片有紫、青、藍、綠、黃、橙、紅等各類顏色的，分別透過不一致波長的

可見光，可根據(jù)標本本身的顏色，在聚光器下加相應(yīng)的濾光片。

3.成像原理

普通光學顯微鏡的成像原理如圖山-2所示。

三、油鏡物鏡的基本原理

微生物學研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡(16mm,10X)、高倍物鏡(4mm,40

-45X)與油鏡(1.8mm,95—100X)三種。油鏡通常標有黑圈或者紅圈，也有的以“01

(oilimmer-sion)字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。根據(jù)使用不一致放大倍數(shù)的目

鏡，可使被檢物體放大1000—2000多倍。從圖III-3中可看出油鏡的焦距與工作距離(標

本在焦點上看得最清晰時，物鏡與樣品之間的距離)最短，光圈則開得最大，因此，在使用

油鏡觀察時，鏡頭離標本十分近，需特別小心。

使用時，油鏡與其他物鏡的不一致是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油

質(zhì)，稱之油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=l.52,與玻璃相同。當光線

通過載玻片后，可直接通過香柏油進入物鏡而不發(fā)生折射。假如玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空

氣，則稱之干燥系，當光線通過玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進入物鏡的光線顯然減少,

這樣就減低了視野的照明度(圖III-4)。

利用油鏡不但能增加照明度，更要緊的是能增加數(shù)值孔徑，由于顯微鏡的放大效能是由

其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度(稱之鏡口角)的一半

正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：

NA=n,sina

式中NA=數(shù)值孔徑；

n=介質(zhì)折射率；

a=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。

因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大(圖HI-5),該角度的大小決

定于物鏡的直徑與焦距。同時，a的理論限度為90°,sin90°=1,故以空氣為介質(zhì)時(n=l),

數(shù)值孔徑不能超過1,如以香柏油為介質(zhì)時，則n增大，其數(shù)值孔徑也隨之增大。如光線入

射角為120。，其半數(shù)的正弦為sin60°=0.87,則:

以空氣為介質(zhì)時：

NA=1XO.87=0.87

以水為介質(zhì)時：

NA=1.33X0.87=1.15

以香柏油為介質(zhì)時：

NA=1.52X0.87=1.32

顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。它與物鏡的數(shù)值孔徑成

正比，與光波長度成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長越短，則顯微鏡的分辨力

愈大，被檢物體的細微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來。因此，一個高的分辨力意味著一個小的

可分辨距離，這兩個因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或者納米，這

實際上是把分辨力與最小分辨距離混淆起來了。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來表

示的。

能辨別兩點之間最小距離=—

式中入=光波波長。

我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L度為0.55nm,假如數(shù)值孔徑為0.65的高倍物鏡，

它能辨別兩點之間的距離為0.42口m。而在0.42um下列的兩點之間的距離就分辨不出，

即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用數(shù)值孔徑更

大的物鏡，增加其分辨力才行。比如用數(shù)值孔徑為1.25的油鏡時，能辨別兩點之間的

最小距離=點7=0.22|^。

因此，我們能夠看出，假如使用放大率為40倍的高倍物鏡(NA=0.65),與放大率為

24倍的目鏡，盡管總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有0.42um。假如使用放大

率為90倍的油鏡(NA=1.25),與放大率為9倍的目鏡，盡管總的放大率為810倍，但卻

能分辨出0.2211m間的距離。

四、器材

顯微鏡，顯微鏡燈，香柏油，二甲苯；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)染色玻片標本，

枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)染色玻片標本。

五、操作步驟

1.觀察前的準備

(1)置顯微鏡于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約3—4cm。鏡檢者姿勢要端正，

通常用左眼觀察，右眼便于繪圖或者記錄，兩眼務(wù)必同時睜開，以減少疲勞，亦可練習左右

眼均能觀察。

(2)調(diào)節(jié)光源，對光時應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置

與鏡頭，并刺激眼睛。如陰暗天氣，可用日光燈或者顯微鏡燈照明。

調(diào)節(jié)光源時，先將光圈完全開放，升高聚光鏡至與載物臺同樣高，否則使用油鏡時光線

較暗。然后轉(zhuǎn)下低倍鏡觀察光源強弱，調(diào)節(jié)反光鏡，光線較強的天然光源宜用平面鏡；光線

較弱的天然光源或者人工光源宜用凹面鏡。在對光時，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。凡檢

查染色標本時，光線應(yīng)強；檢查未染色標本時，光線不宜太強。可通過擴大或者縮小光圈、

升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。

2.低倍鏡觀察

檢查的標本需先用低倍鏡觀察，由于低倍鏡視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標與確定檢查的位置。

將金黃色葡萄球菌染色標本置鏡臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使觀察對象處在物

鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使物鏡降至距標本約0.5cm處，由目鏡觀察，如今可適當?shù)乜s

小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物

像出現(xiàn)后再用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清晰時為止，然后移動標本，認真觀察標本各部位，找到

合適的目的物，并將其移至視野中心，準備用高倍鏡觀察。

3高倍鏡觀察

將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然

后由目鏡觀察，并認真調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜，同時用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒至物

像出現(xiàn)后，再用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至物像清晰為止，找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視

野中心，準備用油鏡觀察。

4.油鏡觀察

（1）用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm,將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。

（2）在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

（3）從側(cè)面凝視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎

與標本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞

鏡頭。

'°（4）從接目鏡內(nèi)觀察，進一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升,

直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細調(diào)節(jié)器校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物像，務(wù)必

再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。

（5）用同樣的方法觀察枯草芽抱桿菌染色標本。

（6）觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯

（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌

用手或者其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。（7）將各部分還

原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡

與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。

六、實驗報告

1.結(jié)果

分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡與油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌及枯草芽抱桿菌的狀

態(tài)，包含在三種情況下視野中的變化，同時注明物鏡放大倍數(shù)與總放大率。

2.思考題

（1）在使用高倍鏡與油鏡進行調(diào)焦時，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？

（2）用油鏡觀察時，為什么要在載玻片上滴加香柏油？

（3）在明視野顯微鏡下，觀察細菌形態(tài)時，你認為用染色標本好，還是用未染色的活

標本好，為什么？

實驗三暗視野光學顯微鏡

一、目的要求

1.熟悉暗視野顯微鏡的基本原理及用途。

2.學習并掌握使用暗視野顯微鏡觀察微生物樣品的基本技術(shù)。

二、基本原理

生活的細菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清。暗視野顯微鏡的原理與來自縫

隙的一束強光通過暗室時，可清晰地看到其中細微灰塵的現(xiàn)象是一樣的，即給樣品照明的光

不直接穿過物鏡，而是由樣品上反射或者折射的光進入物鏡，那么，在漆黑的視野中，由于

反差增大了，使樣品能夠看得更清晰。因用暗視野法能夠在黑暗的視野中看到光亮的菌體,

故在觀察生活細菌及細菌運動經(jīng)常使用此法。

暗視野顯微鏡的構(gòu)造要緊是使用一種特殊的聚光器,在聚光器的下方中央為圓形黑盤所

遮，光僅由周緣進入，使光會聚于載玻片上，并斜照物體，物體經(jīng)斜射照明后，發(fā)出反射光

可進入物鏡，這樣，造成顯微鏡視野黑暗，而其中的物體明亮。如無暗視野顯微鏡時，只需

將明視野顯微鏡上的聚光器取下，換上暗視野聚光器即可；也可在明視野顯微鏡聚光器下面

的濾光鏡支架上放一片星形擋板（stardiaphragm）（圖III-6）構(gòu)成暗視野，這種方法適用

于低倍鏡觀察。

在暗視野中，由于有些活細胞其外表比死細胞明亮，因此暗視野也被用來區(qū)分死、活細

胞，此技術(shù)現(xiàn)已被用于各類酵母細胞的死、活鑒別。止匕外，暗視野顯微鏡關(guān)于觀察嬌弱的微

生物，如梅毒密螺旋體（Treponemapallidum）特別有用。

三、器材

釀酒酵母（Saccharomy-cescerevisiae）；

暗視野顯微鏡，載玻片，蓋玻片，無菌水。

四、操作步驟

1.選厚薄在L0—1.2mm的干凈載玻片一塊，滴上釀酒酵母懸液，加蓋玻片（注意切

勿有氣泡存在）。

2.將聚光鏡光圈調(diào)至1.4。

3.光源的光圈孔調(diào)至最大。

4.在聚光器上放一大滴香柏油，將標本置載物臺上，旋上聚光器使油與載玻片接觸（不

能有氣泡發(fā)生）。

5.用低倍物鏡及7X目鏡進行配光對準物體。調(diào)節(jié)聚光器的高度，首先在載玻片上出

現(xiàn)一個中間有一黑點的光圈，最后為一光亮的光點（圖III-7）,光點愈小愈好，由此點將聚

光器上下移動時均使光點增大。

6.換上所需目鏡與高倍鏡，緩慢上升物鏡進行調(diào)焦，至視野中心出現(xiàn)發(fā)光的樣品。

7.在蓋玻片上滴一滴香柏油，并將油鏡轉(zhuǎn)至應(yīng)在位置調(diào)節(jié)配光，進行觀察。

五、注意事項

1.進行暗視野觀察時，聚光鏡與載玻片之間滴加的香柏油要充滿，否則照明光線于聚

光鏡上面進行全面反射，達不到被檢物體，從而不能得到暗視野照明。

2.在進行暗視野觀察標本前，一定要進行聚光鏡的中心調(diào)節(jié)與調(diào)焦，使焦點與被檢物

體一致。

3.由于暗視野聚光鏡的數(shù)值孔徑都較大（NA=1.2-1.4）,焦點較淺，因此，過厚

被檢物體無法調(diào)在聚光鏡焦點處，通常載玻片厚度為1.0mm左右，蓋玻片厚度宜在0.161nm

下列，同時載玻片、蓋玻片應(yīng)很清潔，無油脂及劃痕，否則都會嚴重地擾亂最終的像。

六、實驗報告

思考題

（1）觀察活細胞的個體形態(tài)，你認為用顯微鏡的明視野好？還是暗視野好？為什么？

（2）你所觀察到的釀酒酵母，在暗視野中能否區(qū)分死、活細胞？

（3）暗視野觀察時，所用的載玻片、蓋玻片有何要求？為什么？

實驗四相差顯微鏡

一、目的要求

1.熟悉相差顯微鏡的基本原理與用途。

2.學習掌握相差顯微鏡的操作技術(shù)。

二、基本原理

暗視野顯微鏡能夠看到活細胞的外部形態(tài)，但是看不清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡不僅能觀

察活細胞的形態(tài)，而且還能看到細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與細胞分裂的連續(xù)過程。

光線通過透明物體如活細菌細胞后，由于受透明物體中密度與折射率不一致的物質(zhì)的影

響，部分光線變成了繞射光，光波的相位發(fā)生變化，而這種相位差不表現(xiàn)為明暗與顏色上的

差異，不能在顯微鏡視野中觀察到。相差顯微鏡就是將通過透明物體的直射光延遲或者提早，

并與繞射光產(chǎn)生干涉，使相位差變?yōu)檎穹?。假如產(chǎn)生的干涉為相長干涉（圖IH-8,R組光

線），則振幅的同相量相加而變大，我們便看到較亮的部分；假如所產(chǎn)生的干涉為相消干涉

時（如圖IH-8,S組光線），則振幅異相量相消而變小，這部分就變得較暗。這樣，變相位

差為振幅差的結(jié)果，使原先透明的物體表現(xiàn)出明顯的明暗差異，對比度增加，能更清晰地觀

察活細胞的細微結(jié)構(gòu)。

相差顯微鏡成像原理與裝置如圖III-9所示。

在普通光學顯微鏡上增加下列四種附件就成為相差顯微鏡：

（1）環(huán)狀光闌

相差顯微鏡的聚光鏡光闌是環(huán)狀光闌。照明光線只能從環(huán)狀的透明區(qū)進入聚光鏡再斜射

到標本上（斜射角度遠小于暗視野聚光鏡）。大小不一致的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤（圖m-10,A）,

安裝于聚光鏡下面，更換放大率不一致的物鏡時，要同時更換與其相應(yīng)的光闌。

（2）相差物鏡（鏡頭上標有PC或者PH字樣）

物鏡的后焦平面上裝有相板，這是相差顯微鏡的要緊裝置。相板上與環(huán)狀光闌相對應(yīng)的

環(huán)狀部分大多數(shù)是涂的汲取膜與推遲相位膜，其他部分完全透明。從標本上射過來的光線,

繞射光部分穿過透明區(qū)；直射光則穿過相板的環(huán)狀部分，光強度減弱，相位也適當改變。通

常所用的相板推遲相位1/4,汲取80%的直射光，這樣，就使直射光與繞射光的強度接近,

而相位差則增大或者減少。由于透明標本內(nèi)部構(gòu)造的折射率不一致，產(chǎn)生繞射光的相位就會

有不一致程度的推遲，繞射光與直射光的干涉作用將相位差變成振幅差。

（3）綠色濾光片

為了獲得良好的相差，最好用單色光線照明，通常選用綠色光線。

（4）合軸調(diào)整望遠鏡

為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上，務(wù)必拔出目鏡，裝上特別的低倍望

遠鏡（圖IIITO,B）,使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)合軸（圖IIIT1）。

三、器材

相差顯微鏡，1.0mm下列載玻片，0.16-0.17mm下列蓋玻片；釀酒酵母水浸片，枯草

芽抱桿菌水浸片。

四、操作步驟

1.將釀酒酵母水浸片置載物臺上，夾好。

2.轉(zhuǎn)動聚光器下面的環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)盤至“0”，并將光圈開到最大。

3.通過普通目鏡與低倍相差物鏡（如10義）調(diào)節(jié)焦距，看清標本。

4.轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使油鏡相差物鏡（90X）對準標本，同時轉(zhuǎn)動環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)盤至40,使

與所用的物鏡相符。

5.用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)焦距，使物像清晰。

6.取下目鏡，換上合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，轉(zhuǎn)動望遠鏡使聚光鏡中的亮環(huán)與物鏡中的暗環(huán)看

清晰。

7.轉(zhuǎn)動聚光鏡左右二側(cè)的調(diào)節(jié)桿，使兩環(huán)重合。

8.取下望遠鏡換上目鏡進行觀察，每更換標本或者改變不一致倍數(shù)的相差物鏡時，都

務(wù)必依上法重新合軸調(diào)節(jié)。

9.換上枯草芽抱桿菌的水浸片進行觀察（務(wù)必先進行合軸調(diào)節(jié)）。

五、實驗報告

1.結(jié)果

繪出你用相差顯微鏡所觀察到的釀酒酵母與枯草芽泡桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.思考題

為什么說相差顯微鏡適于觀察活細胞的細微結(jié)構(gòu)？

實驗五電子顯微鏡

一、目的要求

1.熟悉電子顯微鏡的工作原理。

2.學習并掌握制備電鏡標本的方法。

二、基本原理

1.電子顯微鏡的分辨力與放大率

電子顯微鏡是利用電子流代替光學顯微鏡的光束使物體放大成像而由此得名的。發(fā)射電

子流的電子源部分稱之電子槍，電子槍由發(fā)射電子的“V”形鴇絲及陽極板構(gòu)成，在高真空

中，鴿絲被加熱到白