馬鈴薯黑痣病PCR檢測方法

1馬鈴薯黑痣病菌PCR檢測方法本文件規(guī)定了馬鈴薯黑痣病菌快速檢測方法。本文件適用于馬鈴薯植株、塊莖等組織中馬鈴薯黑痣病菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8855新鮮水果和蔬菜取樣方法3術語和定義下列定義適用于本文件。3.1聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction，PCR是體外快速擴增特定基因或DNA序列的一種技術，它能以極少量的DNA為模版，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。3.2馬鈴薯黑痣病菌中文名稱：立枯絲核菌俗名：馬鈴薯黑痣病菌拉丁學名：RhizoctoniasolaniKühn屬于真菌界（Fungi）、半知菌亞門（Deuteromycotina）、絲孢綱（Hyphomycetes）、無孢目（Agonomycetales）、絲核菌屬（Rhizoctonia）。立枯絲核菌引起馬鈴薯黑痣病，可通過病薯上或留在土壤中的菌核越冬，帶病種薯是遠距離傳播的主要載體。馬鈴薯生長期間病菌從土壤中根系或莖基部傷口侵入，引起發(fā)病。3.3TaqDNA聚合酶是第一個被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，分子量65kD，由Saiki等從溫泉中分離的一株水生噬熱桿菌（thermusaquaticus）中提取獲得。3.4特異性引物是某個基因序列的一部分,由一條正鏈引物和一條反鏈引物組成,在進行PCR擴增時,能從總DNA中特異的擴增出兩條引物之間的序列,從而得到大量該基因的片段或全長。24原理本文件采用聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR）方法檢測馬鈴薯黑痣病菌。其原理是：以馬鈴薯黑痣病菌保守序列設計特異性引物，以基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶的作用下進行PCR擴增，根據(jù)PCR擴增結果判斷該樣品中是否含有目的片段，從而達到鑒定馬鈴薯黑痣病菌的目的。5試劑與材料見附錄A。6主要儀器見附錄B。7操作步驟7.1對照的設立檢測體系以馬鈴薯黑痣病菌的DNA作為陽性對照，以不添加DNA模板的反應體系作為陰性對照；在檢測過程中要同待測樣品一同進行以下操作。7.2樣品制備取馬鈴薯植株或塊莖組織0.1g，現(xiàn)用現(xiàn)取。按照GB/T8855新鮮水果和蔬菜取樣方法進行。7.3馬鈴薯組織樣品DNA提取將樣品置于滅過菌的研缽中，加液氮研磨成粉末，轉至1.5mL離心管。后續(xù)操作參見植物基因組DNA提取試劑盒推薦步驟進行。7.4PCR擴增7.4.1PCR擴增引物上游引物：5’-TTGGTTGTAGCTGGTCTATTT-3’下游引物：5’-TATCACGCTGAGTGGAACCA-3’擴增片段大小為500bp。7.4.2PCR反應體系按照以下順序加入相應試劑到PCR管中，混勻并離心10s，使混合液都沉降到PCR管底。表1PCR擴增反應體系組成水32TaqDNA聚合酶（5U/uL）7.4.3PCR反應程序最后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?瓊脂糖凝膠電泳使用1.5%的瓊脂糖凝膠，按比例混勻DNALoadingBuffer和PCR擴增產(chǎn)物，用2000bpDNAMarker作為分子量標記，進行凝膠電泳。電泳結束后在凝膠成像儀的紫外透射光下觀察，凝膠上是否出現(xiàn)預期大小的特異性DNA條帶，并拍照記錄。9結果9.1試驗成立的條件陽性對照檢測到預期大小的特異性擴增條帶，陰性對照和空白對照沒有檢測到預期大小的特異性擴增條帶。若陽性對照、陰性對照和空白對照同時成立時，則表明試驗有效，否則試驗無效。9.2結果判定若待檢樣品在500bp對應位置出現(xiàn)特異性條帶，則判定樣品為陽性；若待檢樣品在500bp對應位置沒有出現(xiàn)特異性條帶，則判定為陰性。4（資料性）試劑與材料以下所有試劑，除另有規(guī)定外，均使用分析純試劑；水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級水。A.1植物基因組提取。A.2TaqDNA聚合酶（5U/uL）。A.3dNTP混合物（各2.5mmol/L）。A.410×PCR緩沖液（含Mg2+）。A.5無水乙醇。A.6溴化乙錠溶液（10mg/mL）稱取溴化乙錠100mg，加水溶解，定容至10mL。A.7引物緩沖液用水將上、下游引物分別配制成工作濃度為10ng/uL的溶液。A.850×TAE電泳緩沖液。A.91×TAE電泳緩沖液量取50×TAE電泳緩沖液20mL，加水定容至1L。A.101.5%瓊脂糖凝膠稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL的1×TAE電泳緩沖液，微波爐加熱至瓊脂糖融化，帶溶液冷卻至50℃左右時，加入5ul溴化乙錠溶液，搖勻，倒入制膠板中均勻鋪板，凝固后取下梳子，備用。A.112000bpDNAM