PCR反應擴增產物平端連接法實驗詳述_第1頁
PCR反應擴增產物平端連接法實驗詳述_第2頁
PCR反應擴增產物平端連接法實驗詳述_第3頁
PCR反應擴增產物平端連接法實驗詳述_第4頁
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文檔簡介

第第頁PCR反應擴增產物平端連接法實驗詳述實驗原理:實驗步驟:一、PCR反應1.依次混勻下列試劑(1)H二、電泳取10l擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析,檢查反應產物及長度。三、PCR產物的純化擴增的PCR產物如利用T-Vector進行克隆,可直接使用,如用平未端或粘性未端連接,往往需要將產物純化。1.酚/lv仿法(1)取反應產物加100lTE。(2)加等體積lv仿混勻后用微型離心機10000rpm離心15秒,用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次,可除去覆蓋在表面的礦物油。(3)再用酚:lv仿:抽提二次,每次回收上層水相。(4)在水相中加300l95%乙醇,置-20℃下30min沉淀。(5)在小離心機上10000rpm離心10min,吸凈上清液。加入1ml70%乙醇,稍離后,吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7mlddH2.WizardPCRDNA純化系統(tǒng)WizardPCRDNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA,提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產物的純化,試劑包括:50mlWizardPCRDNA純化樹脂、5ml直接提取緩沖液、50支Wizard微型柱。(1)吸取PCR反應液水相放于1.5mleppendorf管中。(2)加100ml直接提取緩沖液,渦旋混勻。(3)加1mlPCRDNA純化樹脂,1分鐘內渦旋混合3次。(4)取一次性注射器,取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。(5)將注射器與微型柱分開,取出注塞,再將注射筒與微型柱相連,加入2ml80%異丙醇,對微型柱進行清洗。(6)取出微型柱置于eppendorf管中,12000g離心20秒,以除去微型柱中的洗液。(7)將微型柱放在一個新eppendorf管中,加50lTE或水,靜止1分鐘后,12000g離心20秒。(8)丟棄微型柱,eppendorf管中的溶液即為純化DNA,存放于4℃或-20℃。四、載體加dT尾1.將1gpUC19用SmaⅠ全酶切。2.在小管中按上述PCR反應,加入各種混合物,除將4l4種dNTP改為4l25mMdTTP。3.加入1l(5U)的TaqDNA聚合酶在72℃下加熱2h。4.按前面三中所述,用酚:lv仿:抽提二次。5.加入2倍體積95%乙醇,在-20℃下沉淀1h。6、離心,用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于10mlddH2O中。五、PCR產物與載體粘末端連接1.在7mlPCR產物中加1ml帶dT尾的pUC質粒。2.加1mlT4DNA連接酶,1ml10連接緩中液,混勻,16℃連接過夜。3.取5ml連接產物轉化感受態(tài)細胞并篩選重組子。六、PCR產物3'突出端切平及平末端連接1.在50ml的PCR產物中,直接加0.5mlT4DNA聚合酶混勻。2.37℃反應10分鐘后,70℃滅活10分鐘。3.用酚:lv仿抽提2次。4.乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于7mlddH注意事項:1.PCR反應液可直接用于連接,但最好對PCR產物純化后進行連接,既能去掉dNTP與ATP競爭連接酶又能濃縮PCR產物。2.PCR非常靈敏,操作應盡可能在無菌操作臺中進行。3.吸頭、離心管應高壓滅菌,每次吸頭用畢應更換,不要互相污染試劑。4.加試劑前,應短促離心10秒鐘,然后再打開管蓋,以防手套污染試劑及管壁上的試劑

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