3紫外-可見分光光度法

模塊三

紫外-可見分光光度法項目1基本原理項目2紫外-可見吸收光譜和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系項目3紫外-可見分光光度計

項目4測量條件的選擇項目5定性和定量分析方法知識一紫外-可見吸收光譜的概述知識二紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生知識三光吸收定律知識四偏離Beer定律的因素項目1基本原理知識一紫外-可見吸收光譜的概述

利用紫外-可見吸收光譜對物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析的方法稱為紫外-可見分光光度法（ultravioletandvisiblespectrophotometry，UV-vis)。紫外-可見分光光度法一般準(zhǔn)確度約為0.5％，采用性能較好的儀器其測定準(zhǔn)確度可達(dá)0.2％，檢測限一般可達(dá)10-4-10-6g/mL；既可以進(jìn)行單一組分和多組分樣品的定量分析，也可以根據(jù)吸收光譜的特性，與其他分析方法配合，用以推斷有機化合物的分子結(jié)構(gòu)，鑒別結(jié)構(gòu)不同的化合物。由于本法準(zhǔn)確靈敏、儀器相對比較簡單、適用于大多數(shù)有共軛結(jié)構(gòu)的化合物，在化學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域有著極其廣泛的應(yīng)用。知識二紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生

紫外-可見吸收光譜是基于分子內(nèi)的電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜，屬于帶狀光譜，這是由于吸收紫外光的分子除了有電子能級的躍遷外，還伴隨著分子振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷（見圖3-1）。

紫外-可見光區(qū)的波長一般用nm表示，可分為真空紫外光區(qū)（<190nm）、近紫外光區(qū)（200~380nm）和可見光區(qū)（380~780nm）三個區(qū)間，常規(guī)分析僅限于使用近紫外光和可見光。圖3-1電磁波吸收和分子能級示意圖知識三光吸收定律

早在18世紀(jì)Borguer和Lambert研究了物質(zhì)對光的吸收和吸收介質(zhì)厚度的關(guān)系。19世紀(jì)Beer確定了光吸收和溶液濃度與液層厚度之間的關(guān)系，建立了光吸收的基本定律，習(xí)慣上稱為Lambert-Beer定律。其中Beer定律說明吸光度與濃度的關(guān)系，Lambert定律說明吸光度與厚度的關(guān)系。

設(shè)一束強度為I0的平行單色光束垂直通過厚度為L的均勻介質(zhì)，則一部分光被介質(zhì)中的吸光分子吸收，使光的強度由I0降到I，若吸光分子濃度為c，則Lambert-Beer定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式可表示為

上式中，E在一定條件下為常數(shù)，稱為吸光系數(shù)（absorptivity）定義I/I0是透光率(transmitance，T常用百分?jǐn)?shù)表示，以A代表-lgT，稱為吸光度（absorbance)，

則有A=-lgT=Ecl或T=10-A=10-Ecl

說明單色光通過吸光介質(zhì)后，透光率T與濃度c或厚度L之間的關(guān)系是指數(shù)函數(shù)的關(guān)系。例如，濃度增大一倍時，透光率從T降至T2。若以透光率的負(fù)對數(shù)為吸光度A，則吸光度與濃度或厚度之間是簡單的正比關(guān)系。知識四偏離Beer定律的因素

按照Beer定律，濃度c與吸光度A之間的關(guān)系應(yīng)該是一條通過原點的直線。事實上，往往容易發(fā)生偏離直線的現(xiàn)象而引人誤差。導(dǎo)致偏離的主要原因有化學(xué)方面和光學(xué)方面的因素。圖3-2比爾定律的偏離情況1.化學(xué)因素

溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合與溶劑間的作用等原因而發(fā)生偏離Beer。

由化學(xué)因素引起的偏離，有時可控制溶液條件設(shè)法減免。上例若在強酸性溶液中測定Cr2O72-，或在強堿性溶液中測定CrO42-都可避免偏離現(xiàn)象。2.光學(xué)因素

分為非單色、雜散光、散射光和反射光、非平行光四種情況。知識一躍遷類型知識二光譜特征及有關(guān)術(shù)語知識三吸收帶及其與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系項目2紫外-可見吸收光譜和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系知識1躍遷類型

根據(jù)分子軌道理論，分子中的價電子主要有處于σ軌道上的σ電子，π軌道上的π電子和未參與成鍵而仍處于原子軌道中的n電子（亦稱p電子）。電子圍繞分子或原子運動的概率分布叫做軌道。軌道不同，電子所具有的能量也不同。分子軌道可以認(rèn)為是當(dāng)兩個原子靠近而結(jié)合成分子時，兩個原子的原子軌道可以線性組合生成兩個分子軌道。其中一個具有低能量稱為成鍵軌道，另一個具有高能量的稱為反鍵軌道。

如圖3-3所示，兩個氫原子的s電子結(jié)合并以。鍵組成氫分子，分子軌道具有σ成鍵軌道和σ*反鍵軌道。同樣兩個原子的p軌道平行地重疊起來，組成兩個分子軌道時，該分子軌道稱π成鍵軌道和π*反鍵軌道。π鍵的電子重疊比σ鍵的電子重疊少，鍵能弱，躍遷所需的能量低。分子中n電子的能級，基本上保持原來原子狀態(tài)的能級，稱非鍵軌道。比成鍵軌道所處能級高，比反鍵軌道能級低。圖3-4顯示，分子中不同軌道的價電子具有不同能量，處于低能級的價電子吸收一定能量后，就會躍遷到較高能級。圖3-3H2的成鍵和反鍵軌道

圖3-4分子中價電子能級躍遷示意圖

在紫外和可見光區(qū)范圍內(nèi)，有機化合物的吸收光譜主要是由σ-σ*、π-π*、n-σ*、n-π*過及電荷遷移躍遷產(chǎn)生。知識2光譜特征及有關(guān)術(shù)語

紫外-可見吸收光譜是分子中的價電子有選擇地吸收紫外-可見光產(chǎn)生的吸收光譜。吸收光譜又稱吸收曲線，是以波長λ(nm)為橫坐標(biāo)，以吸光度A（或透光率T）為縱坐標(biāo)所描繪的曲線，如圖3-5所示。

吸收光譜的特征一般用下列術(shù)語進(jìn)行描述：

吸收峰、谷、肩峰末端吸收、生色團(tuán)、助色團(tuán)、紅移、藍(lán)（紫）移、增色效應(yīng)和減色效應(yīng)、強帶和弱帶圖3-5吸收光譜示意圖知識一儀器的構(gòu)成知識二紫外-可見分光光度計的類型項目3紫外-可見分光光度計知識1儀器的構(gòu)成

各種型號的紫外—可見分光光度計，就其基本結(jié)構(gòu)來說，都是由5個部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器和信號指示系統(tǒng)。

光源→單色器→吸收池→檢測器→信號指系統(tǒng)1．光源

對光源的基本要求是在儀器操作所需的光譜區(qū)域內(nèi)能夠發(fā)射連續(xù)輻射，有足夠的輻射強度和良好的穩(wěn)定性，而且輻射能量隨波長的變化盡可能小。紫外-可見分光光度計中常用的光源有熱輻射光源和氣體放電光源2類：熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢絲燈和碘鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。2.單色器

單色器是能從光源的復(fù)合光中分出單色光的光學(xué)裝置。單色器一般由入射狹縫、準(zhǔn)光氣（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成（如圖3-7所示）。其核心部分是色散元件，起分光的作用，主要有棱鏡和光柵2種。（a）棱鏡型

(b)光柵型3．吸收池

吸收池用于盛放分析試樣，一般有石英和玻璃材料2種。石英池用于可見光區(qū)及紫外光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見光區(qū)。為減少光的反射損失，吸收池的光學(xué)面必須完全垂直于光束方向。在高精度的分析測定中（紫外光區(qū)尤其重要），同一套吸收池的性能要基本一致。因為吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程長度等對分析結(jié)果都有影響。4．檢測器

檢器的功能是檢測光信號、測量單色光透過溶液后光強度變化的一種裝置。常用的檢器有光電池、光電管和光電倍增管等。它們通過光電效應(yīng)將照射到檢測器上的光信號轉(zhuǎn)變成電信號。對檢測器的要求是：在測定的光譜范圍內(nèi)具有高的靈敏度；對輻射能量的響應(yīng)時間短，線性關(guān)系好；對不同波長的輻射響應(yīng)均相同，且可靠；噪聲水平低、穩(wěn)定性好等。5.信號指示系統(tǒng)

它的作用是放大信號并以適當(dāng)方式指示或記錄下來。常用的信號指示裝置有直讀檢流計、電位調(diào)節(jié)指零裝置以及數(shù)字顯示或自動記錄裝置等。很多型號的分光光度計裝配有微處理機，一方面可對分光光度計進(jìn)行操作控制，另一方面可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。知識2紫外-可見分光光度計的類型

紫外-可見分光光度計的類型很多，但可歸納為3種類型，即單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。知識一入射光波長的選擇知識二參比溶液的選擇知識三吸光度讀數(shù)范圍的選擇項目4測量條件的選擇知識1入射光波長的選擇

入射光波長的選擇應(yīng)根據(jù)吸收曲線，通常選擇最大吸收波長λmax作為入射光波長。因為在λmax處K值最大，測定的靈敏度高，同時在λmax附近，吸光度變化不大，不會造成對吸收定律的偏離，因而測定的準(zhǔn)確度也較高。知識2參比溶液的選擇

吸光光度法測定吸光度時，是將待測溶液盛放于比色皿內(nèi)，放入分光光度計光路中，測量入射光的減弱程度。由于比色皿對入射光的反射、吸收，以及溶劑、試劑等對入射光的吸收也會飛光強度減弱，為了使光強度減弱僅與待測組分的濃度有關(guān)，需要選擇合適組成的參比溶液，將其放入比色皿內(nèi)并置于光路中，調(diào)節(jié)儀器，使T=100%（A=0），然后再測定盛放于另一相同規(guī)格比色皿中的試液吸光度，這樣就消除了由于比色皿、溶劑及試劑等對入射光的反射和吸收帶來的誤差。選擇參比溶液的原則是：使試液的吸光度真正反映待測組分的濃度。知識一定性分析方法知識二定量分析方法項目5定性和定量分析方法知識1定性分析方法

一、定性鑒別定性鑒別主要是依據(jù)有機化合物的光譜特征，如光譜形狀、吸收峰數(shù)目、吸收長及相應(yīng)的吸光系數(shù)值等對樣品進(jìn)行定性鑒別。（1）對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)最常用于鑒別的光譜特征數(shù)據(jù)是吸收峰和谷所在波長(λmax和λmin)；λmax處的或ε值也常用于化合物的定性鑒別。（2）對比吸光度的比值有兩個或更多吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰處(或峰與谷)測得吸光度的比值。（3）對比吸收光譜的一致性將試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)品配制成相同濃度的溶液，在同一條件下分別描繪吸收光譜，核對其一致性，也可利用文獻(xiàn)所載的標(biāo)準(zhǔn)譜進(jìn)行核對。若光譜曲線有差異則試樣與標(biāo)準(zhǔn)品并非同一物。知識2定量分析方法（一）目視比色法用睛觀察、比較待測物質(zhì)溶液顏色的色度以測定其含量的方法，稱為目比色法。常用的目視比色法是標(biāo)準(zhǔn)系列法。這種方法要使用一套由同種玻璃材料制成的形狀、大小相同的平底玻璃管（亦稱比色管），依次分別在比色管中加入不同量的待測組分標(biāo)準(zhǔn)溶和一定量的顯色劑及其他輔助試劑，并用溶劑稀釋到相同體積，配成一套顏色逐漸加深的標(biāo)準(zhǔn)色階。將一定量試液在相同條件下顯色、定容，然后從管口上方垂直向下觀察顏色深淺，將待試系列色階比較，顏色深淺相同者，其待測物質(zhì)含量亦相同。（二）分光光度法1.單一組分的定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線法、比較法、示差分光光度法2.多組分的定量分析當(dāng)試液中共存組分較多，吸收曲線可能相互重疊而發(fā)生干擾時，可通過實驗測量和計算下列解析式，求得各組分的含量，不必分離。實驗部分任務(wù)一鋼中硅含量的測定一、目的1.熟悉鋼鐵試樣的分解方法和硅標(biāo)準(zhǔn)液的配制方法。2.掌握雜多酸的生成條件極其在分光光度法中的應(yīng)用。二、實驗原理鋼中的硅能增加鋼的耐熱性、耐酸性、抗張力性，硅還是有效的脫氧劑、硅在鋼中主要以FeSi形態(tài)存在。鋼樣以稀酸溶解后，硅呈可溶性的正硅酸，然后在一定酸度下與鉬酸銨生成硅鉬雜多酸，最后在草酸存在下用Fe2+使之還原成硅鉬藍(lán)進(jìn)行光度比色測定、有色離子的干擾用空白抵消。三、實驗步驟1.試樣的溶解稱取試樣0.lg，精確至0.0001g，置于100mL燒杯中，加入15mL1:3HNO3（若為合金鋼，可改用混合酸），低溫加熱30min左右，使試樣溶解，此時溶液主體呈黃色。滴加高錳酸鉀溶液以氧化碳化物及偏磷酸，待MnO2生成后，再多加幾滴，然后用亞硝酸鈉溶液還原過量KMnO4及生成的MnO2，使溶液呈清亮狀態(tài)，煮沸驅(qū)盡氮氧化物，冷卻，定量轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻。分別取此溶液10.0mL于兩個50mL容量瓶中，按下列手續(xù)分別處理：

顯色液：準(zhǔn)確地加人5mL鉬酸銨溶液，用少量水沖洗瓶壁，于沸水浴上加熱30s以生成硅鉬黃，加10mL草酸和10mL硫酸亞鐵銨溶液，冷卻，稀釋至刻度，搖勻。空白液：加人10mL草酸溶液，5mL鉬酸銨溶液，10mL硫酸亞鐵銨溶液，稀釋至刻度，搖勻。用2cm比色皿，在分光光度計上，于680nm波長處，以空白液為參比，測量顯色液吸光度。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制稱取純鐵粉（<0.002％）0.1g，精確至0.0001g，于100mL燒杯中，按照溶解試樣方法溶解，制備成底液。吸取底液5.0mL，分別置于5個50mL容量瓶中，依次加人硅標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.50、1.50、2.50和3.50mL，補加水到總體積為10mL，按上述顯色步驟進(jìn)行顯色，測量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。任務(wù)二工業(yè)廢水中微量揮發(fā)酚的測定一、目的1.了解工業(yè)廢水中酚的分離方法。2.掌握用分光光度測定微量揮發(fā)酚的原理和方法。二、原理在煉油、煉焦、煤氣洗滌和某些化工廠的廢水中一般都含有酚類化合物，酚的水溶液易被人體皮膚吸收，酚蒸氣由呼吸道吸入會引起中毒，嚴(yán)重危害人體健康．水體中含酚在1~10mg/L時，會使魚類中毒甚至死亡，含酚量大于100mg/L的廢水用于灌溉農(nóng)田，會導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)或枯死，故水中酚的測定具有重大意義，采用預(yù)蒸餾將酚蒸出，測定的是揮發(fā)酚．含酚量在0.1-1.0mg/L的廢水樣，可采用4-氨基安替比林為顯色劑，在pH值為10.0的酸度條件下，以鐵氰化鉀為氧化劑，酚與顯色劑作用生成橙紅色吲哚酚安替比林染料，可用分光光度法測定。生成的物質(zhì)在冰中能穩(wěn)定30min。如用氯仿萃取，可使此染料穩(wěn)定4h，并能提高測定靈敏度。當(dāng)水樣中存在氧化劑、還原劑、油類及某些金屬離子時，均應(yīng)設(shè)法消除并進(jìn)行蒸餾。如對游離氯可加人硫酸亞鐵還原；對硫化物可用硫酸銅使之沉淀或酸化使其變成硫化氫逸出；對油類可采取溶劑萃取清除。進(jìn)一步蒸餾，既可分離出揮發(fā)酚，又能避免顏色、渾濁和金屬離子等干擾。三、步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制于50mL容量瓶中分別加人0.00、0.50、1.00、3.00、5.00、10.00mL標(biāo)準(zhǔn)酚溶液（含酚0.010mg/mL左右），加入2.5mLNH3-NH4Cl緩沖然液，1.0mL4-氨基安替比林溶液，混勻，加人1.0mL鐵氰化鉀溶液，混勻，加水稀釋至刻度、放置10min，以試劑溶液為參比液，于510nm，用1cm比色皿測定吸光度A值。2.廢水試樣的測定量取250mL廢水樣于玻璃蒸餾-冷凝器內(nèi)，加入5mLCuSO4溶液，用H3PO4溶液調(diào)節(jié)溶液pH≤4.0，放入數(shù)粒玻璃珠，蒸餾，以250mL量筒收集餾出液，待餾出液為220~230mL時停止加熱。待蒸餾瓶內(nèi)液面靜止后，向其中加25mL蒸餾水，再蒸餾至餾出液的液面達(dá)量筒250mL的標(biāo)線為止。移取適量的餾出液，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色，然后測定A值。計算揮發(fā)酚的質(zhì)量濃度，用苯酚的形式來表征，單位為mg/L。任務(wù)三鄰二氮菲分光光度法測定水中微量鐵一、實驗?zāi)康?.初步掌握常見型號可見分光光度計的使用方法。2.掌握吸收光譜曲線的測繪方法和測定波長的選擇。3.掌握鄰二氮菲分光光度法測定水中微量鐵的基本原理、操作方法和數(shù)據(jù)處理二、實驗原理

鄰二氮菲（簡寫為phen)又稱1,10-鄰二氮菲，或鄰菲啰啉。它與Fe2+在pH為2~9的溶液中均可形成穩(wěn)定的橘紅色配合物[Fe(phen)3]2+，其lgK穩(wěn)=21.3（20℃）。最大吸收波長λmax=510nm，摩爾吸光系數(shù)ε510=1.1×104L/(mol·cm)因此測定的靈敏度高，可以利用這一方法測定水中的微量鐵。這種方法也是國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的測定化工產(chǎn)品中雜質(zhì)鐵的通用方法。測定時，可用醋酸鹽緩沖溶液控制溶液酸度在pH=5左右，酸度過高，反應(yīng)進(jìn)行較慢；酸度過低，則Fe2+水解，影響顯色和準(zhǔn)確度。水中的Fe3+可以先用鹽酸羥胺或抗壞血酸還原成二價后再進(jìn)行測定。三、實驗步驟1．準(zhǔn)備工作（1）清洗容量瓶，移液管及需用的的玻璃器皿。（2）配制鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液和其他輔助試劑。（3）按儀器使用說明書檢查儀器，預(yù)熱20min，并調(diào)試至工作。（4）檢查比色皿的配套性。取4只潔凈的2cm玻璃比色皿，裝入蒸餾水至2/3處，置于比色皿架內(nèi)，在60nm處，以第一個比色皿為參比，調(diào)節(jié)τ為100％，測量其他各比色皿的透射比，透射比的偏差小于0.5%的比色皿可配成一套使用。記錄參考格式如下：比色皿配套性檢查：（1）τ=100%，（2）τ=%，可以配套使用。2．測繪吸收曲線，選擇測定波長取2只潔凈的50mL容量瓶，移取10.00μg/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)液5.00mL于其中一個容量瓶中，然后在兩容量瓶中各加入1mL100g/L鹽酸羥胺溶液，平搖搖勻后再分別加人2mL1.5g/L二氮菲溶液、5mLNaAc溶液，用蒸餾水稀釋至標(biāo)線，搖勻。用2cm比色皿，以未加鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液的試劑空白為參比，在440~540nm間，每隔10nm測量一次吸光度值（注意每改變一次波長，都要重新調(diào)節(jié)儀器零點和參比溶液的τ=100％）。在峰值附近每隔2nm測量一次。以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸收曲線，確定λmax作為測定波長。要求總測量點不少于13個點。任務(wù)四紫外分光光度法測定苯甲酸含量一、實驗?zāi)康?.初步掌握T6新世紀(jì)型（或其他型號）紫外-可見分光光度計的使用方法2.熟練掌握吸收光譜曲線的測繪方法和測定波長的選擇；3.掌握苯甲酸的紫外吸收光譜分析基本原理、操作方法和數(shù)據(jù)處理。二、實驗原理利用紫外吸收光譜進(jìn)行定性的方法是：將未知試樣和標(biāo)準(zhǔn)樣在相同的溶劑中，配制成大致相同的濃度，在相同條件下，分別繪制它們的紫外吸收光譜曲線，兩者進(jìn)行比較，如果兩光譜圖形狀相似，λmax和max相同，則可初步判斷是同一物質(zhì)。苯甲酸會產(chǎn)生π-π*躍遷和n-π*躍遷，在227nm處有較強的吸收?？捎么瞬ㄩL作為測量波長，用工作曲線法定量。三、實驗步驟1.準(zhǔn)備工作（1）清洗容量瓶、移液管及需用的玻璃器皿。（2）配制苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。（3）按儀器使用說明書檢查儀器，預(yù)熱20min，并調(diào)試至工作狀態(tài)。（4）檢查比色皿的配套性。取3只潔凈的1cm石英比色皿，裝人蒸餾水至2/3處，置于比色皿架內(nèi)，在220nm處以第一個比色皿為參比，調(diào)節(jié)為100％，測量其他各比色皿的透射比，透射比的偏差小于0.5％的比色皿可配成一套使用。記錄參考格式如下：比色皿配套性檢查：（1）τ=100％，（2）τ=

%可以配套使用2.配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和未知試液準(zhǔn)確移取0.1mg/mL苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、4.00ml、6.00mL、8.00mL、10.00mL于7個潔凈的100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，搖勻。得測定用第一至第七份標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。準(zhǔn)移取苯甲酸未知液10.00mL于潔凈的100mL容量瓶中，用水稀釋定容，搖勻。得測定用苯甲酸未知試液。3.測繪吸收曲線，選擇測定波長