抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)模板

抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作

規(guī)程(SOP)

抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

概述:

抗腫瘤藥物是指能夠直接殺傷或抑制腫瘤

細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的一類藥物，作用機(jī)制包括抑制

腫瘤細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)的合成、干擾大分子物質(zhì)

代謝、干擾微管系統(tǒng)、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶等。

本操作規(guī)程包括與抗腫瘤藥物申請(qǐng)臨床試

驗(yàn)和申請(qǐng)上市有關(guān)的非臨床有效性和安全性研

究的內(nèi)容，其中著力強(qiáng)調(diào)非臨床有效性和安全性

之間的關(guān)聯(lián)性，以及非臨床研究和臨床試驗(yàn)之間

的關(guān)聯(lián)性。旨在一方面為抗腫瘤藥物的非臨床研

究提供技術(shù)參考；另一方面，通過技術(shù)要求引導(dǎo)

科學(xué)有序的研發(fā)過程，使國(guó)內(nèi)此類藥物的研發(fā)更

趨規(guī)范和合理。

本操作規(guī)程僅代表當(dāng)前對(duì)抗腫瘤藥物非臨

床研究的一般性認(rèn)識(shí)。具體藥物的非臨床研究應(yīng)

在本指導(dǎo)原則的基礎(chǔ)上，根據(jù)藥物的自身特點(diǎn)制

訂研究方案。

研究目的：

建立一套包括抗腫瘤藥物體內(nèi)作用的藥效

學(xué)研究和評(píng)價(jià)體系及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程以及

抗腫瘤藥物安全性和作用新機(jī)制的研究。

①有效性研究

抗腫瘤藥物有效性研究的目的主要在于探

索受試物的作用機(jī)制、作用強(qiáng)度、抗瘤譜等，為

之后的安全性評(píng)價(jià)以及臨床試驗(yàn)中適應(yīng)癥、給藥

方案的選擇提參考信息。

②安全性評(píng)價(jià)

安全性評(píng)價(jià)的目的主要包括：（1）估算I期

臨床試驗(yàn)的起始劑量；（2）預(yù)測(cè)藥物的毒性靶

器官或靶組織；（3）預(yù)測(cè)藥物毒性的性質(zhì)、程

度和可逆性；（4）為臨床試驗(yàn)方案的制訂提供

參考。

研究計(jì)劃：

（a）小鼠急性毒性測(cè)試

按照急性毒性測(cè)試的常規(guī)方法，選用昆

明種小鼠，通過腹腔注射方式給藥，測(cè)定體外抗

腫瘤活性突出的化合物的半數(shù)致死量（LDG,

參考給藥小鼠體重變化情況，評(píng)價(jià)化合物的急性

毒性，并確定小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)試的給藥劑

量。

（b）小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)試

根據(jù)動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法，選用昆明種小鼠，皮下接種

肉瘤S180或肺癌H22瘤株，選擇體外活性突出且急性毒性較低的化合物，設(shè)定

合適的劑量通過腹腔注射方式給藥，以臨床常用抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺作為陽性對(duì)

照藥物，測(cè)定腫瘤生長(zhǎng)抑制作為體內(nèi)活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

(C)專利保護(hù)范圍內(nèi)的化合物的繼續(xù)合成

申請(qǐng)保護(hù)范圍較大的專利，合成部分可能

具有良好活性的新的化合物，拓展研究范圍，發(fā)

現(xiàn)活性更強(qiáng)的化合物，并申請(qǐng)新的發(fā)明專利。并

可針對(duì)具體化合物申請(qǐng)從屬專利，延長(zhǎng)高活性化

合物的保護(hù)期限。

(d)體外抗腫瘤活性的廣泛篩選

采用MTT法或臺(tái)盼藍(lán)染色法，測(cè)定化合

物對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性，確定化

合物在不同瘤株間抗腫瘤活性的選擇性，為裸鼠

模型實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

(e)抗腫瘤作用機(jī)理的深入研究

根據(jù)抗腫瘤(f)人癌裸鼠移植瘤模型實(shí)

驗(yàn)活性化合物作用機(jī)理特征，選用微管蛋白聚合

等實(shí)驗(yàn)從分子水平確認(rèn)化合物的作用機(jī)理；利用

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞探討化合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞

骨架的影響及誘導(dǎo)凋亡的途經(jīng)，從細(xì)胞水平上闡

明化合物的作用機(jī)理。

根據(jù)抗腫瘤新藥審批辦法的要求，采用

裸小鼠皮下接種模型和/或原位移植瘤模型，以

相對(duì)腫瘤增值率和生存時(shí)間為指標(biāo)，確定化合物

的抗腫瘤活性。

(g)動(dòng)物體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

選擇在人癌裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中活性

良好的化合物，開展動(dòng)物體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)

驗(yàn)，考查化合物的吸收、分布、代謝、排泄性質(zhì)。

(h)動(dòng)物亞急性，長(zhǎng)毒實(shí)驗(yàn)

根據(jù)抗腫瘤新藥審批辦法的要求，測(cè)定

動(dòng)物亞急性、長(zhǎng)毒性質(zhì)，進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)。

基本方法：

①小白鼠的灌胃法

以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌

胃器。灌胃器先從小白鼠口角插入口腔內(nèi)，然后

沿著上顆壁輕輕插入食管，稍感有阻力時(shí)(大約

灌胃管插入1/2,相當(dāng)于食管過膈肌的部位)，

即可推進(jìn)注射器，進(jìn)行灌胃(圖1)。若注射器

推進(jìn)困難，應(yīng)重插。若灌胃器誤插入氣管給藥，

可致小白鼠死亡。注藥后輕輕抽出灌胃管。。

②小白鼠皮下注射法

通常在其背部皮下注射。將其皮膚拉起，注

射針刺入皮下，把針尖輕輕左右擺動(dòng)，易擺動(dòng)表

示已刺入皮下，然后注射藥液。拔針時(shí)，以手指

捏住針刺部位，以防止藥液外漏（圖2）。。

③小白鼠靜脈注射法

一般采用尾靜脈注射法。事先將小白鼠或大

白鼠置于固定的筒內(nèi)或鐵絲罩內(nèi)，或扣于燒杯

內(nèi)，使其尾巴露出（圖3）。將尾置于45-50C

的溫水中浸泡或用75%的酒精棉球擦之，以使

血管擴(kuò)張。然后，選擇尾巴左、右兩側(cè)靜脈進(jìn)行

注射。注射時(shí)若出現(xiàn)隆起的白色皮丘，說明藥物

未注入血管。這時(shí)，注射器應(yīng)向尾根部位移動(dòng)，

重新注射。。

圖3小白鼠尾靜脈注射法

④小白鼠腹腔注射法

以左手捉持小白鼠，讓其腹部向上，右手將

注射器針頭刺入皮膚，刺入部位距離下腹部腹白

線稍向左或右的位置（圖4）。向前推進(jìn)注射器

3-5mm?接著使注射針與腹部皮膚面呈45°刺

入小白鼠的腹肌，繼續(xù)向前刺入，針頭通過腹肌

進(jìn)入腹腔后阻力消失,這時(shí)即可慢慢注入藥液。O

⑤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)記

實(shí)驗(yàn)用較大動(dòng)物如兔、貓、犬等可用特制的

號(hào)碼牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠，可

用黃色苦味酸（3%-5%）涂于毛上標(biāo)號(hào)。其編號(hào)

方法無統(tǒng)一規(guī)定，以下方法可供參考。

如給小鼠標(biāo)記-10號(hào),可將小鼠背部分前肢、

腰部、后肢，按左、中、右分為九個(gè)區(qū)，從右到

左標(biāo)記「9號(hào)，第10號(hào)不標(biāo)記（圖5a）。如給

小鼠標(biāo)記1-20號(hào)，則（圖b）。

1號(hào)-----右前肢11號(hào)------腰

部及右前肢

2號(hào)-----左前肢12號(hào)------腰部

及左前肢

3號(hào)-----左后肢13號(hào)------腰

部及左后肢

4號(hào)-----右后肢14號(hào)------腰

部及右后肢

5號(hào)-----頭部15號(hào)------腰

部及頭部

6號(hào)-----頭部及右前肢16號(hào)------腰、

頭部及右前肢

7號(hào)-----頭部及左前肢17號(hào)------腰、

頭部及左前肢

8號(hào)-----頭部及左后肢18號(hào)------腰、

頭部及左后肢

9號(hào)-----頭部及右后肢19號(hào)------腰、

頭部及右后肢

10號(hào)-----腰部（背中間20號(hào)------尾

根部

、大鼠皮毛標(biāo)記編號(hào)法

(a)小鼠急性毒性測(cè)試

目的：

測(cè)定LDso了解受試物的毒性強(qiáng)度、性質(zhì)和

可能的靶器官，為進(jìn)一步進(jìn)行毒性試驗(yàn)的劑量和

毒性觀察指標(biāo)的選擇提供依據(jù)，并根據(jù)LD50進(jìn)

行毒性分級(jí)。

結(jié)果判定：

①如LD50小于人的可能攝入量的100倍，則

放棄該受試物。如LD50大于或等于100倍者，

則可考慮進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)。

②如動(dòng)物未出現(xiàn)死亡的劑量大于或等于

lOg/kgBW(涵蓋人體推薦量的100倍)，則可

進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)。

③對(duì)人的可能攝入量較大和其它一些特殊原

料，按最大耐受量法給予最大劑量動(dòng)物未出現(xiàn)死

亡，也可進(jìn)入下一階段毒理學(xué)試驗(yàn)。

范圍：

本方法規(guī)定了急性毒性試驗(yàn)的基本技術(shù)要求。

術(shù)語和定義：

下列術(shù)語和定義適用于本方法。

①半數(shù)致死量(LD50)是經(jīng)口給予受試物后，預(yù)

期能夠引起動(dòng)物死亡率為50%的單一受試物劑

量，該劑量為經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得出的估計(jì)值。其單位是

每公斤體重所攝入受試物質(zhì)的毫克數(shù)、克數(shù)或毫

升數(shù)，即mg/kgBW、g/kgBW、mL/kgBWo

②最大耐受劑量法(MTD):用最大使用濃度和最

大灌胃容量給予2。只動(dòng)物后，連續(xù)觀察7.14天,

未見任何動(dòng)物死亡，則MTD大于**g/kgBWo

原理

經(jīng)口一次性給予或24h內(nèi)多次給予受試物

后，在短時(shí)間內(nèi)觀察動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，包

括致死的和非致死的指標(biāo)參數(shù)，致死劑量通常用

半數(shù)致死劑量LD50來表示。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

一般均分別用兩種性別的成年小鼠或大鼠。小

鼠體重為18.22g,大鼠體重為180-220g。如對(duì)

受試物的毒性已有所了解，還應(yīng)選擇對(duì)其敏感

的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，如對(duì)黃曲霉素選擇

雛鴨。動(dòng)物購買后適應(yīng)環(huán)境3-5天。

操作步驟

①受試物的處理：

受試物應(yīng)溶解或懸浮于適宜的介質(zhì)中。一般采

用水或食用植物油作溶劑，能夠考慮用竣甲基

纖維素、明膠、淀粉等配成混懸液；不能配制

成混懸液時(shí)，可配制成其它形式（如糊狀物

等）。必要時(shí)可采用二甲基亞碉。但不能采用

具有明顯毒性的有機(jī)化學(xué)溶劑。如采用有毒性

的溶劑應(yīng)單設(shè)溶劑對(duì)照組觀察。

②受試物的給予

途徑:經(jīng)口。

試驗(yàn)前空腹:動(dòng)物應(yīng)隔夜空腹（一般禁食16h

左右，不限制飲水）。

容量:各劑量組的灌胃容量相同（ml/kg

BW）,小鼠常用容量為20mL/kgBW；大鼠常

用容量為10ml/kgBWo

方式:一般一次性給予受試物O也可一日內(nèi)多

次給予（每次間隔4?6h,24內(nèi)不超過3次，盡

可能達(dá)到最大劑量，合并作為一次劑量計(jì)算）。

常用的急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

霍恩氏（Horn）法

預(yù)試驗(yàn):可根據(jù)受試物的性質(zhì)和已知資料，

選用下述方法:、1和10g/kgBW的劑量，各以2.3

只動(dòng)物預(yù)試。根據(jù)24內(nèi)死亡情況，估計(jì)LD50

的可能范圍，確定正式試驗(yàn)的劑量。也可簡(jiǎn)單地

采用一個(gè)劑量，如215mg/kgBW,用5只動(dòng)物

預(yù)試。觀察24h內(nèi)動(dòng)物的中毒表現(xiàn)。如癥狀嚴(yán)重,

估計(jì)多數(shù)動(dòng)物可能死亡，即可采用低于

215mg/kgBW的劑量系列，反之癥狀較輕，則

可采用高于此劑量的劑量系列。如有相應(yīng)的文獻(xiàn)

資料時(shí)可不進(jìn)行預(yù)試。

動(dòng)物數(shù):一般每組用5只。

常用劑量系列：

X10lt=O,±l,±2,±3

XIOtt=0,±l,±2,土3為小，所以結(jié)果

較為精確。一般試驗(yàn)時(shí)，可根據(jù)上述劑量系列設(shè)

計(jì)）個(gè)組，即較原來的方法在最低劑量組以下或

最高劑量組以上各增設(shè)一組，這樣在查表時(shí)容易

得出結(jié)果。

正式試驗(yàn)：

將動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)觀察3-5天，使其

適應(yīng)環(huán)境，證明其確系健康動(dòng)物后，進(jìn)行隨機(jī)分

組。給予受試物后一般觀察7或14天，若給予

后的第4天繼續(xù)有死亡時(shí)，需觀察14天，必要

時(shí)延長(zhǎng)到28天。記錄死亡數(shù)，查表求得LD5o,

并記錄死亡時(shí)間及中毒表現(xiàn)等。

該方法的優(yōu)缺點(diǎn):優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行，節(jié)省動(dòng)

物；缺點(diǎn)是所得LD50的可信限范圍較大，不夠

精確。但經(jīng)多年來的實(shí)際應(yīng)用與驗(yàn)證，同一受試

物與寇氏法所得結(jié)果極為相近。因此對(duì)其測(cè)定的

結(jié)果應(yīng)認(rèn)為是可信與有效的。

最大耐受量試驗(yàn)：

適宜條件:有關(guān)資料顯示毒性極小的或未顯

示毒性的受試物，給予動(dòng)物最大使用濃度和最大

灌胃容量的受試物時(shí)，仍不出現(xiàn)死亡。

動(dòng)物:至少雌、雄各10只。

劑量:受試物最大使用濃度和灌胃容量(一個(gè)

劑量組)。

方法:動(dòng)物購買后觀察3-5天，給予最大使用

濃度和最大灌胃容量的受試物(一日

內(nèi)1次或多次給予，一日內(nèi)最多不超過3次)，

連續(xù)觀察7.14天，動(dòng)物不出現(xiàn)死亡，則認(rèn)為受

試物對(duì)某種動(dòng)物的經(jīng)口急性毒性劑量大于某一

數(shù)值(g/kgBW)o最大灌胃容量小鼠為20mL/kg

BW,大鼠為20mL/kgBWo

(b)小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)試

體內(nèi)試驗(yàn)用于確認(rèn)受試物對(duì)特定類型腫瘤細(xì)

胞的殺傷或抑制作用，探索受試物產(chǎn)生藥效作用

的給藥劑量、途徑、頻率、周期等。體內(nèi)試驗(yàn)

通常采用動(dòng)物腫瘤移植模型和人癌移植模型。

由于動(dòng)物腫瘤移植模型與臨床療效之間的相關(guān)

性不強(qiáng)，僅可用于侯選化合物的初步篩選。通常

情況下，以人癌移植模型試驗(yàn)結(jié)果來評(píng)價(jià)抗腫瘤

藥物的有效性。

1、模型建立

細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物臨床前體內(nèi)試驗(yàn)一般

至少應(yīng)選用6種人癌移植瘤模型，其中應(yīng)包括

II期臨床試驗(yàn)中擬篩選的腫瘤組織類型。模型

的建立和使用應(yīng)注意：移植瘤復(fù)蘇后一般應(yīng)傳

2-3代后再用于體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)；為了保持移植

瘤的生物學(xué)特性和遺傳特性，復(fù)蘇后移植瘤體內(nèi)

傳代應(yīng)少于15-20代。

2、試驗(yàn)設(shè)計(jì)

腫瘤移植部位主要在皮下，也包括腹腔、腎

囊下和原位等。通常待移植腫瘤生長(zhǎng)至

100-300mm3后將動(dòng)物隨機(jī)分組給藥。一般包括

高、中、低3個(gè)劑量的治療組、陽性對(duì)照組和

陰性對(duì)照組。治療組受試物劑量的選擇應(yīng)能夠體

現(xiàn)出藥物的量效關(guān)系，高劑量不宜超過受試物

的最大耐受劑量。應(yīng)根據(jù)受試物的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)

和毒性反應(yīng)等確定給藥頻率和周期；給藥途徑應(yīng)

盡量與推薦臨床用藥的途徑相同。陽性對(duì)照藥一

般應(yīng)滿足以下條件：（1）與受試物作用機(jī)制相同

或相近；（2）對(duì)移植腫瘤敏感；（3）臨床廣泛

應(yīng)用且療效確切。陽性對(duì)照藥的給藥方案應(yīng)能夠

體現(xiàn)出藥物的最佳治療作用，其劑量一般不宜超

過最大耐受劑量。陰性對(duì)照組給予相應(yīng)的溶劑。

3、檢測(cè)指標(biāo)

推薦使用測(cè)量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察受試物

的抗腫瘤效應(yīng)。腫瘤直徑的測(cè)量次數(shù)根據(jù)移植瘤

的生長(zhǎng)情況而定，一般為每周2-3次。在試驗(yàn)

中還應(yīng)該觀測(cè)與藥物安全性有關(guān)的指標(biāo)，如動(dòng)物

體重增長(zhǎng)和死亡率，將治療組的這些數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)

治療對(duì)照組進(jìn)行比較，對(duì)于判斷藥物的安全性和

開發(fā)前景具有重要的意義。試驗(yàn)中應(yīng)記錄檢測(cè)

指標(biāo)的變化與給藥時(shí)間的關(guān)系，以便了解藥物的

作用特點(diǎn)，減少單次記錄試驗(yàn)結(jié)果可能引起的誤

差。體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果中還應(yīng)同時(shí)附有相應(yīng)的

照片。

4、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)應(yīng)綜合考慮受試

物的作用機(jī)制、模型的臨床相關(guān)性、每一種模

型的具體試驗(yàn)結(jié)果以及受試物與陽性對(duì)照藥物

試驗(yàn)結(jié)果的比較。

針對(duì)每一種人癌移植瘤模型，推薦采用相

對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)作為試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)

價(jià)標(biāo)準(zhǔn)通常為:T/C(%)>40%為無效；T/C(%)

?40%,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P＜為有效。在體內(nèi)

有效性試驗(yàn)采用的全部人癌移植模型中，一般至

少應(yīng)有1/3達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)，才提示藥物有必要

進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

在評(píng)價(jià)時(shí)還應(yīng)關(guān)注受試物與陽性對(duì)照藥試

驗(yàn)結(jié)果的比較。在毒性相當(dāng)(在有效性研究中主

要表現(xiàn)為動(dòng)物體重下降相當(dāng))的情況下，對(duì)受試

物治療組和陽性對(duì)照藥組腫瘤增殖率的比較也

是評(píng)價(jià)受試物是否有必要進(jìn)入臨床試驗(yàn)的指標(biāo)

之一。

附：

①相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%):針對(duì)每一種

人癌移植瘤模型的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。計(jì)算公

式如下：T/C%=TRTV/CRTV*100%o(TRTV：治療組

RTV；Cm陰性對(duì)照組RTV)。

②腫瘤體積(tumorvolume,TV)的計(jì)算公式

為:V=l/2XaXb2或冗/6XaXbXc。其中a、

b、c分別表示長(zhǎng)寬高。由于此兩公式的相關(guān)性

極好，可采用任一公式。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出

相對(duì)腫瘤體積(relativetumorvolume,RTV),

計(jì)算公式為：RTV二Vt/V0o其中V。為分籠給藥

時(shí)(即d。)測(cè)量所得腫瘤體積，X為每一次測(cè)量時(shí)

的腫瘤體積。

鼠S180移植瘤的抑制作用實(shí)驗(yàn)

1材料與方法

材料

實(shí)驗(yàn)用藥物

動(dòng)物及瘤株

肉瘤Si正實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠18-22go

儀器設(shè)備

灌胃器、手術(shù)器械、天平、離心機(jī)

方法

腫瘤模型建立

小鼠s⑸細(xì)胞接種于昆明種小鼠腹腔后，

取腹水傳代保存。取腹水傳代第7日荷瘤小鼠,

脫頸椎處死小鼠，消毒腹部皮膚，無菌注射器

吸取乳白色腹水，用生理鹽水調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃

度為1X107/疝，用酒精棉球消毒昆明種小鼠

右側(cè)腋下皮膚，于皮下接種上述瘤細(xì)胞懸液

（mL/只），常規(guī)飼養(yǎng)。

藥物對(duì)小鼠S18。的抑制作用

昆明種小鼠50只，腋下接瘤，次日將荷

瘤小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為模

型組、環(huán)磷酰胺（CTX）組、藥物高、中、低

劑量組。干后,稱取瘤重，，計(jì)算抑瘤率:小鼠

接瘤后第二日開始按表1所示劑量和方式給

藥，CTX組于接瘤后第2日給藥，隔天一次，

藥物組每日給藥一次，連續(xù)10天，ml/20g

體重。末次給藥24小時(shí)后，脫頸椎處死小鼠，

剝?nèi)×鼋M織，去除血污、脂肪等非腫瘤組織，

用濾紙吸

抑瘤率%=（1—給藥組平均瘤重/對(duì)照組

平均瘤重）X100%

表1荷瘤小鼠給藥劑量和方式

劑量（mg/kg

組別給藥方式

B.W.）

模型一一

CTX20腹腔注射

高一灌胃

中灌胃

藥物

低灌胃

對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響

動(dòng)物接種S18。瘤株為第0天，第1天開始

灌胃，連續(xù)灌胃10天，第11天處死動(dòng)物，

準(zhǔn)確稱量動(dòng)物體重、胸腺重量、脾臟重量，計(jì)

算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，臟器指數(shù)二臟器重量

/體重。

表2藥物對(duì)免疫指數(shù)的影響&±s）

胸腺指

劑量動(dòng)物脾指數(shù)

數(shù)

組別(mg/kg數(shù)(1X1

(1X10-

B.W.)（Z7）0-3)

3)

空白

—>10

對(duì)照

20

CTX10

i.p.

—10

藥物—10

—10

取部分瘤組織用10%中性甲醛固定，石蠟

包埋，切片，經(jīng)蘇木精一伊紅染色，

光鏡觀察。

實(shí)驗(yàn)步驟

①固定液、染色液的配置

固定液：

(1)10%中性福爾馬林。

甲醛100ml

NaH2P04H2O4g

Na2HPO413g

蒸福水900ml

(2)Harris蘇木素：

配方：

蘇木素1g無水乙醇10ml

蒸鐳水200ml鉀明研20g

HgOg

先將蘇木素溶于無水乙醇中，備用。把明磯

放入蒸偏水，加熱溶解，再加入備用的蘇木素，

煮沸2分鐘，先加入少量的氧化汞，防止氧化

過程中蘇木素外溢，玻棒攪拌，然后，邊攪拌邊

加入氧化汞。加完后，立即移至冰水中，加速其

冷卻，靜置一夜后，過濾。用前以5%的比例

加入冰醋酸。

⑶伊紅（醇溶性）

配方：

伊紅（醇溶性）

75%酒精1000ml

加幾滴冰醋酸至半透明狀。

伊紅有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，應(yīng)

該在脫水前進(jìn)行染色，如果是醇溶的，應(yīng)使用與

溶解伊紅等濃度的酒精開始脫水。

（4）鹽酸酒精分化液：

濃鹽酸?1ml

75%酒精99ml

⑸蛋白甘油：

蛋白甘油是粘貼蠟片用的粘片劑。配方如下:

取一新鮮雞蛋的蛋白，充分?jǐn)嚢璩裳┗钆菽?/p>

然后濾去泡沫，加入等量甘油，攪拌均勻，再加

入一小粒麝香草酚防腐。

②實(shí)驗(yàn)用具:解剖器一套、單面刀片、切片刀、

切片機(jī)、載玻片、蓋玻片、標(biāo)本瓶、燒杯、量筒、

漏斗、染色缸、樹膠瓶、酒精燈、毛筆、繪圖紙、

濾紙、熔蠟箱（或恒溫箱）、展片臺(tái)（或燙板）、

小木塊、蠟帶盒、烤片盒、切片托盤。

③病理標(biāo)本的采集和制作

⑴取材

脫頸椎處死小鼠，剝?nèi)×鼋M織，去除血污、

脂肪等非腫瘤組織。

⑵固定與修塊

迅速將胰腺放入4%中性甲醛（用PH）中固

定48小時(shí),組織塊的直徑應(yīng)小于7mm。

⑶脫水與透明

在以下過程，要求經(jīng)?；蝿?dòng)組織塊，以保證

組織塊能夠充分地與乙醇或二甲苯接觸，在每一

步驟之后，要充分濾干組織塊，一般用筒紙吸干

組織塊上的液體，以免影響其它液體的濃度，但

要防止組織塊干燥。（270miii）o

1.75%乙醇

50min

2.85%乙醇

50min

3.95%乙醇（I）

30min

4.95%乙醇（ID

30min

5.100%乙醇（I）

30min

6.100%乙醇（II）

30min

71/2二甲苯（乙醇與二甲苯等體積）

20min

8.二甲苯（I）

20min

9.二甲苯（II）

lOmin（可依據(jù)透明效果而定）

透明效果的判斷:如組織塊顏色加深透明,

二甲苯溶液顏色透明，即表明脫水效果很好；如

脫水不好，二甲苯溶液顏色會(huì)變混濁。使用過的

酒精或二甲苯倒入燒杯里以便回收。

(4)浸蠟、包埋與修蠟塊

1.浸蠟:可在脫水與透明進(jìn)行時(shí)，將60℃

恒溫箱打開，使大燒杯內(nèi)的石蠟充分溶解，待脫

水與透明結(jié)束后，可將脫水籃整個(gè)或包裹在紗布

內(nèi)的組織塊轉(zhuǎn)入充分溶解的石蠟里，于60c恒

溫箱放置120分鐘。

2.包埋:包埋有多種器具，比較簡(jiǎn)潔廉價(jià)

的方法是采用紙盒?？稍诮灥耐瑫r(shí)將紙盒做

好，包埋時(shí)將60℃的石蠟倒入紙盒內(nèi)，然后用

小鐐子將各組織塊按一定的順序排列好，使切面

朝下。我們建議，不同組別的同一組織包埋于一

個(gè)蠟塊中，以保證切片和染色條件一致，且以便

讀片和比較。為防止倒入紙盒內(nèi)的石蠟底部立刻

凝固，可將紙盒置于一玻璃板上(或大培養(yǎng)皿

內(nèi))，然后將玻璃板置于80-90℃左右熱水上，包

埋時(shí)蠟盒底部要放平，做蠟塊的蠟要反復(fù)凍融較

好。組織包埋方法可參見表2。

3.修蠟塊:待紙盒內(nèi)蠟?zāi)毯螅ㄈ粜枰瓜?/p>

塊迅速凝固，可將包埋好的蠟塊置于4c冰水混

和物中）。將蠟塊取出，用刀片將其修成梯形，

通常蠟塊大小視組織多少而定，為保證切片順

利，組織塊與蠟塊邊緣之間的距離不得小于

2mmo修剪下來的殘蠟應(yīng)回收，以便再用。

⑸切片

在載玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油

蛋白于載玻片上，用手指充分抹勻，呈半干狀為

佳。

切片厚約4?即m,通常厚約6pm,細(xì)胞小

而密的組織如胸腺，能夠切4?5RH,而細(xì)胞疏的

組織，如下丘腦可切將切片在55c左右

水浴中展開，展開程度以帶黃顏色的組織完全攤

平為準(zhǔn)。

用涂有甘油蛋白的載玻片從水浴中撈取切

片，斜放在木架上，立即放入37℃烘箱中過夜,

一般時(shí)間越長(zhǎng)效果越好，以切片緊貼于載玻片上

呈半透明狀為佳。每個(gè)組織塊撈片2張。

過夜后，將載玻片置于玻片架上，進(jìn)行下

面的實(shí)驗(yàn)。

⑹脫蠟、染色與脫水

取出玻片架后，應(yīng)將玻片架傾斜，以使載

玻片上的試劑流盡，然后用筒紙將玻片架和載玻

片下緣的試劑吸干，以免影響其它試劑的濃度。

全過程約需要50mino

1.脫蠟到水

(1)二甲苯(I)15分鐘

(2)二甲苯(II)15分鐘

(3)100%乙醇2分鐘

(4)95%乙醇(I)1分鐘

(5)95%乙醇(II)1分鐘

(6)蒸鐳水浸洗1分鐘

2.染色

(7)蘇木精30秒鐘

(8)自來水沖洗1分鐘，但應(yīng)注意不能用

水直接沖在玻片上，以免沖走切片。(顯微鏡下

觀察效果)

(9)伊紅(著色即可)10秒鐘

(10)蒸饋水浸洗1分鐘

3.脫水

(10)95%乙醇(I)1分鐘

(11)95%乙醇(II)1分鐘

(12)100%乙醇2分鐘

(13)二甲苯(I)2分鐘

(14)二甲苯(II)3~5分鐘

⑺封片

將載玻片從玻片架上取下，滴加1~2滴中

性樹膠，用眼科鏡夾住蓋玻片的一角，輕輕蓋上

蓋玻片，讓中性樹膠沿著蓋玻片充分展開，之后

傾斜載玻片，用筒紙將多余的中性樹膠吸干，同

時(shí)注意避免有氣泡的產(chǎn)生，平放載玻片，室溫下

長(zhǎng)期保存。

數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組或重復(fù)3次，結(jié)果

以as表示，用SPSSo

注意事項(xiàng)

①關(guān)于腹水傳代，觀察到第一代的種鼠肚子較大

后（一般約8-9天左右），能夠傳代，傳代時(shí)取

1ml注射器，用2ml注射器的針頭，種鼠腹部消

毒后直接將針頭插入抽取腹水即可，注意不要

把針頭插得很深，盡量淺一點(diǎn)，還能夠把老鼠拎

起來，利用重力，讓腹水集中在某處便于抽取，，

不用離心，直接用PBS3-6倍稀釋后，接種到

新的老鼠腹腔，腹水顏色為白色或者略有發(fā)黃都

是正常的，但是血性腹水說明不好，需要注意調(diào)

整，第二代以后，盡量6-7天的時(shí)候傳代，不要

等的時(shí)間太久，否則腹水容易血性。三代后可用

于試驗(yàn)。

②關(guān)于接種進(jìn)行試驗(yàn)，這個(gè)時(shí)候抽取的腹水需要

量比較多，一般需要處死種鼠后，小心地用消毒

眼科剪刀鏡子剝開腹部皮膚，注意不要弄破肌

肉，然后，用鏡子拎起腹部的肌肉，用剪刀剪開

一個(gè)小口，然后用玻璃滴管或者去掉針頭的注射

器吸取腹水。稀釋后，接種到小鼠的腋下。關(guān)

于稀釋量，最好摸索一下，開始的時(shí)候能夠適當(dāng)

的計(jì)數(shù)，污染。但是要用臺(tái)盼蘭染色后計(jì)活細(xì)胞

數(shù)。接種部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋

窩里面，會(huì)給以后的操作帶來麻煩。接種時(shí)的進(jìn)

針處離接種處遠(yuǎn)一點(diǎn)，讓針頭在皮下多走一段，

不容易

③細(xì)胞接種量控制在1X106/只時(shí)，小鼠腹水出

現(xiàn)情況一般如下：5?6d出現(xiàn)腹水，7?9d抽取

傳代最好，10-12d出現(xiàn)血性腹水，14?15d

小鼠開始死亡。

④如果動(dòng)物固定不佳，注射腫瘤細(xì)胞時(shí)針頭在

皮下來回游動(dòng)，結(jié)果是腫瘤長(zhǎng)成后不能成為一

個(gè)球形或半球形，而是成為有幾個(gè)小瘤體組成

的長(zhǎng)條或者不規(guī)則形狀。

⑤關(guān)于觀測(cè)指標(biāo)，主要是按時(shí)稱體重，試驗(yàn)結(jié)束

后剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。因?yàn)槌隽鲆呀?jīng)是接種后的第

6天左右了，第10天就結(jié)束時(shí)間，瘤體積的數(shù)

據(jù)意義就不大。按照SFDA的規(guī)定，平均瘤重小

于1g,或者單個(gè)瘤重小于200mg,認(rèn)為腫瘤生

長(zhǎng)不良，試驗(yàn)作廢。

(d)體外實(shí)驗(yàn)法:用培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行。

體外試驗(yàn)主要用于對(duì)候選化合物進(jìn)行篩選，

初步了解受試物的作用機(jī)制、敏感腫瘤類型和作

用強(qiáng)度，為隨后進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)提供參考。

在體外培養(yǎng)的不同人腫瘤細(xì)胞系中加入不

同濃度的待測(cè)藥物，采用磺酰羅丹明染色法

(SRB法)、四氮咬鹽還原法、集落形成法等

方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度

(IC50),并與標(biāo)準(zhǔn)治療藥物進(jìn)行比較，能夠

初步預(yù)測(cè)抗腫瘤藥物的抗瘤譜和作用強(qiáng)度。應(yīng)根

據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)理確定體外試驗(yàn)

采用的研究方法。例如，以線粒體為作用靶點(diǎn)

的藥物不宜采用四氮咬鹽還原法。

試驗(yàn)中，在選擇腫瘤細(xì)胞系時(shí)應(yīng)考慮到細(xì)胞

的生長(zhǎng)和增殖速率，一般至少應(yīng)選用12種人癌

細(xì)胞系。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)的時(shí)間一般為48~72

小時(shí)，貼壁細(xì)胞需先貼壁24小時(shí)后再給藥。試

驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽性及陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)抗腫

瘤藥，陰性對(duì)照為溶媒對(duì)照。試驗(yàn)至少應(yīng)重復(fù)一

次。

1、嘎哇藍(lán)(MTT)法在培養(yǎng)的活細(xì)胞線粒

體中與NADP相關(guān)的脫氫酶可將黃色的四氮哇

(MTT)催化成不溶性的藍(lán)紫色的甲替，將甲

替用二甲基亞碉(DMSO)溶解后，利用酶標(biāo)儀

(試驗(yàn)波長(zhǎng)570nm,參比波長(zhǎng)450nm)測(cè)定光

密度值，按照公式

實(shí)驗(yàn)組

光密度值

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1

-)X100%

對(duì)照組

光密度值

計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。用系列濃

度的藥物可制作腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的量效曲

線。

2、染料排斥法本方法是根據(jù)活細(xì)胞具有排

斥某些染料的功能，而死細(xì)胞因胞膜破壞而易于

被染料著色的原理，在培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞

懸液中加入伊紅、臺(tái)盼藍(lán)、或苯胺黑等染料，在

室溫下放置5分鐘后，在15分鐘用血球計(jì)數(shù)板

計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。根據(jù)公式

未染細(xì)胞數(shù)

活細(xì)胞率—X100%

細(xì)胞總數(shù)

3、生長(zhǎng)曲線法本方法是根據(jù)腫瘤的

Gompertzian生長(zhǎng)曲線而設(shè)計(jì)。培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞

在初期為指數(shù)增殖期，隨著細(xì)胞密度的增加，因

代謝產(chǎn)物的積聚和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，增殖趨于減

緩乃至停止，進(jìn)入所謂的平臺(tái)期。在培養(yǎng)后的的

即刻、1、2、3、4、5、7天的細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)

染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后取細(xì)胞對(duì)數(shù)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作

圖可獲細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1）將生長(zhǎng)曲線外延至Y

軸可獲得截距No,,用公式

對(duì)增殖細(xì)胞的殺傷力=N°-WX100%

No

計(jì)算藥物對(duì)增殖細(xì)胞的殺傷力（No'是對(duì)照組

的的截距）

2）用Nt代表接種后t小時(shí)的細(xì)胞數(shù)，用公

式

TD=/logNt-LogNo

計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增增時(shí)間（TD）的影響。

3）取平臺(tái)期每毫升的細(xì)胞均數(shù)，比較細(xì)胞生

長(zhǎng)的飽合密度（Ns）。

4、集落形成法本方法利用分裂濟(jì)代以上的

克隆原單細(xì)胞子細(xì)胞可形成集落成簇（每簇細(xì)胞

數(shù)＞50）的能力，比較藥物對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞增殖

能力的影響。本方法有貼壁法和半固體培養(yǎng)法兩

種。

1）貼壁法需要選用貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，按

500細(xì)胞/ml的濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中，培

養(yǎng)后棄去培養(yǎng)基，用瑞氏-姬姆薩染色后，在20

X解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)含有50i個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集

落。

2）半固體軟瓊脂培養(yǎng)法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞,

用含小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成1000細(xì)胞/ml的

懸液；溶化5%的瓊脂液，并按1:9的比例與含

小牛血清的新鮮培養(yǎng)液混合,倒入35mm培養(yǎng)皿

（Iml/HIL）,室溫下待瓊脂凝固，,%瓊脂,加到

已制備的瓊脂平皿中，室溫下凝固。移入培養(yǎng)箱

培養(yǎng)。在16X解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75U

m的細(xì)胞集落。以集落形成抑制百分率對(duì)對(duì)數(shù)劑

量作圖，可得型曲線，從曲線上求取半數(shù)

抑制濃度IC50；以集落的存活分?jǐn)?shù)與劑量作圖，

可獲得克隆原細(xì)胞存活曲線，方程為

S=l-(Le?D/Do)n,S為存活分?jǐn)?shù)，D為劑量，Do

為存活分?jǐn)?shù)每下降1/e時(shí)所需的藥物劑量，n

為外推值。D。越小，藥物的殺傷力越大，N越

大殺死細(xì)胞的藥物劑量越大。

5、硫化若丹明B法(SRB)法硫化若丹明

(sulforhamineB)呈粉紅色，溶于水，可與生

物大分子的堿性氨基酸結(jié)合，這種結(jié)合物在波長(zhǎng)

515nm時(shí)的讀數(shù)與細(xì)胞表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，

可用于細(xì)胞的定量。測(cè)試的細(xì)胞先用TCA固定,

去除固定液，加入SRB,室溫下靜置，然后

去除未結(jié)合的SRB,用非緩沖tris堿液溶解結(jié)

合的SRB,在自動(dòng)化分光光度平板讀數(shù)儀

(515nm波長(zhǎng))測(cè)定OD值?？筛鶕?jù)下述公式計(jì)

算：

T-To

生長(zhǎng)率07=X100%

C-To

C、T和To分別為對(duì)照組細(xì)胞，為給藥組細(xì)

胞，另外的對(duì)照平板加藥時(shí)的細(xì)胞的OD值。

T-To

殺傷率(％)=X100%

T

To

50%生長(zhǎng)抑制所需的藥物濃度(GI50)=

X100%

C-

To

To

殺死50%細(xì)胞所帝的藥物濃度(LC5O)二

X100%

To

(e)抗腫瘤作用機(jī)理的深入研究

(一)藥物作用周期特異性研究

進(jìn)行藥物作用細(xì)胞周期性實(shí)驗(yàn)必須首先制備

同步化的細(xì)胞，常用的體外培養(yǎng)細(xì)胞同步化的方

法有機(jī)械振蕩法、雙胸昔同步法、含羞草氨酸俘

獲法和離心洗脫法。

1、機(jī)械振蕩法機(jī)械振蕩法分離同步化細(xì)胞

是基于單層貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂期

時(shí)，胞形變圓，松散地附在支持物上，利用搖晃

或拍擊培養(yǎng)瓶能夠剝離出這些細(xì)胞，利用此方法

能夠得到較純的M期細(xì)胞。雙胸昔同步法的原

理是先以高濃度的TdR處理細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的

dTTP升高，后者抑制CDP向dCDP的轉(zhuǎn)變，

DNA復(fù)制受阻，S期細(xì)胞停滯在S期，其它期

細(xì)胞積聚在Gi/S邊界；撤TdR,讓原處于S期

的細(xì)胞完全越過S期，再給予TdR,讓越過S

期的細(xì)胞進(jìn)入Gi/S邊界，然后撤去TdR,讓細(xì)

胞重新生長(zhǎng)，同時(shí)進(jìn)入S期。因此，本方法能夠

得到較純的S期細(xì)胞。

2、含羞草氨酸俘獲法含羞草氨酸可將細(xì)胞

集結(jié)于Gi/S邊界，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。在撤除

含羞草氨酸后，細(xì)胞可同步進(jìn)入S期。

3、離心洗脫法離心洗脫法的原理是進(jìn)入細(xì)

胞周期的的體積呈線性增加。Gi期細(xì)胞體積最

小，離出口最近而被最先洗出。G2/M細(xì)胞體積

最大離進(jìn)氣口最近而被后洗出。

在上述同步化處理尚需配合以同步化程度的

檢測(cè)，檢查的方法有兩種:流式細(xì)胞光度技術(shù)和

放射性同位素技術(shù)。前者通過測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)

度來定量細(xì)胞的DNA量；后者則利用測(cè)定摻入

到DNA中的3H.胸昔(3H-TdR)或漠脫氧尿昔

(BrdU)的量來獲知處于S期的細(xì)胞量。

(二)藥物抗微管作用利用微管蛋白在

37℃聚合，在冰浴上解聚的特點(diǎn)，測(cè)定微管蛋白

或微管液的OD值，分別獲得S型的聚合曲線和

倒S型的解聚曲線，比較藥物對(duì)曲線的影響，

用下式計(jì)算抑制率。

實(shí)驗(yàn)組光密度值

抑制率(%)=)X

100%

對(duì)照組光密度值

（三）藥物與DNA結(jié)合能力檢查

吸收光譜移動(dòng)法原理是DNA與藥物形成復(fù)

合物后吸收光譜發(fā)生改變，吸收峰產(chǎn)生位移，位

移波長(zhǎng)隨DNA/藥物復(fù)合物的量增加而增加。

利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，可

觀察到這些改變。

熒光光譜移動(dòng)法原理是在激發(fā)光的激發(fā)

下，DNA.藥物復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜發(fā)生改變,

譜峰向短波方向移動(dòng)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)激發(fā)

光譜說發(fā)生改變。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定激發(fā)光

譜和發(fā)射光譜可觀察到這些變化。

（四）藥物造成的DNA損傷

彗星（Comet）微凝膠單細(xì)胞電泳法正常的

DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，在pH<,在pH>oDNA

受損后鏈斷裂，成為一個(gè)松散的結(jié)構(gòu)，在電場(chǎng)的

作用下，松散的DNA離開細(xì)胞核向正極移動(dòng)，形

成彗星似的拖尾，變換不同pH緩沖液可檢測(cè)斷

裂的是雙鏈還是單鏈。

堿洗脫法收集細(xì)胞于濾膜上，用細(xì)胞溶解

液裂解細(xì)胞并洗去RNA和蛋白質(zhì)，暴露DNA,

用洗脫液進(jìn)行洗脫，若DNA發(fā)生鏈斷裂，則易

于經(jīng)濾膜洗出。

（五）藥物對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是調(diào)節(jié)DNA空間結(jié)構(gòu)的

動(dòng)態(tài)變化的關(guān)鍵性核酶,分成拓?fù)洚悩?gòu)酶I和IL

抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I能夠造成DNA的單鏈斷裂，

抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶H,可造成雙鏈斷裂，進(jìn)而干擾

DNA的復(fù)制、重組和基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)的原理是

用從腫瘤細(xì)胞核提取的拓?fù)洚悩?gòu)酶II處理

PBR322DNA,后者是一種質(zhì)粒DNA,主要存在

有超螺旋、缺口狀和線性DNA三種形式，瓊脂

糖電泳上顯示出三條帶，在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下

超螺旋DNA解旋、斷裂，電泳時(shí)超螺旋帶減弱

或消失，相應(yīng)的缺口環(huán)狀或線性DNA增加。如

果藥物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶具有抑制作用，則可見超螺

旋帶保留。此方法亦可改進(jìn)為觀察藥物對(duì)拓?fù)洚?/p>

構(gòu)酶功能的促進(jìn)和抑制作用。方法是選定不能使

一定量DNA完全斷裂量的拓?fù)洚悩?gòu)酶處理

PBR322DNA后電泳可見超螺旋帶，同時(shí)加入不

同濃度的藥物，如果藥物抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶，則超

螺旋帶增強(qiáng)，若藥物增強(qiáng)拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，則見

螺旋帶減弱或消失。

（六）藥物對(duì)細(xì)胞核酸代謝的影響DNA和

RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素標(biāo)記前

體物如3H-TdR,3H-UR可分別摻入到細(xì)胞DNA

和RNA中去，用液閃法測(cè)定其同位素活性則可

知細(xì)胞DNA和RNA的合成情況。

（七）藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死

亡過程，細(xì)胞凋亡時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞體縮小，染色質(zhì)

濃縮成大小不等的塊狀，并裂解為小片段。DNA

斷裂長(zhǎng)度為核小體核甘酸長(zhǎng)度（180?200堿基對(duì)）

的整倍數(shù)，提取后普通的瓊脂糖電泳表現(xiàn)為特殊

的云梯狀，凋亡小體形成。檢查細(xì)胞凋亡的方法

有：

1、熒光顯微鏡的形態(tài)學(xué)檢查該方法是利用

凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，DNA廣泛裂解的特征和

熒光化合物可嵌入DNA分子或以靜電相互作用

與DNA分子結(jié)合的原理，建立DNA的熒光探

針。常用的方法是用Hoechst33342和PI聯(lián)合染

色，然后在熒光顯微下用紫外光激發(fā)。凋亡的細(xì)

胞對(duì)Hoechst33342具有高攝取比，加之染色質(zhì)

的高度濃縮，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光；正常細(xì)胞呈微弱熒

光，壞死細(xì)胞則呈紅色熒光（被PI染色）。

2、流式細(xì)胞光度術(shù)該方法的原理是用

DNA結(jié)合性的熒光染料標(biāo)記DNA,因?yàn)榧?xì)胞

發(fā)生凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解、斷裂

DNA,斷裂生成的小分子量DNA溢出細(xì)胞外，

細(xì)胞內(nèi)DNA總量降低，利用流式細(xì)胞光度術(shù)能

夠檢測(cè)出DNA的這種結(jié)構(gòu)和量的變化。

3、瓊脂糖電泳分析法利用該方法可檢測(cè)出

呈云梯狀的寡聚核小體。

(g)動(dòng)物體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

了解受試物在體內(nèi)的吸收、分布和排泄速度

以及蓄積性，尋找可能的靶器官:為選擇慢性毒

性試驗(yàn)的合適動(dòng)物種、系提供依據(jù)：了解代謝產(chǎn)

物的形成情況。

范圍

本方法規(guī)定了代謝試驗(yàn)的基本技術(shù)要求。

本方法適用于評(píng)價(jià)我國(guó)創(chuàng)新的化學(xué)物質(zhì)，或

需要進(jìn)行三個(gè)階段毒性試驗(yàn)包

括已知化學(xué)物質(zhì)或與已知化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相

同的衍生物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化途徑及轉(zhuǎn)歸。

原理

受試物在體內(nèi)可發(fā)生一系列復(fù)雜的生化變

化。受試物經(jīng)胃腸道吸收后通過血液轉(zhuǎn)運(yùn)到全

身各組織器官，再經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化，由各種途徑排

出體學(xué)結(jié)構(gòu)，測(cè)試其毒性并推測(cè)受試物在體內(nèi)的

具體代謝途徑。通過本實(shí)驗(yàn)的觀察，對(duì)受試物在

體外。因此，受試物原形物在逐漸被代謝降解，

而其代謝產(chǎn)物不斷生成。測(cè)定灌胃后不同時(shí)間內(nèi)

受試物原形物或其代謝物在血液、組織或排泄物

中的含量，以了解該受試物在動(dòng)物體內(nèi)的毒代動(dòng)

力學(xué)特征，包括吸收、分布、消除的特點(diǎn)，組織

蓄積及可能作用的靶器官等，根據(jù)數(shù)學(xué)模型，求

出各項(xiàng)毒代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。同時(shí)采用分離純化方法

確定主要代謝產(chǎn)物的化內(nèi)的過程可作出正確評(píng)

價(jià)，為闡明該受試物的毒作用性質(zhì)與程度提供科

學(xué)依據(jù)。

儀器與試劑

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，配備高效薄層色譜、高效液

相色譜、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用及紫外光、熒光檢

測(cè)等儀器設(shè)備。

放射性測(cè)量?jī)x器:液體閃爍計(jì)數(shù)儀及閃爍液。

實(shí)驗(yàn)室常用儀器與試劑。

試驗(yàn)動(dòng)物

原則上應(yīng)盡量使用與人具有相同代謝途

徑的動(dòng)物種系。一般選用兩種性別、體重為

22-28g成年小鼠或170-220g大鼠。試驗(yàn)開始

時(shí)動(dòng)物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的

±20%o

劑量及分組

選用低于最大未觀察到有害作用劑量，需要時(shí)

可用高、低二種劑量。可單次或多次給予受試

物。如采用標(biāo)記化合物，除確定化學(xué)劑量外，

放射性劑量一般小鼠為10?20PCi/只。、大

鼠100-250UCi/kg（4-9MBq/只）。

操作步驟

①受試物配制:一般用蒸鐳水作溶劑，如受試物

不溶于水，可用食用油、醫(yī)用淀粉、竣甲基纖維

素配成乳濁液或懸濁液。受試物應(yīng)于灌胃前新鮮

配制，除非有資料表明以溶液（或懸濁液、乳濁

液等）保存具有穩(wěn)定性。

②給受試物途徑：以灌胃為主，灌胃前動(dòng)物禁食

16-18h,自由飲水。進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)分析

時(shí)，最好同時(shí)采用灌胃和靜脈注射。

③試驗(yàn)項(xiàng)目：進(jìn)行代謝試驗(yàn)前，需建立測(cè)定生物

樣品中受試物含量的微量化學(xué)分析方法或

標(biāo)記受試物的同位素示蹤方法。

:于動(dòng)物灌胃后6?10個(gè)不同的時(shí)相采血，每

個(gè)時(shí)相的動(dòng)物數(shù)不應(yīng)少于3只。結(jié)果以每mL血

漿中受試物含量或放射性強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，時(shí)

間為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上作藥-時(shí)曲線。如以

化學(xué)分析方法測(cè)定受試物含量，用已編制的藥代

動(dòng)力學(xué)計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行曲線擬合，按房室模型求

出毒代動(dòng)力學(xué)方程及各項(xiàng)代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。如用

同位素示蹤法測(cè)定血漿總放射性水平，作代謝動(dòng)

力學(xué)分析時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

:于灌胃后不同時(shí)間處死動(dòng)物，取出胃腸道及其

內(nèi)容物（包括糞）作成勻漿，

測(cè)定受試物含量或放射性水平，以灌胃后即刻處

死動(dòng)物的胃腸道回收量為100%,分別觀察不同

時(shí)相的各組動(dòng)物中受試物或放射性自胃腸道消

失的情況。以上述不同時(shí)相回收量的百分?jǐn)?shù)為縱

坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上作圖，求得

受試物或放射性在胃腸道的消失速率。為確定受

試物在胃腸道的消失速率是否能反映在體內(nèi)的

吸收情況，需進(jìn)行離體胃腸道溫孵試驗(yàn)，即將受

試物注入離體胃腸道后結(jié)扎兩端，于37c

Kreb飛液中振蕩溫孵lh,測(cè)定受試物的回收率,

以觀察受試物在胃腸道內(nèi)有無受到破壞，由此估

計(jì)受試物在胃腸道的吸收速率。

:于灌胃后取-.!個(gè)不同時(shí)相處死動(dòng)物，對(duì)肝、腎、

腦等器官

和組織進(jìn)行受試物含量或放射性測(cè)定，以找出受

試物含量最高的組織和時(shí)間。

⑴尿、糞排泄:給動(dòng)物灌胃受試物后放入有機(jī)玻

璃代射籠內(nèi)，于3?7天內(nèi)按規(guī)定時(shí)間收集尿和糞。

如發(fā)現(xiàn)尿糞互混，則把標(biāo)本棄去再另收集。作代

謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析時(shí)應(yīng)把收尿容器放在冰浴中并

注意避光。

⑵膽汁排泄:輕度乙酸麻醉下給動(dòng)物施行膽道插

管，待動(dòng)物清醒后以受試物灌胃，收集

不同時(shí)間的膽汁（不少于24h）。

從不同時(shí)間收集的尿、糞、膽汁標(biāo)本中的受

試物含量或放射性強(qiáng)度，分別計(jì)算其累積排出量

（占灌胃劑量的百分?jǐn)?shù)）。

:按受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和文獻(xiàn)資料，估計(jì)可能產(chǎn)

生的代謝產(chǎn)物。給動(dòng)物以受試物后，收集尿、膽

汁等標(biāo)本，或在體外代謝條件下采用肝微粒體、

酶活性系統(tǒng)和受試物于37c振蕩培養(yǎng)，以提取、

純化后進(jìn)行代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定。分析手段包括薄

層色譜、氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜、紅外光譜

等。要有預(yù)測(cè)的代謝物純品作標(biāo)準(zhǔn)。如采用標(biāo)記

化合物，樣品經(jīng)薄層色譜分離后用放射性薄層掃

描儀或分段刮下硅膠測(cè)定放射性，由Rf值判定

并測(cè)量受試物的量及可能的代謝產(chǎn)物，再作進(jìn)一

步分析。從代謝物的分離與鑒定，對(duì)受試物在體

內(nèi)的可能代謝途徑作出推斷。

④同位素實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)：同位素方法是毒物

代謝實(shí)驗(yàn)中不可缺少的手段之一，常列為首選的

實(shí)驗(yàn)方法，它具有靈敏度高、樣品制備較簡(jiǎn)單、

不易受生物材料中雜質(zhì)的干擾，能夠示蹤觀察受

試物進(jìn)入體內(nèi)后的歸宿等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合化學(xué)分析法

如薄層色譜、液相色譜法，可把原形物和代謝物

分開以初步確定代謝物的可能存在形式。用放射

自顯影法可定位觀察受試物和代謝產(chǎn)物在整體

動(dòng)物或某些組織中的分布定位。

⑴標(biāo)記核素：由實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、受試物分子結(jié)構(gòu)、半

衰期、經(jīng)費(fèi)等因素而定。

⑵標(biāo)記位置:應(yīng)標(biāo)記在受試物結(jié)構(gòu)中具有生物

活性的基團(tuán)上，即定位標(biāo)記。如生物活性基團(tuán)

不清楚，由可采用均勻標(biāo)記或全標(biāo)記。標(biāo)記位

置在化學(xué)結(jié)構(gòu)上應(yīng)是穩(wěn)定的。按不同研究目

的，可單標(biāo)記、雙標(biāo)記或多標(biāo)記。

⑶放射化學(xué)純度:標(biāo)記物應(yīng)保證高度的放化純

度（至少90%以上），必要時(shí)用薄層色譜

法進(jìn)行純化。

⑷放射性比度:隨受試物毒性大小而定。毒性

大的受試物，要求高放射性比度的標(biāo)記物。用

非標(biāo)記受試物稀釋配制成實(shí)驗(yàn)所要求的化學(xué)

劑量。

:代謝試驗(yàn)常用的標(biāo)記放射性核素大都屬軟B

射線，測(cè)量食品主要

為液體閃爍計(jì)數(shù)儀。

⑴樣品制備:酸消化法。、、（糞加水制成勻

漿液,或糞紅外燈烘干后研磨成粉，）兩份，一

80c水浴消化45min,加蒸儲(chǔ)水定容至1mL,,

加入3?5mL閃爍液進(jìn)行放射性測(cè)量（膽汁、

尿離心后可直接取樣測(cè)量）。有條件者可用固

體閃爍晶體。

⑵樣品測(cè)量法:均相測(cè)量法。樣品經(jīng)淬滅校正

后，以每克組織或每毫升血漿中每min放射性

衰變數(shù)（DpM）表示。

⑶放射性測(cè)量誤差:放射性測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤

差應(yīng)不超過5-10%o

⑤對(duì)生物樣品中受試物分析方法的要求:建立一

個(gè)靈敏、特異、重現(xiàn)性好的測(cè)定方法。

結(jié)果判定

①根據(jù)吸收速率、組織分布以及排泄情況，估計(jì)

受試物在體內(nèi)的代謝速率和蓄積性。

②根據(jù)主要代謝物的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，推斷受試物在

體內(nèi)的可能代謝途徑以及有無毒性代謝物的生

成情況。

（h）動(dòng)物亞急性，長(zhǎng)毒實(shí)驗(yàn)

了解經(jīng)長(zhǎng)期接觸受試物后出現(xiàn)的毒性作用

以及致癌作用；最后確定最大未觀察到有害作

用劑量和致癌的可能性，為受試物能否應(yīng)用于保

健食品的最終評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

慢性毒性試驗(yàn)所得的最大未觀察到有害作用劑

量進(jìn)行評(píng)價(jià)的原則是：

①最大未觀察到有害作用劑量小于或等于人的

可能攝入量的50倍者，表示毒性較強(qiáng)，應(yīng)放棄

該受試物。

②未觀察到有害作用劑量大于50倍而小于100

倍者,經(jīng)安全性評(píng)價(jià)后，決定該受試物是否可用。

③最大未觀察到有害作用劑量大于或等于100

倍者，則可考慮允許使用。

范圍

本方法規(guī)定了慢性毒性和致癌試驗(yàn)的基本技

術(shù)要求。

術(shù)語和定義

最大未觀察到有害作用劑量（NOAEL）:是

指通過動(dòng)物試驗(yàn)，以現(xiàn)有的技術(shù)手段和檢測(cè)指標(biāo)

未觀察到與受試物有關(guān)的毒性作用的最大劑量。

靶器宮:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)由受試物引起的明顯

毒性作用的任何器官。

致癌性:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日重復(fù)暴露于受試物導(dǎo)致

腫瘤的發(fā)生。

慢性毒性:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期每日重復(fù)暴露于受試

物出現(xiàn)的有害作用。

原理

在動(dòng)物的大部分生命期間，經(jīng)過反復(fù)給予

受試物后觀察其呈現(xiàn)的慢性毒性作用及其劑量一

反應(yīng)關(guān)系，特別是進(jìn)行性的不可逆毒性作用及腫

瘤疾患。并確定受試物的未觀察到有害作用劑

量，作為最終評(píng)定受試物能否應(yīng)用于保健食品的

依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

①動(dòng)物種類的選擇:原則上，宜選用接近人體代

謝特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因?yàn)楫?dāng)前已掌握大、小

鼠各品系的特點(diǎn)及誘發(fā)腫瘤的敏感性，可優(yōu)先用

于慢性毒性和致癌試驗(yàn)；慢性毒性試驗(yàn)嚙齒類動(dòng)

物用大鼠，致癌試驗(yàn)大小鼠均可。對(duì)活性不明的

受試物，則宜用兩種性別的嚙齒類和非嚙齒類動(dòng)

物。

②動(dòng)物起始周齡和體重:一般用雌、雄兩種性別

的斷乳大鼠或小鼠。動(dòng)物個(gè)體體重的變動(dòng)范圍不

應(yīng)超出各性別平均體重的20%o

③腫瘤自發(fā)率:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自然腫瘤發(fā)生率原則

是控制到越低越好，但試驗(yàn)結(jié)束評(píng)價(jià)時(shí)主