非變性II型膠原蛋白編制說明

《非變性II型膠原蛋白》行業(yè)標準編制說明一、工作簡況1.任務來源本標準的制定任務來源于工業(yè)和信息化部2023年下達的第一批行業(yè)標準制定通知（工信廳科〔2023〕18號）中《非變性II型膠原蛋白》項目（計劃號為2023-0500T-QB）。該標準歸口單位為全國食品工業(yè)標準化技術委員會。本標準的主要起草單位有中國標準化研究院、安徽盛美諾生物技術有限公司、仙樂健康科技股份有限公司、同仁堂健康股份有限公司、中國科學院過程工程研究所、完美（中國）有限公司。主要起草人、工作單位及分工見下表1。表SEQ表\*ARABIC1標準主要起草人、工作單位及分工序號姓名工作單位職稱/職務分工標準主持起草人，負責國內外相關標準、法律、法規(guī)資料的收集，企業(yè)調研的組織實施，標準起草和編制說明的撰寫、組織、協(xié)調等。標準主要起草人，參與標準草案討論、參與企業(yè)調研，負責試驗方法的研究與開發(fā)等。標準主要起草人，負責國內外相關標準資料的收集、參與標準草案討論、參與企業(yè)調研等。標準主要起草人，參與標準草案討論、參與企業(yè)調研，負責試驗方法的研究與開發(fā)等。標準主要起草人，參與標準草案討論、參與企業(yè)調研，負責試驗方法的研究與開發(fā)等。參與標準草案討論、參與企業(yè)調研等。參與標準草案討論、參與企業(yè)調研等。參與標準草案討論、參與企業(yè)調研等。2.制定背景2.1產業(yè)現狀關節(jié)炎是世界頭號致殘性疾病，據統(tǒng)計全世界關節(jié)炎患者有3.55億人。為引起社會各界關注關節(jié)炎，世界衛(wèi)生組織把每年的10月12日定為“國際關節(jié)炎日”，用于提醒人們對關節(jié)炎要早預防、早診斷、早治療，防止致殘。近20年我國關節(jié)疾病的發(fā)病人數不斷攀升，骨關節(jié)炎是其中最常見的一種關節(jié)疾病。截止2015年統(tǒng)計，中國大陸的關節(jié)炎患者有1.2億人，發(fā)病率約為13%，平均每10個人就有1個人患病。目前我國60歲以上老人中，有一半以上飽受骨關節(jié)炎的困擾。同時由于年輕人運動不當和外傷導致的骨關節(jié)炎也越來越常見，骨關節(jié)炎已經出現了低齡化的趨勢。事實上，骨關節(jié)炎的致殘率可高達53%，骨關節(jié)炎引發(fā)疼痛和功能障礙的危害嚴重程度相當甚至大于心腦血管疾病，公眾對骨關節(jié)炎危害的認識還遠遠不夠?；颊呷巳荷仙秊殛P節(jié)炎的功能性食品和用藥市場帶來擴容。我國骨關節(jié)炎化學藥物市場規(guī)模從2008年的36.88億元增長到2015年的132.48億元，年復合增長率高達20.04%。預計骨關節(jié)炎的市場將會呈繼續(xù)走高的趨勢，在2018年整體市場規(guī)模或將會突破228億元。在國際醫(yī)藥市場上，以布洛芬、萘普生和雙氯芬酸為代表的3大消炎藥以及各種可的松類激素藥，長期以來一直占據骨關節(jié)病藥物市場的壟斷地位。20世紀90年代末，隨著以“萬絡”和“西絡寶”為代表的新一代COX-Ⅱ（環(huán)氧合酶-2）抑制劑類強力消炎藥物的崛起，布洛芬類老產品一枝獨秀的局面被打破。但隨著COX-Ⅱ致心肌梗死以及布洛芬、萘普生和雙氯芬酸引起胃出血等嚴重副作用的發(fā)生，美國等發(fā)達國家廠商開始嘗試開發(fā)治療關節(jié)疾病的新型保健食品，非變性II型膠原蛋白應運而生，其安全性高、無副作用，效果明顯已是未來10年倍受看好的品種。根據法國Frost&Sullivan調查數據顯示，非變性II型膠原蛋白2022年全球銷售總額達到1.54億美金，市場份額最大的地區(qū)為北美，占比為37.8.7%，其次為亞太地區(qū)（28.6%），歐洲（20.8%）、拉美（8.9%）和中東（3.9%）。其中中國占到亞太地區(qū)的銷售額70%以上，主要應用在促進關節(jié)健康的功能性食品中。2.2研究與應用現狀非變性II型膠原蛋白目前只有在美國、西班牙和日本這幾個國家生產，終端市場代表品牌如維骨力、鈣爾奇等都添加了該產品，以增強其改善關節(jié)的效果。2017年北京盛美諾生物技術有限公司與中國科學院過程工程研究所合作，采用自主研發(fā)專利技術，以動物軟骨為原料在低溫條件下生產出非變性II型膠原蛋白，打破了國外的技術壟斷，并取得了食品生產許可。2.3標準現狀目前我國已頒布實施的相關標準主要有GB／T31645《膠原蛋白肽》、GB/T22729《海洋魚膠原低聚肽》和QB2732《水解膠原蛋白》，這些標準規(guī)定的范圍都是降解成膠原蛋白肽的產品，但是非變性II型膠原蛋白的特點是非變性膠原蛋白質，以上標準均不適用。目前國內尚無非變性II型膠原蛋白相關國家標準或行業(yè)標準。2.4標準制定的目的意義非變性II型膠原蛋白是從動物軟骨中提取出的一種產品。膠原蛋白的工業(yè)化生產可追溯至20世紀40年代末，在食品中的應用始于20世紀70年代初，1999年獲批美國食品藥品管理局（FDA）普遍認為安全（GRAS）認證，2016年衛(wèi)計委將非變性II型膠原蛋白批準為普通食品。經科學實驗證實，非變性II型膠原蛋白能夠緩解關節(jié)疼痛，提高關節(jié)靈活性，改善骨關節(jié)炎，在國內外膳食補充劑中得到廣泛的應用。經調查發(fā)現非變性II型膠原蛋白市場魚龍混雜，非變性II型膠原蛋白成分含量沒法保障，讓消費者真假難辨。經抽樣檢測數據和廣泛市場調研顯示，目前市場上非變性II型膠原蛋白產品存在的問題包括非變性II型膠原蛋白純度存在極大差異；非變性II型膠原蛋白純度檢測方法不統(tǒng)一。市場的混亂嚴重制約了行業(yè)的健康發(fā)展，經查詢，國內尚無非變性II型膠原蛋白相關國家標準或行業(yè)標準，無標可依、無標可用，已成為非變性II型膠原蛋白產業(yè)亟需解決的重大問題。為了保證產品質量，急需制定一項規(guī)范非變性II型膠原蛋白質量的行業(yè)標準，以便更好地實現優(yōu)質優(yōu)價、規(guī)范市場秩序、保護消費者利益，滿足市場目前最迫切的標準需求，從而進一步促進產業(yè)發(fā)展。3.起草過程3.1成立標準起草工作組標準制定計劃下達后，2023年8月3日在中國標準化研究院召開了行業(yè)標準《非變性II型膠原蛋白》第一次起草工作會議，成立了標準起草工作組，并進行了任務分工。起草單位包括中國標準化研究院、安徽盛美諾生物技術有限公司、仙樂健康科技股份有限公司、同仁堂健康股份有限公司、中國科學院過程工程研究所。3.2確立工作計劃和標準制定原則按照工作任務要求，工作組進行了任務分解，制定了標準起草工作計劃和任務分工表。為保證標準的先進性和適用性，標準起草工作組在充分討論和研究的基礎上，明確了指標選擇與確定的以下原則：（1）結合實驗數據確定技術指標；（2）技術水平與生產實際相結合；（3）優(yōu)先體現質量引導和規(guī)范作用，兼顧可操作性。3.3形成標準草案標準起草工作組首先收集、翻譯和整理了國內外有關研究進展和先進國家的相關標準、法規(guī)等文獻資料，掌握了有關標準現狀；并對我國現有非變性II型膠原蛋白相關標準當中的術語、檢測方法和檢測指標等技術內容進行了歸納和總結，為標準文本的編制奠定理論基礎。在《非變性II型膠原蛋白》行業(yè)標準第一次起草工作會的基礎上，起草工作組及相關單位共同討論了《非變性II型膠原蛋白》行業(yè)標準的技術框架和主要內容，會后經匯總整理初步形成了標準草案。3.4形成標準討論稿和編制說明2023年11月9日，起草工作組組織相關單位和專家在廣東省汕頭市仙樂健康科技股份有限公司召開了第二次標準起草工作會議。來自中國檢驗檢疫科學院、中國農業(yè)大學、清華大學、北京聯(lián)合大學、廈門海關技術中心等單位的專家對《非變性II型膠原蛋白》行業(yè)標準草案中的英文名稱、范圍、規(guī)范性引用文件、質量等級規(guī)定等內容提出了詳細的意見，會后起草工作組根據專家意見，匯總整理和修改形成了標準討論稿及其編制說明。3.5開展非變性II型膠原蛋白產業(yè)調研和質量等級指標檢測2023年8月-2024年6月，起草工作組購買了國內市場上的非變性II型膠原蛋白產品，經查閱大量學術文獻，制定了科學嚴謹的質量指標檢測、評價實驗方案，并進行任務分工，隨后起草工作組對這些指標進行了檢測，得到30個樣本數據，并對數據進行了分析和處理，為標準中指標的確立提供了理論依據。3.6進行方法學驗證在前期工作的基礎上，起草工作組主要針對標準中理化指標中的非變性Ⅱ型膠原蛋白（以干基計）這一指標，開展了深入的方法學研究，最終形成氨基酸分析儀法和高效液相色譜法兩種檢測方法。起草工作組還對兩種方法進行驗證，并形成相應的驗證報告。3.7形成標準征求意見稿和編制說明在前期工作的基礎上，起草工作組綜合多次專家會討論結果，結合調研情況、檢測結果分析和方法學驗證報告，并經過多次討論修改形成了《非變性II型膠原蛋白》征求意見稿及編制說明。二、標準編制原則、主要內容及其確定依據1.編制原則為保證標準的先進性、科學性和適用性，標準起草工作組在充分討論和研究的基礎上，明確了標準制定的以下原則。1.1與法銜接，適當延伸遵循國家有關法規(guī)和強制性標準的前提下，有針對性的細化和豐富法規(guī)的內容和要求，如《食品安全法》、《農產品質量安全法》、《食用農產品市場銷售質量安全監(jiān)督管理辦法》等。1.2特點鮮明，目標明確首先，本標準為非變性Ⅱ型膠原蛋白的產品標準，主要對其技術要求、生產加工過程的衛(wèi)生要求、檢驗規(guī)則以及標簽、包裝、運輸、貯存，試驗方法等內容進行規(guī)定，又要明確適用目標，即適用于以雞胸軟骨為原料，經清洗、消毒、粉碎后加入氯化鉀、在低溫（≤45℃）條件下干燥、包裝等生產工藝制成的非變性Ⅱ型膠原蛋白產品的生產和質量評價。1.3科學適用，適度超前本標準通過廣泛的企業(yè)調研、技術研討、行業(yè)專家征求意見等方式，確保未來標準的執(zhí)行主體充分參與和征求意見，確保標準頒布后企業(yè)在進行產品生產時可執(zhí)行、可操作。既要對行業(yè)起到規(guī)范作用，又要引領行業(yè)發(fā)展。2.主要內容及其確定依據2.1“1范圍”本文件為產品標準，“范圍”第一段寫明了規(guī)定的內容，即對產品的技術要求、生產加工過程的衛(wèi)生要求、檢驗規(guī)則以及標簽、包裝、運輸、貯存等方面內容做出了規(guī)定與要求。需要注意的是，本文件規(guī)定的產品為“非變性Ⅱ型膠原蛋白”，其中也包括“Ⅱ型膠原蛋白軟骨粉”，故用括號的表述形式加以說明。另外，本文件還建立了非變性Ⅱ型膠原蛋白產品的檢測方法，并作為規(guī)范性附錄列出，在“范圍”中也表述說明一下?！胺秶钡诙螌懨髁诉m用范圍，即本文件可用于非變性Ⅱ型膠原蛋白產品的生產和質量評價，并對非變性Ⅱ型膠原蛋白進行展開說明，即以雞胸軟骨為原料，經清洗、消毒、粉碎后加入氯化鉀、在低溫（≤45℃）條件下干燥、包裝等生產工藝制成的產品，此處與后文“術語和定義”中相對應，在此處展開說明是為了讓標準使用者更加清晰的了解和適用本文件。2.2“3術語和定義”本文件只列出了“非變性Ⅱ型膠原蛋白”的術語和定義，目的是方便標準使用者了解該產品。該定義參考了眾多根據國內外文獻的論述，經專家們多次討論，最終整理修改而成。其中，魏永澤在《非變性Ⅱ型膠原蛋白提取工藝優(yōu)化及質量驗證》一文中，以新鮮雞胸軟骨作為原材料，清洗滅菌后進行破碎處理，經中性鹽及堿共作用的方法進行預處理后，使用酸法及酶法相結合的提取方法添加胃蛋白酶提取了非變性Ⅱ型膠原蛋白，指出Ⅱ型膠原蛋白作為關節(jié)軟骨細胞外間充質的主要結構性成分，其分子結構主要由3條相同的α1(Ⅱ)鏈以三螺旋的方式構成。周舒揚在《高效液相色譜法測定非變性Ⅱ型膠原蛋白含量的研究》一文中指出，膠原蛋白為三螺旋結構，不同類型的膠原蛋白在分布上有著不同的特點，性質上也存在不同，其中，Ⅱ型膠原蛋白具有致密的纖維結構，與多糖緊密結合，使軟骨具有柔韌性，可以吸收沖擊和承受負載。研究結果表明，非變性Ⅱ型膠原蛋白（保持完整三螺旋結構的II型膠原蛋白）在預防和改善關節(jié)炎方面具有良好的效果。特別注意的是，從基因表達的角度層面，非變性Ⅱ型膠原蛋白需要含由編碼alpha鏈的COL2A1基因表達的蛋白質，這也作為重點體現在了定義中。2.3“4技術要求”2.3.1“4.1原輔料”本產品的主要原料為雞胸軟骨，輔料為水和相應的食品添加劑，以上原輔料的質量要求均有相應的國家標準進行規(guī)定，選擇適合的標準，在本文件中依次羅列即可。值得注意的是，所列標準均為強制性國家標準。雞胸軟骨應符合GB2707《食品安全國家標準鮮（凍）畜、禽產品》的規(guī)定。該標準適用于鮮(凍)畜、禽產品，包括活畜(豬、牛、羊、兔等)、禽(雞、鴨、鵝等)宰殺、加工后，所得畜禽內臟、頭、頸、尾、翅、腳(爪)等可食用的產品，原料雞胸軟骨為鮮禽產品加工后所得，術語畜、禽副產品，在此范圍內。該標準中對相關產品的技術要求進行了規(guī)定：原料要求為屠宰前的活畜、禽應經動物衛(wèi)生監(jiān)督機構檢疫、檢驗合格；感官要求對產品色澤、氣味、狀態(tài)做了規(guī)定；理化指標要求揮發(fā)性鹽基氮≤15mg/100g；污染物限量要求符合GB2762中畜禽肉的規(guī)定；農藥殘留和獸藥殘留要求符合GB2763和國家有關規(guī)定和公告。水應符合GB5749《生活飲用水衛(wèi)生標準》的規(guī)定。該標準適用于各類生活飲用水，本產品中的水為食品生產原料，應符合相應規(guī)定。該標準中規(guī)定了生活飲用水水質常規(guī)指標及限值，包括各類微生物指標、毒理指標、感官性狀和一般化學指標、放射性指標等，還包括水源水質要求、衛(wèi)生要求等。食品添加劑氯化鉀應符合GB25585《食品安全國家標準食品添加劑氯化鉀》的規(guī)定。該標準適用于以氯化鎂和氯化鉀為主要成分的巖鹽光鹵石或海鹽生產的氯化鉀，經精制而得的食品添加劑氯化鉀，本產品適用了氯化鉀為生產中的食品添加劑，應符合相應規(guī)定。該標準中規(guī)定了氯化鉀的色澤和組織形態(tài)等感官要求，也規(guī)定了氯化鉀、干燥減重、酸堿度、碘和溴、鈉、重金屬、砷等理化指標，附錄中有以上指標對應的檢測方法。食品添加劑的使用量應符合GB2760《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》的規(guī)定，該標準規(guī)定了食品添加劑的使用原則、允許使用的食品添加劑品種、使用范圍及最大使用量或殘留量，本產品生產中使用的所有食品添加劑均應符合相關規(guī)定。2.3.2“4.2感官指標”本文件中對于非變性Ⅱ型膠原蛋白感官指標的確定經過了科學嚴謹的論證。首先是參考了相似的標準，如GB／T31645《膠原蛋白肽》和QB2732《水解膠原蛋白》中感官指標的描述；第二是起草工作組購買國內市場上的非變性II型膠原蛋白并進行質量指標檢測，得到30個樣本數據，并對數據進行了分析和處理，總結歸納了樣品中共性的感官指標，并對其進行描述；最后經專家反復討論與斟酌，最終確定了色澤、滋味及氣味、組織形態(tài)、雜質這4種感官指標，并對其要求進行了描述。同時這四種也是感官指標中最常用和典型的項目。GB／T31645《膠原蛋白肽》中對產品的感官要求有3種，分別為色澤要求白色或淡黃色；滋味、氣味要求具有產品應有的滋味和氣味，無異味；狀態(tài)為粉末狀或顆粒狀，無結塊，無正常視力可見的外來異物。同時規(guī)定了相應的感官指標檢驗方法。QB2732《水解膠原蛋白》中對產品的感官要求為水解膠原蛋白粉為白色或淡黃色粉末，應保持潔凈、均勻、無夾雜物；為透明或淡黃色液體，不應有異味、異臭以及肉眼可見雜質。綜上，將本產品的感官指標最終規(guī)定為色澤應為白色或淡黃色；滋味及氣味應具有產品特有的滋味和氣味，無其它異味；組織形態(tài)應呈粉末狀，無結塊；雜質應無正常視力可見的外來雜質。2.3.3“4.3理化指標”本文件中對于非變性Ⅱ型膠原蛋白理化指標的確定經過了科學嚴謹的論證。首先是參考了相似的標準，如GB／T31645《膠原蛋白肽》和QB2732《水解膠原蛋白》中理化指標的設置；第二是起草工作組購買國內市場上的非變性II型膠原蛋白并進行質量指標檢測，得到30個樣本數據，并對數據進行了分析和處理，選擇最重要的并能代表產品特質的理化指標；最后經專家反復討論與斟酌，最終確定了蛋白質（以干基計）、非變性Ⅱ型膠原蛋白（以干基計）、水分這3種理化指標，并對其數量值進行規(guī)定。GB／T31645《膠原蛋白肽》中對產品的理化指標規(guī)定有5項，分別為相對分子質量小于10000的膠原蛋白肽所占比例≥90%；羥脯氨酸（以干基計）≥3.0g/100g；總氮（以干基計）≥15.0g/100g；灰分≤7.0g/100g；水分≤7.0g/100g。同時規(guī)定了相應的理化指標檢驗方法，均為國家標準。QB2732《水解膠原蛋白》中對產品的理化指標規(guī)定有12項，項目較多，且分為水解膠原蛋白粉和水解膠原蛋白液分別規(guī)定，分別為水分、相對分子質量、蛋白質（質量分數）、透射比、灰分（質量分數）、二氧化硫、過氧化物、pH、水不溶物、鉻、砷、重金屬。綜上，本文件按照根據生產工藝，采用低溫干燥，將非變性II型的水分、蛋白質指標設定為：水分≤10.0g/100g，檢測方法按照GB5009.3第一法執(zhí)行，蛋白質≥45.00g/100g，檢測方法按照GB5009.5執(zhí)行，換算系數為5.79，參考QB2732《水解膠原蛋白》。而非變性II型膠原蛋白的特點是保留完整的膠原蛋白三螺旋結構，但是膠原蛋白在生產過程中，很容易變性，因此非變性II型膠原蛋白所占比例的限定是本文件要解決的關鍵問題。根據生產廠家的檢測結果，將非變性II型膠原蛋白含量定為6%以上。根據市場上主流生產廠家進行了調查，結果如下表2所示。通過多批次樣品的分析發(fā)現，各廠家產品中非變性II型膠原蛋白占比指標基本穩(wěn)定，能夠代表生產工藝技術水平。調研的6個廠家中，兩家個廠家產品中非變性II型膠原蛋白占比超過20%，一家超過10%，兩家產品的非變性II型膠原蛋白占比超過6%，另外一家?guī)缀跷礄z出有非變性II型膠原蛋白。將非變性II型膠原蛋白的含量定位為6%以上，旨在保障非變性II型膠原蛋白作為高端產品應有的工藝水平，指導生產廠商進一步優(yōu)化工藝技術。表2非變性II型膠原蛋白含量樣品編號123456非變性II型膠原蛋白含量（g/100g）22.9421.0911.236.366.17未檢出而對于非變性II型膠原蛋白占比例的測定方法，目前國內外文獻報道的非變性II型膠原蛋白測定方法主要包括酶聯(lián)免疫和液相色譜法，考慮到檢測成本和便捷性，行業(yè)內多采用液相色譜法進行檢測。因此，起草工作組擬在本文件中沿用該方法，詳見附錄A。換算系數參考NYT3608-2020畜禽骨膠原蛋白含量測定方法。2.3.4“4.4微生物限量”本文件中對于非變性Ⅱ型膠原蛋白微生物限量的確定經過了科學嚴謹的論證。首先是參考了相似的標準，如GB／T31645《膠原蛋白肽》和QB2732《水解膠原蛋白》中微生物限量的規(guī)定；第二是起草工作組購買國內市場上的非變性II型膠原蛋白并進行質量指標檢測，得到30個樣本數據，并對數據進行了分析和處理，在此過程中檢測了各類微生物指標；最后經專家反復討論與斟酌，最終確定了菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌這5種微生物限量指標，并對其限量進行了規(guī)定。GB／T31645《膠原蛋白肽》中對產品的微生物限量要求只有2種，分別為菌落總數和大腸菌群。同時規(guī)定了相應的微生物限量指標檢驗方法。QB2732《水解膠原蛋白》中對產品的微生物限量要求有3種，分別為菌落總數≤1000cfu/g或mL；大腸菌群≤30MPN/100g或mL；致病菌（沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）不應檢出。綜上，將本產品的微生物限量指標規(guī)定為菌落總數、大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，另外，根據企業(yè)生產實踐中的經驗，同時經專家反復討論，最終添加霉菌和酵母這一微生物限量指標，此為該產品生產過程中特別需要檢測與控制的微生物，并經歸納總結實踐經驗，將其限量值規(guī)定為≤50cfu/g。特別注意的是，其他指標的采樣方案及限量參考了QB2732《水解膠原蛋白》中的表述方式，同時也是微生物限量值的經典表述形式。2.3.5“4.5污染物”污染物應符合GB2762《食品安全國家標準食品中污染物限量》的規(guī)定。該標準規(guī)定了食品中鉛、鎘、汞、砷、錫、鎳、鉻、亞硝酸鹽、硝酸鹽、苯并[a]芘、N-二甲基亞硝胺、多氯聯(lián)苯、3-氯-1,2-丙二醇的限量指標。由于非變性Ⅱ型膠原蛋白是以雞胸軟骨為原料，經清洗、消毒、粉碎后加入氯化鉀，在低溫條件下干燥得到的含纖維狀蛋白質的軟骨粉，屬于肉制品，所以應符合GB2762中肉與肉制品的所有污染物類型的限量規(guī)定。2.3.6“4.6凈含量”產品的凈含量應符合JJF《定量包裝商品凈含量計量檢驗規(guī)則》的要求，此為預包裝食品凈含量都需遵守的標準與規(guī)定，屬于常識，不做詳細說明。2.4“5生產加工過程的衛(wèi)生要求”生產加工過程的衛(wèi)生要求應符合GB14881《食品安全國家標準食品生產通用衛(wèi)生規(guī)范》的規(guī)定。該標準規(guī)定了食品生產過程中原料采購、加工、包裝、貯存和運輸等環(huán)節(jié)的場所、設施、人員的基本要求和管理準則。該標準適用于各類食品的生產。非變性Ⅱ型膠原蛋白的生產過程同樣也應符合該標準的相關要求。2.5“6試驗方法”本章節(jié)規(guī)定了非變性Ⅱ型膠原蛋白的感官指標、理化指標、微生物限量指標、凈含量的試驗方法，屬于產品標準中必備的內容，與各類指標要求一一對應，明確列出各類指標的檢測方法。在產品標準中，檢測方法可以在各類指標的章節(jié)中羅列，也可以單獨成章，本文件將其單獨成章，可以更清晰明了。感官指標的試驗方法未有相應的國家標準進行規(guī)定，參考GB／T31645《膠原蛋白肽》中的表述：取2g試樣置于潔凈的燒杯中，用200mL溫開水配制成1%溶液，在自然光下觀察色澤和有無沉淀，聞其氣味，用溫開水漱口，品其滋味。本標準將其略做修改，同時加入觀察形態(tài)、色澤和雜質的內容，經專家反復討論后，表述為：稱取約5g樣品，散放在白色搪瓷平盤中，在自然光下直接觀察樣品的形態(tài)、色澤和雜質。聞味和品嘗，確定其氣味和滋味。蛋白質指標按GB5009.5《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》規(guī)定的方法測定，轉換系數為5.79。該標準規(guī)定了食品中蛋白質的測定方法，第一法凱氏定氮法和第二法分光光度法適用于各種食品中蛋白質的測定，第三法燃燒法則適用于蛋白質含量在10g/100g以上的糧食、豆類奶粉、米粉、蛋白質粉等固體試樣的測定。非變性Ⅱ型膠原蛋白按附錄A規(guī)定的方法測定。該方法屬于本文件中特有的新研制的非變性Ⅱ型膠原蛋白檢測方法，研制過程詳見附錄A的部分。水分指標按GB5009.3《食品安全國家標準食品中水分的測定》規(guī)定的第一法測定。該標準規(guī)定了食品中水分的測定方法，第一法為直接干燥法，適用于在101°C~105°C下，蔬菜、谷物及其制品、水產品、豆制品、乳制品、肉制品、鹵菜制品、糧食(水分含量低于18%)、油料(水分含量低于13%)、淀粉及茶葉類等食品中水分的測定，不適用于水分含量小于0.5g/100g的樣品。菌落總數指標按GB4789.2《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》規(guī)定的方法測定。該標準規(guī)定了食品中菌落總數的測定方法，適用于食品中菌落總數的測定。而菌落總數指的是食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數。大腸桿菌指標按GB4789.3《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》規(guī)定的方法測定。該標準規(guī)定了食品中大腸菌群計數的方法，第一法大腸菌群MPN計數法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數；第二法大腸菌群平板計數法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計數。而大腸桿菌指的是在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。霉菌和酵母指標按GB4789.15《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》規(guī)定的方法測定。該標準規(guī)定了食品中霉菌和酵母的計數方法，第一法霉菌和酵母平板計數法適用于各類食品中霉菌和酵母的計數。沙門氏菌指標按GB4789.4《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》規(guī)定的方法測定。該標準規(guī)定了食品中沙門氏菌的檢驗方法，適用于食品中沙門氏菌的檢驗。金黃色葡萄球菌指標按GB4789.10《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》規(guī)定的方法測定。該標準規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗方法，第一法金黃色葡萄球菌定性檢驗適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗；第二法金黃色葡萄球菌平板計數法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數；第三法金黃色葡萄球菌MPN計數適用于金黃色葡萄球菌含量較低的食品中金黃色葡萄球菌的計數。污染物與凈含量的試驗方法前往文中已有說明，在此不做贅述。2.6“7檢驗規(guī)則”本章節(jié)內容主要根據GB/T20001.10《標準編寫規(guī)則第10部分：產品標準》。該標準規(guī)定了產品標準中檢驗規(guī)則為可選要素，針對產品的一個或多個特性，給出測量、檢查、驗證產品符合技術要求所遵循的規(guī)則、程序或方法等內容。同時參考了QB2732《水解膠原蛋白》中檢驗規(guī)則的有關內容，同時經專家討論后形成此章節(jié)。由于本章節(jié)內容為產品標準中常見的典型的技術要素，不做展開說明。出場檢驗一節(jié)中規(guī)定了出場檢驗項目為感官要求、蛋白質、水分、菌落總數、大腸桿菌，應逐批檢驗，并出具檢驗報告。檢驗合格，方可出廠。型式檢驗一節(jié)中需檢測本文件中4.2、4.3、4.4規(guī)定的全部項目，并對需要進行型式檢驗的情形進行了羅列。抽樣一節(jié)中規(guī)定了抽樣的數量和方法，要求較明確，使用者可對照參考使用。2.7“8判定規(guī)則”本章節(jié)內容主要根據GB/T20001.10《標準編寫規(guī)則第10部分：產品標準》，要求每一類檢驗都需要有判定規(guī)則，即判定為產品合格或不合格的條件，形成“判定規(guī)則”的內容。本章主要針對“7檢驗規(guī)則”，分別羅列了出廠檢驗和型式檢驗后相應的判定規(guī)則。同樣屬于產品標準中常見的典型的技術要素，不做展開說明。無論是出廠檢驗還是型式檢驗，當檢測項目全部符合要求時則判為合格品，當微生物指標不符合要求或發(fā)現雜質，不得復檢，判為不合格品。而除微生物指標外，其他指標不符合要求的，可以進行復檢，相應的抽樣與附件規(guī)則均有詳細說明。2.8“99標志、標簽、包裝、運輸和貯存”本章節(jié)內容主要根據GB/T20001.10《標準編寫規(guī)則第10部分：產品標準》，其規(guī)定了產品標準中標志、標簽、隨行文件為可選要素，可作為相互補充的內容，只要有關應納入標準，特別是涉及消費品的產品標準，如有需要，標記的方法也應做出規(guī)定或建議。本文件規(guī)定產品標簽應符合GB7718《食品安全國家標準預包裝食品標簽通則》的要求，該標準適用于直接提供給消費者的預包裝食品標簽和非直接提供給消費者的預包裝食品標簽；同時應符合GB28050《食品安全國家標準預包裝食品營養(yǎng)標簽通則》的規(guī)定，該標準適用于預包裝食品營養(yǎng)標簽上營養(yǎng)信息的描述和說明。本文件規(guī)定外包裝標志應符合GB/T191《包裝貯運圖示標志》的規(guī)定。GB/T20001.10《標準編寫規(guī)則第10部分：產品標準》同時規(guī)定了產品標準中包裝、運輸和貯存為可選要素，需要時可規(guī)定產品的包裝、運輸和貯存條件等方面的技術要求，這樣既可以防止因包裝、運輸和貯存不當引起危險、毒害或污染環(huán)境，又可以保護產品。運輸要求的基本內容應包括運輸方式（指明運輸工具）、運輸條件（指明運輸時的要求，如遮蓬、密封、保溫等）和運輸中的注意事項（指明裝卸運方面的特殊要求，以及運輸危險物品的防護條件等）。貯存要求的基本內容包括貯存場所（指明庫存、露天、遮蓬等）、貯存條件（指明溫度、濕度、通風、有害條件的影響等）、貯存方式（指明單放、碼放等）、貯存期限（指明規(guī)定的貯存期限，貯存期內定期維護的要求，以及貯存期內的抽檢要求）。本文件中相關內容是根據生產實踐經驗，總結歸納，并經專家反復討論后確定的。特別需要注意的是，在符合本標準規(guī)定的貯存條件下，本產品保質期為36個月。2.9“附錄A”目前暫無相關非變性Ⅱ型膠原蛋白含量檢測方法的國家標準與行業(yè)標準。為了建立理化指標非變性Ⅱ型膠原蛋白含量對應的檢測方法，起草工作組進行了相關檢測方法的方法學研究與驗證。目前國內外文獻報道的非變性II型膠原蛋白測定方法主要包括氨基酸分析儀法、酶聯(lián)免疫和液相色譜法，考慮到檢測成本和便捷性，行業(yè)內多采用氨基酸分析儀法和液相色譜法進行檢測，因此，起草工作組擬在本文件中采用這兩種方法。參照YY/T1453-2016《組織工程醫(yī)療器械產品I型膠原蛋白表征方法》附錄B方法二進行了方法學研究與優(yōu)化，形成了高效液相色譜法；參照NY/T3130-2017《生乳中L-羥脯氨酸的測定》第三法測定酶解沉淀中羥脯氨酸的總含量進行了方法學研究與優(yōu)化，形成了氨基酸分析儀法。主要檢測原理為非變性II型膠原蛋白在室溫或者37℃下不被稀酸、蛋白酶所分解，而變性后的II型膠原蛋白或其他蛋白質能被稀酸、蛋白酶降解，因此通過稀酸和蛋白酶分步作用，將已經變性的II型膠原蛋白和其他雜蛋白降解為可溶性肽或者游離氨基酸去除，留下不溶性物質為非變性II型膠原蛋白，再將不溶性試樣在酸性條件下水解后的羥脯氨酸作為非變性Ⅱ型膠原蛋白的標志性水解產物，以羥脯氨酸標準品的保留時間定性，利用氨基酸分析儀采用外標法定量測定羥脯氨酸含量或濃度，通過羥脯氨酸與非變性Ⅱ型膠原蛋白換算系數換算后計算出非變性Ⅱ型膠原蛋白的含量。其中涉及到的換算系數很關鍵，起草工作組主要參考了NY/T3608-2020《畜禽骨膠原蛋白含量測定方法分光光度法》，該標準適用于以畜禽動物骨（包括雞、豬、牛、羊）為原料，經提取生產的蛋白質產品中膠原蛋白含量的測定。其中膠原蛋白換算系數指的是不同骨源或樣品中膠原蛋白含量與羥脯氨酸含量的比值，雞骨的膠原蛋白換算系數為7.4。起草工作組還對上述兩種檢測方法開展了科學嚴謹詳細的方法學驗證與比對并形成了驗證報告。對高效液相色譜法檢測羥脯氨酸含量的驗證中，選用了安徽盛美諾生物技術有限公司的非變性II型膠原樣品（20240409F）、源葉公司的L-羥脯氨酸對照品；對方法的線性范圍進行了驗證，結果表明選取25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL5個點，在L-羥脯氨酸濃度為25μg/ml~500μg/ml的范圍內峰面積呈線性；對方法檢出限和定量限進行驗證，結果為檢出限是2.97μg/ml(試劑空白、3倍信噪比)，定量限是9.90μg/ml(樣品空白、10倍信噪比)；依照GB/T27417-2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》，對儀器重復性進行了測定，取25mg/L標品，做6個平行，計算標準偏差，結果表明相對標準偏差為1.84%，滿足方法要求；依照GB/T27417-2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》，對精密度進行了測定。取盛美諾20240409F樣品，按方法獨立測定6次，計算標準偏差，結果表明相對標準偏差為1.32%，符合方法要求；采用加標回收的方法對準確度進行測定，取盛美諾20240409F樣品分別加標L-羥脯氨酸標準物質2.5mg、10.0mg，分別做6個平行，計算結果、測定回收率，結果表明加標實驗數據回收率分別為103.5%、101.9%，符合質控標準GB/T27417-2017方法要求。對氨基酸分析儀方法檢測羥脯氨酸含量的驗證中，選用了安徽盛美諾生物技術有限公司的非變性II型膠原樣品（20240317F）、源葉公司的L-羥脯氨酸對照品；對方法的線性范圍進行了驗證，結果表明選取10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL5個點，在L-羥脯氨酸濃度為10μg/ml~80μg/ml的范圍內峰面積呈線性，R=0.9999；對方法檢出限和定量限進行驗證，結果為檢出限是0.39μg/ml(試劑空白、3倍信噪比)，相當于固體樣品中羥脯氨酸含量為1.95mg/g,定量限是1.56μg/ml(樣品空白、10倍信噪比),相當于固體樣品中羥脯氨酸含量為7.8mg/g；依照GB/T27417-2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》，對儀器重復性進行了測定，取20mg/L標品，做6個平行，計算標準偏差，結果表明相對標準偏差為0.28%，滿足方法要求；依照GB/T27417-2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》，對精密度進行了測定。取盛美諾20240317F樣品，按方法獨立測定6次，計算標準偏差，結果表明相對標準偏差為2.79%，符合方法要求；采用加標回收的方法對準確度進行測定，取盛美諾20240317F樣品分別加標L-羥脯氨酸標準物質0.5mg、2.0mg，分別做6個平行，計算結果、測定回收率，結果表明加標實驗數據回收率分別為102%、100%，符合質控標準GB/T27417-2017方法要求。還對上述兩種方法進行了F檢驗和T檢驗，并對標準品進行了檢測。在F檢驗中，取20240411F批次非變性樣品進行前處理酶解，自由度：1，水解冷卻定容后分別取2ml蒸干，2ml復溶，分別用氨基酸分析儀法和液相色譜衍生發(fā)測定6次，參照RB/T208-2016《化學實驗室質量對比比對實驗》中對比試驗結果評價。經計算，并查F臨界值表，得F0.05(1,5)=6.61，由于F=S_大^2/S_小^2=1.213＜F0.05(1,5)=6.61，兩種結果無顯著差別。在T檢驗中，自由度為10，顯著性水平為0.05時，在表中找到對應的t值為1.81，帶入公式計算出來的t值為0.45，t計算<t0.05，10，故兩種方法測定結果不存在顯著差異。在標準品檢測中，取中科院過程工程研究所的牛源II型膠原蛋白（20mg/瓶）標準品一瓶，批號20211001，羥脯氨酸含量10.91%±0.42%。直接用鹽酸水解定容，分別