細(xì)菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)應(yīng)用與進(jìn)展學(xué)習(xí)培訓(xùn)課件

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)應(yīng)用與進(jìn)展細(xì)菌內(nèi)毒素檢測技術(shù)的應(yīng)用與進(jìn)展1、熱原2、歷史回顧---鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查3、BET的發(fā)展趨勢與特點

21、熱原熱原是指臨床上能引起哺乳動物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)Webster最先把熱原定義為“致熱劑”早期的熱原研究靜脈療法的研究與熱原的研究密切相關(guān)在18、19世紀(jì)有很多關(guān)于靜脈療法的報道，所有病人在注射后都伴隨有發(fā)熱反應(yīng)，當(dāng)時的醫(yī)生都深信發(fā)熱對人體有益

31912年，Hort和Penfold闡明注射發(fā)熱的真正本質(zhì)，將細(xì)菌分為熱原和非熱原兩種：革蘭氏陰性細(xì)菌為熱原細(xì)菌革蘭氏陽性細(xì)菌為非熱原細(xì)菌他們推斷所有的注射發(fā)熱都是由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生一種可濾過的、熱穩(wěn)定的物質(zhì)導(dǎo)致的1、熱原41、熱原熱原的檢測1941年，美國USP、FDA和NIH（美國國家衛(wèi)生研究所）邀請了14個制藥廠商參與第一次的熱原協(xié)作研究1942年，美國藥典第一次收載熱原檢查法該方法是將一定量的供試品通過靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況來判定供試品中熱原含量是否符合規(guī)定52、歷史回顧---鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查細(xì)菌內(nèi)毒素檢查(BET)通常稱使用鱟試劑來檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的方法為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。國際歷史1956年，美國科學(xué)家FredericBang發(fā)表論文《鱟的一種細(xì)菌性疾病》，闡述了細(xì)菌內(nèi)毒素使鱟血凝固的現(xiàn)象。隨后，Bang和Levin發(fā)明了鱟試劑。1980年，F(xiàn)DA發(fā)表使用鱟試劑檢查人用和獸用注射藥終成品內(nèi)毒素的指引；美國藥典20版（USPXX）第一次收載BET法61989年英國藥典收載BET法1991年日本藥局方收載BET法1999年，USPXXIV版規(guī)定670種藥品用BET法檢查，保留熱原檢查的藥品約20種2000年，國際協(xié)調(diào)委員會使USP、EP和JP達(dá)成《BET的國際協(xié)調(diào)方案》，統(tǒng)一的BET法收載于USPXXIV版NF19的第二增補(bǔ)本中，并于2001年1月1日生效2、歷史回顧---鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查72、歷史回顧---鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查2011年，美國FDA撤銷了1987年發(fā)布的鱟試驗指南和1991年發(fā)布的動態(tài)法檢測臨時指南2012年，美國FDA發(fā)布了“行業(yè)指南，熱原和內(nèi)毒素檢測：問與答”國內(nèi)歷史1983年，由11個單位參加的衛(wèi)生部鱟試劑研究協(xié)作組的成立1988年，衛(wèi)生部頒布《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》和鱟試劑標(biāo)準(zhǔn)。1991年，衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定4種藥品可使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法81993年，中國藥典（Ch.P.）九零版第二增補(bǔ)本收載BET法1995年版Ch.P.規(guī)定13個品種使用BET法2000年，Ch.P.2000版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查品種增至69種；附錄《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則》中收錄了BET定量法2005年，Ch.P.2005版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查品種增至205種；BET法正式收載光度測定法。2010年，Ch.P.2010版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查品種增至506種。2、歷史回顧---鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查93、BET發(fā)展趨勢與特點BET技術(shù)的發(fā)展趨勢細(xì)菌內(nèi)毒素檢查取代熱原檢查自19世紀(jì)80年代FDA批準(zhǔn)鱟試驗的應(yīng)用以來，BET法所具有的優(yōu)點：快速、靈敏、可標(biāo)準(zhǔn)化等，表明它比熱原檢查法更適應(yīng)現(xiàn)代制藥工業(yè)的發(fā)展各國藥典規(guī)定的BET檢查品種都經(jīng)歷了從無到有，從少到多的過程BET取代熱原檢查已成為趨勢10趨向統(tǒng)一的BET法在早期各國頒布的BET法不盡相同，不利于藥品的全球流通WHO實現(xiàn)了內(nèi)毒素的國際標(biāo)準(zhǔn)品（IS）的效價（IU）與各國內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的效價（EU）的統(tǒng)一，即1IU=1EU11國際協(xié)調(diào)委員會綜合USP、EP、JP的BET法，達(dá)成一個國際協(xié)調(diào)案——統(tǒng)一的BET法，于2001年實施中國藥典2010年版的BET法基本參照國際統(tǒng)一的BET法12BET技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展的特點BET方法呈多樣化凝膠法比濁法動態(tài)比濁法終點比濁法比色法動態(tài)比色法終點比色法湛江安度斯在BET方法學(xué)及BET技術(shù)發(fā)展的貢獻(xiàn)發(fā)明專利1：同體系模型法發(fā)明專利2：動態(tài)終點法發(fā)明專利3：細(xì)菌內(nèi)毒素快速檢測盒發(fā)明專利4：定量法專用內(nèi)毒素套盒發(fā)明專利5：微量顯色法13BET技術(shù)趨向自動化凝膠法恒溫設(shè)備方面，干式恒溫儀器逐步取代水浴恒溫箱定量BET試管式定量檢測儀酶標(biāo)板式定量檢測儀全自動的BET系統(tǒng)專用的數(shù)據(jù)軟件湛江安度斯公司TAL-40型試管恒溫儀（凝膠法）BET專用軟件——生物探針14BET試劑的發(fā)展鱟試劑的靈敏度越來越高凝膠法最高達(dá)0.0075EU/ml商品試劑0.015EU/ml定量法高達(dá)0.0005EU/ml鱟試劑抗干擾性能更強(qiáng)干擾BET的因素：pH值、離子濃度、干擾物質(zhì)湛江安度斯湛江安度斯是國內(nèi)唯一能批量生產(chǎn)超高靈敏度鱟試劑的廠家權(quán)威的研究報告表明：安度斯公司的鱟試劑具有較強(qiáng)的抗干擾性能及良好的相容性15BET輔劑的應(yīng)用緩沖劑：調(diào)節(jié)pH值稀釋劑：補(bǔ)充二價陽離子抗增液：增強(qiáng)抗β-葡聚糖的能力分散劑：使內(nèi)毒素均勻分布指示劑：檢驗設(shè)備高溫滅活內(nèi)毒素的能力鱟試劑特異性更好試劑特異性的重要性相關(guān)法規(guī)對試劑特異性的要求特異性試劑的種類16高科技的產(chǎn)物---便攜式生物檢測系統(tǒng)（PTS）快捷、方便的檢測儀可作快速、定量的BET（7~15分鐘）β-葡聚糖的檢測革蘭氏細(xì)菌快速鑒別——取代傳統(tǒng)的染色法微量蛋白的快速測定應(yīng)用領(lǐng)域：制藥、醫(yī)學(xué)、食品衛(wèi)生、環(huán)保1