奶綿羊胚胎冷凍技術(shù)規(guī)程

1奶綿羊胚胎冷凍技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了奶綿羊體內(nèi)胚胎形態(tài)鑒定與程序化冷凍技術(shù)要點(diǎn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于奶綿羊的體內(nèi)胚胎程序化冷凍保存。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1571-2007羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1674-2008牛羊胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1奶綿羊dairysheep指以產(chǎn)奶為主要生產(chǎn)方向的綿羊品種。3.2胚胎冷凍embryofrozen將胚胎和冷凍液裝入冷凍管中，經(jīng)過一定的降溫方式將胚胎保存于-192℃~-196℃的環(huán)境中，使其代謝和發(fā)育處于暫時(shí)停頓狀態(tài)、溫度恢復(fù)后仍能正常發(fā)育的一種保存方法。3.3植冰seeding又稱誘發(fā)結(jié)晶，溶液在溫度達(dá)到冰點(diǎn)時(shí)不結(jié)冰，待降到冰點(diǎn)以下一定溫度才結(jié)冰，這種現(xiàn)象叫做超冷現(xiàn)象。植冰是指在略低于溶液冰點(diǎn)的溫度下通過加入冰母或強(qiáng)行冷卻的方式誘導(dǎo)溶液結(jié)冰，以防止超冷現(xiàn)象的出現(xiàn)，阻止核冰晶的自動形成。3.4胚胎解凍embryothawing是指將保存在液氮中的冷凍胚胎在應(yīng)用前進(jìn)行解凍處理，把冷凍保護(hù)劑逐步置換出來，恢復(fù)胚胎的活力。24胚胎形態(tài)鑒定供體羊發(fā)情后D5.5～6.5體內(nèi)生產(chǎn)的胚胎按《羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程》（NY/T1571-2007）使用體式顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，形態(tài)示意圖見附錄A。5胚胎冷凍保存5.1胚胎冷凍所需器材體視顯微鏡、胚胎冷凍儀、液氮灌、胚胎吸管、0.25mL塑料冷凍麥管、麥管塞、裝管器、玻璃細(xì)管、0.22μm針頭式細(xì)菌濾器、培養(yǎng)皿（35mm）、記號筆、標(biāo)簽紙。5.2胚胎冷凍所需溶液保存液：含0.4%牛血清白蛋白（w/v）的PBS液。冷凍液Ⅰ：含1.5M乙二醇的保存液。冷凍液Ⅱ：含10%甘油（v/v）的保存液。冷凍液Ⅲ：含6%甘油（v/v）的保存液。冷凍液Ⅳ：含3%甘油的（v/v）保存液。解凍液Ⅰ：含0.25M蔗糖的保存液。解凍液Ⅱ：含1M蔗糖的保存液。解凍液Ⅲ：含0.3M蔗糖+3%甘油（v/v）的保存液。解凍液Ⅳ：含0.3M蔗糖+6%甘油（v/v）的保存液。5.3胚胎操作室要求溫度在20℃~25℃之間，操作前使用不低于1.5W/m的紫外燈消毒20min～30min，工作區(qū)用70%酒精擦拭消毒。5.4胚胎選擇根據(jù)形態(tài)選擇發(fā)育期為早期桑椹胚（EM）、緊縮桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（BL）和擴(kuò)張囊胚期（EXB）的A、B（1、2）級胚胎（附錄A圖A.2、A.3）進(jìn)行冷凍。5.5胚胎的洗滌與平衡5.5.1乙二醇冷凍液冷凍胚胎的洗滌與平衡胚胎冷凍前在保存液洗滌5次～6次；洗滌后的胚胎放入冷凍液Ⅰ中，室溫下平衡15min～20min。5.5.2甘油冷凍液一步法胚胎冷凍的洗滌與平衡胚胎冷凍前在保存液洗滌5次～6次；洗滌后的胚胎放入冷凍液Ⅱ中，室溫下平衡15min～20min。5.5.3甘油冷凍液三步法胚胎冷凍的洗滌與平衡胚胎冷凍前在保存液洗滌5次～6次；洗滌后的胚胎依次放入冷凍液Ⅳ、Ⅲ和Ⅱ中，每種冷凍液中室溫下平衡4min～5min。35.6胚胎裝管將胚胎按五段法裝入冷凍麥管，裝管順序：冷凍液（1.0cm～1.5cm）-氣泡（0.2cm～0.4cm）-冷凍液（1.5cm～2.0cm）-氣泡（0.2cm～0.4cm）-冷凍液加胚胎（2.0cm～3.0cm）-氣泡（0.2cm～0.4cm）-冷凍液（1.5cm～2.0cm）-氣泡（0.2cm～0.4cm）-冷凍液（1.0cm～1.5cm），示意圖見附錄B，每支裝1枚～10枚相同發(fā)育期、相同級別胚胎。5.7胚胎記錄在標(biāo)簽紙上打印記錄胚胎信息，包括胚胎的母本品種、母本耳號、父本品種、父本耳號、數(shù)量、發(fā)育期、質(zhì)量以及冷凍日期，粘貼于麥管上。數(shù)量、發(fā)育期、質(zhì)量標(biāo)注方式為XEM/CM/EB/BL/EXB1/2，其中X表示數(shù)量，EM/CM/EB/BL/EXB表示發(fā)育期，下標(biāo)1/2表示A/B級胚胎級別。如2CM1代表2枚A級緊縮桑椹胚，2CM2代表2枚B級緊縮桑椹胚。5.8冷凍程序5.8.1乙二醇冷凍液冷凍胚胎程序胚胎冷凍麥管由室溫直接置入-6.0℃的程控冷凍儀，平衡4min～5min后，在-6.0℃時(shí)植冰1s～3s，繼續(xù)平衡5min，然后以-0.3～-0.5℃/min的速率降溫至-35℃,平衡10min，取出胚胎冷凍麥管，直接投入液氮中臨時(shí)保存。同時(shí)在標(biāo)簽與記錄本上詳細(xì)記錄胚胎信息，胚胎冷凍信息登記表見附錄C表C.1。5.8.2甘油冷凍液冷凍胚胎程序胚胎冷凍麥管由室溫直接置入-6.5℃的程控冷凍儀，平衡4min～5min后，在-6.5℃時(shí)植冰1s～3s，繼續(xù)平衡5min，然后以-0.3℃/min～-0.5℃/min的速率降溫至-35℃,平衡10min，取出胚胎冷凍麥管，直接投入液氮中臨時(shí)保存。同時(shí)在標(biāo)簽與記錄本上詳細(xì)記錄胚胎信息，冷凍胚胎信息登記表見附錄C表C.1。5.9冷凍胚胎貯存根據(jù)冷凍胚胎信息放入液氮罐中的相應(yīng)位置，及時(shí)補(bǔ)充液氮。5.10胚胎解凍5.10.1一步法解凍程序解凍時(shí)，從罐中取出細(xì)管在空氣中停留10s～15s后，浸入28℃~32℃水浴中20s，然后將胚胎冷凍麥管用滅菌吸水紙擦干，用70%酒精棉球擦拭麥管，晾干15s～20s，拔去細(xì)管塞，把胚胎推出，乙二醇冷凍液冷凍胚胎置入解凍液Ⅰ中、甘油冷凍液冷凍胚胎置入解凍液Ⅱ中平衡4min～5min，然后在保存液中洗5次～6次，鏡檢備用。同時(shí)在記錄本上詳細(xì)記錄胚胎信息，解凍胚胎信息登記表見附錄C表C.2。5.10.2三步法解凍程序解凍時(shí)，從罐中取出細(xì)管在空氣中停留10s～15s后，浸入25℃~32℃水浴中20s，然后將胚胎冷凍麥管用滅菌吸水紙擦干，用70%酒精棉球擦拭麥管，晾干15s～20s，拔去細(xì)管塞，把胚胎推出后，依次置入解凍液Ⅳ、Ⅲ和Ⅱ中平衡4min～5min，然后在保存液中洗5次～6次，鏡檢備用。同時(shí)在記錄本上詳細(xì)記錄胚胎信息，解凍胚胎信息登記表見附錄C表C.2。45.11胚胎復(fù)蘇檢測胚胎解凍后，使用體式顯微鏡觀察，解凍后的胚胎發(fā)育階段和質(zhì)量按《牛羊胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程》（NY/T1674-2008）進(jìn)行。胚胎解凍信息登記表見附錄C表C.2。5（資料性附錄）不同級別胚胎形態(tài)圖圖A.1不同發(fā)育階段早期胚胎D：囊胚（blastocyst，BL）；E：擴(kuò)張囊胚（expandedblastoc圖A.2A級胚胎）；）；圖A.3B級胚胎注：A：桑椹胚（morula，M）；B：緊縮桑椹胚（compac圖A.4C級和D級胚胎注：A：C級桑椹胚（morul