黑土地土壤微生物肥力評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程

2黑土地土壤微生物肥力評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了土壤微生物肥力的術(shù)語和定義、土壤樣品的采集、制備及基礎(chǔ)指標(biāo)測(cè)定、土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)及測(cè)定和土壤微生物肥力評(píng)價(jià)方法。本文件適用于內(nèi)蒙古黑土地土壤微生物肥力的等級(jí)劃分。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB20287農(nóng)用微生物菌劑GB/T32723土壤微生物生物量的測(cè)定底物誘導(dǎo)呼吸法GB/T33469耕地質(zhì)量等級(jí)NY/T52-1987土壤水分測(cè)定法NY/T1121.1土壤檢測(cè)第1部分：土壤樣品的采集、處理和貯存LY/T1220森林土壤呼吸強(qiáng)度的測(cè)定3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1土壤微生物肥力Soilmicrobialfertility指生活在土壤中的微生物，其生物過程對(duì)土壤的物理和化學(xué)特性起到良好的促進(jìn)和維持作用，并為植物的生長發(fā)育提供所需養(yǎng)分的能力。3.2土壤微生物生物量Soilmicrobialbiomass單位土壤中體積小于5×103μm3微生物的總重量。3.3土壤呼吸強(qiáng)度soilrespirationquotient單位時(shí)間內(nèi)從單位面積土壤中釋放出來的二氧化碳量。4土壤樣品的采集、制備及基礎(chǔ)指標(biāo)測(cè)定34.1采樣單元確定根據(jù)所評(píng)價(jià)樣地受自然及人為因素對(duì)土壤微生態(tài)系統(tǒng)影響的需要，按地形、土壤條件、土地利用方式、氣候條件、耕作以及施肥方式等分為若干個(gè)采樣單元。4.2采樣時(shí)間土壤微生物取樣原則上在植物生長旺盛期、即土壤生物多樣性和功能最高的時(shí)期采樣。在耕地類型下，選擇在作物生長旺盛期進(jìn)行，內(nèi)蒙古東北區(qū)采集時(shí)間為6月-7月，在野外采樣時(shí)，應(yīng)根據(jù)區(qū)域天氣和農(nóng)業(yè)管理?xiàng)l件的變化，避開降雨等天氣、以及施肥和灌溉等管理時(shí)期。4.3采樣方法4.3.1樣地設(shè)置同一采樣單元內(nèi)按照均勻、隨機(jī)、等量和多點(diǎn)混合的原則進(jìn)行。用GPS定位儀確定采樣地點(diǎn)的地理位置（經(jīng)緯度），在平原區(qū)地形可設(shè)置為100m×100m正方形，在丘陵山區(qū)狹長地帶可選擇50m×200m的長方。每個(gè)采樣單元不少于20個(gè)樣地。4.3.2樣品采集每個(gè)樣地按照“五點(diǎn)梅花式”采集。采集深度為0cm～20cm土層，挖掘時(shí)先去除土壤上面的覆蓋物，包括植物、苔蘚、可見根系、凋落物，以及可見的土壤動(dòng)物等，用酒精消毒過的干凈鐵鍬或小鏟沿土壤剖面垂直向下挖，五點(diǎn)混合后為一個(gè)樣地的代表樣品，以1kg左右為宜，若采集的樣品量過多時(shí)，可用四分法將多余的土壤棄去，最后保留300g～500g。4.4樣品保存將土樣放入無菌袋中并在袋上寫清采樣編號(hào)后立即放于4℃冷藏箱或者冰袋中保存，盡快以低溫鮮樣運(yùn)輸方式郵寄回實(shí)驗(yàn)室后，除去土壤中可見的動(dòng)植物殘?bào)w，一部分新鮮土樣保藏于4℃冰箱，在一周內(nèi)完成可培養(yǎng)微生物數(shù)量、酶活性、微生物量碳和氮的測(cè)定，另一部分土樣風(fēng)干后過2mm篩，再選取一定量的土樣用四分法過100目篩，用于土壤有機(jī)碳含量的測(cè)定。4.5土壤含水量和有機(jī)碳的測(cè)定土壤含水量的測(cè)定按照NY/T52-1987的規(guī)定進(jìn)行，土壤有機(jī)碳的測(cè)定按照GB/T33469-2016中附錄C的規(guī)定進(jìn)行。5土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)及測(cè)定5.1土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)建立按特爾斐法，參見附錄A。具體評(píng)價(jià)項(xiàng)目包括微生物數(shù)量(可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量、放線菌、真菌數(shù)量)、微生物生物量(微生物生物量碳和氮)、土壤酶活性(脲酶、磷酸酶、過氧化氫酶蔗糖酶、纖維素酶、硝酸還原酶和多酚氧化酶)和微生物活性(微生物熵)，其中微生物熵計(jì)算如公式(1)：qSMBC=Cmic/Corg(1)式中：4qSMBC——微生物熵Cmic——微生物生物量碳Corg——土壤有機(jī)碳5.2評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定5.2.1微生物數(shù)量測(cè)定土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法，按照GB20287中6.3.2的規(guī)定進(jìn)行，所用培養(yǎng)基及其配制方法分別按照GB20287的附錄A中A.1、A.6和A.7的規(guī)定進(jìn)行，單位換算成每克干土中所含的菌落數(shù)。5.2.2微生物生物量測(cè)定土壤微生物生物量測(cè)定應(yīng)按照GB/T32723的規(guī)定進(jìn)行。5.2.3土壤酶活性測(cè)定5.2.3.1纖維素酶活性纖維素酶活性測(cè)定應(yīng)按照GB20287的附錄D中D.1的規(guī)定進(jìn)行。5.2.3.2蔗糖酶活性蔗糖酶活性以蔗糖為底物，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，具體方法按照T/NAIA010的規(guī)定進(jìn)5.2.3.3脲酶活性脲酶活性以尿素為底物，采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定，具體方法按照T/NAIA011的規(guī)定進(jìn)行。5.2.3.4磷酸酶活性磷酸酶活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法，具體方法按照T/NAIA012的規(guī)定進(jìn)行。5.2.3.5過氧化氫酶活性過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，具體方法按照T/NAIA013的規(guī)定進(jìn)行。5.2.3.6硝酸還原酶活性硝酸還原酶采用酚二磺酸比色法測(cè)定，具體方法按附錄B中B.1的規(guī)定進(jìn)行。5.2.3.7多酚氧化酶活性多酚氧化酶活性用底物（左旋多巴（L-DOPA分光光度法測(cè)定，具體方法按附錄B中B.2的規(guī)定進(jìn)行。5.2.3.8土壤呼吸強(qiáng)度的測(cè)定土壤呼吸強(qiáng)度測(cè)定應(yīng)按照LY/T1220的規(guī)定進(jìn)行。6土壤微生物肥力評(píng)價(jià)方法56.1土壤微生物肥力指數(shù)模型采用主成分分析法確定單項(xiàng)評(píng)價(jià)因子的權(quán)重值Ki。根據(jù)作用效應(yīng)曲線，建立隸屬度函數(shù)，計(jì)算各評(píng)價(jià)因子的隸屬度值Ci。利用模糊數(shù)學(xué)中加權(quán)和法建立土壤微生物肥力指數(shù)模型，將所選的單個(gè)因子的評(píng)價(jià)結(jié)果轉(zhuǎn)換為由各評(píng)價(jià)因子構(gòu)成的土壤微生物肥力綜合評(píng)價(jià)。土壤微生物肥力指數(shù)模型如公式(2)：MIF=Σ…………式中：MIF——土壤微生物肥力綜合指數(shù)；ki——第i個(gè)評(píng)價(jià)因子的組合權(quán)重；ci——第i個(gè)評(píng)價(jià)因子的隸屬度值；n——評(píng)價(jià)因子的個(gè)數(shù)。6.2單因素評(píng)價(jià)6.2.1單因素評(píng)價(jià)模型的選擇土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量、微生物生物量碳、氮、微生物熵及酶活性均屬于S型隸屬函數(shù)，各評(píng)價(jià)因素的隸屬函數(shù)可簡(jiǎn)化為公式(3)：…………（3）式中：f(x)——隸屬函數(shù)x——評(píng)價(jià)因素xo——評(píng)價(jià)因素的上臨界值6.2.2隸屬函數(shù)閾值上限的確定采用累積頻率曲線來確定隸屬函數(shù)閾值上限，一組樣本x1,x2,...xn，給定某一閾值X0，不大于X0的樣本數(shù)為m，則稱m/n為不大于X0的累積頻率，計(jì)算就得到累積頻率曲線。以所有被測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)累積頻率為75%的指標(biāo)值作為隸屬函數(shù)的閾值上限。6.3評(píng)價(jià)項(xiàng)目的權(quán)重參照表1規(guī)定的層次分析法，建立目標(biāo)層、準(zhǔn)則層(微生物數(shù)量、活性和微生物生物量)和評(píng)價(jià)項(xiàng)目層層次結(jié)構(gòu)，構(gòu)建判斷矩陣。經(jīng)層次單排序及其一致性檢驗(yàn)，計(jì)算并確定所有評(píng)價(jià)項(xiàng)目對(duì)黑土地微生物肥力(目標(biāo)層)相對(duì)重要性的排序權(quán)重值。表1黑土地土壤微生物肥力評(píng)價(jià)因子總集黑土地土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)準(zhǔn)則層指標(biāo)層準(zhǔn)則層指標(biāo)層微生物數(shù)量指標(biāo)可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量土壤酶活性指標(biāo)脲酶可培養(yǎng)真菌數(shù)量磷酸酶可培養(yǎng)放線菌數(shù)量過氧化氫酶微生物生物量指標(biāo)微生物生物量碳蔗糖酶微生物生物量氮纖維素酶6微生物活性指標(biāo)微生物熵硝酸還原酶土壤呼吸強(qiáng)度多酚氧化酶6.4土壤微生物肥力綜合評(píng)價(jià)根據(jù)6.2.2確定的閾值上限，利用公式(3)計(jì)算各個(gè)土壤樣品的隸屬度值。然后應(yīng)用公式(2)中所建立的土壤生物肥力指數(shù)模型，計(jì)算不同土壤樣本的MIF值，其值在0～1之間。MIF值越大，代表黑土地土壤微生物肥力水平越高。7特爾斐法A.1特爾斐法的基本原理該方法的核心是充分發(fā)揮一組專家對(duì)問題的各自獨(dú)立看法，然后歸納、反饋，逐步收縮、集中，最終產(chǎn)生評(píng)價(jià)與判斷。A.2特爾斐法的基本步驟特爾斐法的基本步驟見圖1。圖A.1特爾斐法基本步驟A.2.1列出的調(diào)查提綱應(yīng)當(dāng)用詞準(zhǔn)確，層次分明，集中于要判斷和評(píng)價(jià)的問題。為了使專家易于回答問題，通常還在提出調(diào)查提綱的同時(shí)提供有關(guān)背景材料。A.2.2為了取得較好的評(píng)價(jià)結(jié)果，通常需要選擇對(duì)問題了解校對(duì)的專家10人～50人，少數(shù)重大問題可選擇100人以上。A.2.3調(diào)查結(jié)果的歸納、反饋和總結(jié)。收集到專家對(duì)問題的判斷后應(yīng)做統(tǒng)一歸納。定量判斷的歸納結(jié)果通常符合正態(tài)分布。這時(shí)可在仔細(xì)聽取了持極端意見專家的理由后，去掉兩段各25%的意見，尋找出建議最集中的范圍，然后把歸納結(jié)果反饋給專家，讓專家在此提出自己的評(píng)價(jià)和判斷。這樣反復(fù)3次～5次后，專家的意見會(huì)逐步趨近一致。這時(shí)可作出最后的分析報(bào)告。A.2.4統(tǒng)計(jì)參數(shù)。時(shí)常用到算數(shù)平均數(shù)和變異系數(shù)。設(shè)專家i對(duì)第j項(xiàng)調(diào)查的評(píng)定為Cij，則第j項(xiàng)評(píng)價(jià)的算數(shù)平均值為mj=∑Cij/n,式中n為專家總數(shù)；第j項(xiàng)評(píng)價(jià)的表一系數(shù)為V=Sj/mj，其中Sj為Cij的標(biāo)準(zhǔn)差，mj為均值。8土壤酶活性的測(cè)定B.1土壤硝酸還原酶測(cè)定B.1.1方法原理采用酚二磺酸比色法。在厭氧環(huán)境下，通過與酚二磺酸的藍(lán)色反應(yīng)，求出反應(yīng)前后硝態(tài)氮量差值，用于表示硝酸還原酶活性。其反應(yīng)式如下：NO3-→NO2-→NH2OH→NH4+B.1.2試劑配制(1)1%KNO3溶液。(2)1%葡萄糖。(3)CaCO3。(4)鋁鉀礬飽和溶液。(5)酚二磺酸：取3g重蒸酚與37g(20.1mL)濃H2SO4混合，在沸水浴上回流加熱6h即成。(6)10%NaOH。(7)KNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取16.3052g重結(jié)晶KNO3溶于蒸餾水中并稀釋至1L(1mL含10mgNO3-N)。使用前，將標(biāo)準(zhǔn)液再進(jìn)行稀釋(1mL含0.1mgNO3-N)。B.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制吸取50mLKNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于瓷皿中，在沸水浴上蒸干，殘?jiān)?mL酚二磺酸處理10min。再加15mL蒸餾水，定容500mL(1mL含0.01mgNO3-N)。吸取此溶液5-40mL于50mL容量瓶中，用10%NaOH調(diào)至微黃色，定容后在分光光度計(jì)上于400-500nm處進(jìn)行比色。以光密度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。B.1.4測(cè)定步驟取1g過1mm篩的風(fēng)干土壤，置于100mL減壓三角瓶中，加20mgCaCO3和1mL1%KNO3。仔細(xì)混合后，加1mL葡萄糖(作為氫的供體)。將此混合液連接于真空泵抽氣3min，稍搖蕩三角瓶，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，加50mL水、1mL鋁鉀礬液，搖勻。取20mL液移于瓷皿上蒸干。加1mL酚二磺酸處理10min，加15mL水，再加10%NaOH調(diào)至堿性。將著色液轉(zhuǎn)至50mL容量瓶中，定容、比色(波長為450nm)，用滅菌土壤(180℃加熱3h)作對(duì)照。B.1.5結(jié)果計(jì)算硝酸鹽還原酶活性以24h后10g土壤中被還原的NO3-N表示：硝酸鹽還原酶活性[mgNH3--N/(10g干土·24h)]=(m0-m)×10/dwt式中m0—土壤反應(yīng)前硝態(tài)氮含量的毫克數(shù)mgm—土壤反應(yīng)后硝態(tài)氮含量的毫克數(shù)mgdwt—烘干土重量gB.2土壤多酚氧化酶測(cè)定9B.2.1方法原理多酚氧化酶，在土壤碳循環(huán)中參與木質(zhì)素及多酚類物質(zhì)的降解，可以通過參與木質(zhì)素降解和聚合可溶性酚從而促進(jìn)腐殖質(zhì)形成，能夠通過分子氧化酚或多酚形成對(duì)應(yīng)的醌。其活性用底物（左旋多巴（L-DOPA分光光度法測(cè)定。B.2.2試劑配制(1)50mM醋酸鹽緩沖液：配制50mM的醋酸鹽6.804g三水合乙酸鈉溶解在800mL，去離子水中用12M鹽酸調(diào)pH，緩沖液保存在4℃冰箱，8天內(nèi)使用。(2)底物：左旋多巴（L-DOPA）(25μmolL-1)即，0.4929gL-DOPA溶于稀鹽酸后用去離子水稀釋至100mL。B.2.3測(cè)定步驟(1)稱取1g鮮土于250mL廣口錐形瓶中，加入到125mL，50mM，pH=5的醋酸鈉緩沖液（pH約6.5震蕩1h制備懸浮液。(2)然后使用八通道移液器吸200μL土壤懸