生物技術制藥重點及名詞解釋

生物技術制藥

第一章緒論

★生物技術與生物技術藥物的概念

生物技術藥物的分類

+按用途分類：治療藥物、預防藥物、作為診斷藥物（免疫診斷試劑、酶診斷試劑、器官功能診斷藥物、放

射性核素診斷藥物、診斷用單克隆抗體（McAb）、診斷用DNA芯片）

+按作用類型分類：細胞因子類藥物、激素類藥物、酶與輔酶類藥物、疫苗、單克隆抗體藥物、反義核酸

藥物、RNA干擾（RNAi）藥物、基因治療藥物

+按生化特性分類：多肽類藥物、蛋白質類藥物、核酸類藥物、聚乙二醇（PEG）化多肽或蛋白質藥物

★生物技術藥物的特性

+理化性質特性：相對分子量大、結構復雜、穩(wěn)定性差

+藥理學作用特性：活性與作用機制明確、作用針對性強、毒性低、體內半衰期短、有種屬特異性、

可產生免疫原性

+生產制備特性：藥物分子在原料中的含量低、原料液中長存在降解目標產物的雜質、制備工藝條件

溫和、分離純化困難、產品易受有害物質污染

+質量控制特性：質量標準內容的特殊性、制造項下的特殊規(guī)定、檢定項下的特殊規(guī)定（原液、半成品

及成品檢定等等）

第二章基因工程制藥

蛋白類藥物的特點：結構確證不完全性、具有種屬特異性、多功能性、免疫原性

臨床前安全性評價的特殊性：蛋白類藥物安全性擔憂的性質和來源；受試物的純度；相關動物的選擇；給藥劑量的選

擇；免疫原性；遺傳毒性和致癌性（一般不進行常規(guī)的遺傳毒性實驗）；藥代動力學

真核細胞表達制品的安全性問題：生產細胞DNA殘留的影響、生產用血清的影響

基因工程藥物穩(wěn)定性研究的相關問題：藥物濃度、溫度、濕度和水分、氧、光照、pH

基因工程藥物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；異體蛋白具有免疫原性

基因工程菌的修飾改造方法：構建突變體、構建融合蛋白、PEG修飾（降低免疫原性、增加水溶性、延長力僅）

基因工程制藥基本環(huán)節(jié)

?上游階段：制備目的基因—構建重組質粒f構建工程細胞

?下游階段：培養(yǎng)工程細胞f分離純化產物f除菌一半成品、成品檢定一包裝

基本工具：目的基因、各種酶（切割酶、連接酶、修飾酶等）、載體、宿主細胞

>酶切結果：5,粘性末端、3'粘性末端、平頭末端

>1U核酸內切酶的酶活性:指在最佳反應條件下反應1小時，完全水解1mg標準DNA所需的酶量

>影響限制性內切酶反應的因素：

?DNA樣品的純度：

?DNA的甲基化程度：核酸限制性內切酶不能夠切割甲基化的核昔酸序列。在基因克隆中要使用甲基化

酶缺陷型細菌菌株制備質粒DNAo

?酶切反應的溫度

?DNA的分子結構

?反應緩沖液組成

?反應時間、反應體積等

>工具酶

+核酸限制性內切酶：識別、水解外源的雙鏈DNA分子上特定的核苜酸序列。主要存在于原核微生物中。

?同裂酶：指來源不同，識別序列相同的酶；進行同樣的切割，產生相同的末端

?同尾酶：來源不同，識別序列不同，但產生相同的粘性末端

DNA甲基化酶:具有宿主專一性，對宿主自身DNA上特定核苗酸進行甲基化修飾，避免被自身限制性內

切酶水解

+DNA連接酶

?T4噬菌體連接酶：連接雙鏈DNA切口，或帶粘性末端或平頭末端的DNA片段

?大腸桿菌DNA連接酶：連接雙鏈DNA切口，或帶粘性末端的DNA片，不能連接帶平頭末端的DNA

片段

+聚合酶：以DNA或RNA為模板，將核苗酸連續(xù)加至3'-OH末端，合成方向為5'-3'。DNA聚合

酶、RNA聚合酶

?大腸桿菌DNA聚合酶I:5'f3'DNA聚合酶活性；5'f3DNA外切酶活性；3,->5,DNA外切酶活

性；RNAH酶活性

?Klenow酶：不具備5，-*3'DNA外切酶活性

?T4噬菌體DNA聚合酶：不具備5'f3，DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶強200倍，對單

鏈DNA作用強于雙鏈DNA

?T7噬菌體DNA聚合酶：不具備5'f3'DNA外切酶活性

,ToqDNA聚合酶

?反轉錄酶：催化以RNA或DNA為模板，合成DNA;具有RNAH酶的活性

?末端脫氧核昔酸轉移酶：催化dNTP沿5'f3'聚合，逐個加于線性DNA分子的3'末端；不需要模板

載體：(vector)來源于質粒、噬菌體或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA,并具有運載

外源DNA導入宿主細胞的能力。

+質粒載體：共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA);開環(huán)DNA(ocDNA);線狀DNA(IDNA)

?質粒的三個重要性質：遺傳傳遞的能力；遺傳交換的能力；不相容性

?用于克隆的質粒的三個要素：復制子、選擇標記、多克隆位點

?常用質粒載體：克隆載體、表達載體、突變載體、報告載體

+入噬菌體載體：插入型載體、置換載體

?來源于噬菌體DNA,因可以插入較大DNA片段，常用于構建基因組文庫和cDNA文庫。

目的基因的常用制備方法

+化學合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于lOObp的片段：直接合成，最常用固相亞磷酸三酯

法。大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法

+PCR法：前提：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應必需的雙

引物。

+基因文庫法：鳥槍法：適用于原核細菌目的基因的克隆分離

+cDNA文庫法(與mRNA互補的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA結構；僅限于克隆蛋白質編

碼基因；mRNA含量少且打/2短，對酶和堿極為敏感，分離純化困難

第一鏈：mRNA模板，引物(polyT),逆轉錄酶，dNTPs

第二鏈：自身引導法：取得的雙鏈CDNA5'端會有幾對堿基缺失(NaOH,煮沸；Klenow酶，dNTPs;

S1內切酶)

引導合成法：獲得的cDNA能保持完整的5'端序列(TdT,Dctp;NaOH;退火；Klenow酶，

dNTPs)

?基因文庫的完備性：指在構建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之

間的關系可用下式表示：N=ln(l-P)/ln(l-f),?=完備性，f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

?雙酶切產生的粘性末端，最常用，可以確保連接方向的正確性

?影響連接效率的因素：連接方式；目的基因與載體的濃度比例摩爾數(shù)比大于1；連接溫度、時間、酶的

活性、反應緩沖體系

重組DNA導入宿主細胞

+導入大腸桿菌：CaCI2法；轉染法

+導入酵母：電轉化法；化學轉化法；原生質轉化法

+導入鏈霉菌：原生質轉化法；電穿孔法

+重組DNA導入哺乳動物細胞：顯微注射法；DEAE葡聚糖轉染法；DNA-磷酸鈣轉染法；陽性脂質體介

導法；電穿孔法；細胞融合法；病毒感染法

>重組子的篩選與鑒定

+遺傳標記篩選法：抗生素抗性篩選法；?；パa篩選法（藍白斑篩選——載體含有LacZa基因，X-gal培養(yǎng)

基，成功導入的菌落顯示為藍斑）;營養(yǎng)缺陷型篩選法；噬菌斑篩選法

+核酸分子雜交法：菌落原位雜交法；DNA印跡法；RNA印跡法

+限制性內切酶圖譜法：瓊脂糖凝膠電泳鑒定各片段分子量，含有目的基因的為陽性克隆

+DNA序列測定法

+目的基因表達產物測定法

原核細胞表達的特點及選擇

+大腸桿菌（首選，遺傳背景研究清楚；適合大規(guī)模生產（成本低，周期短，效率高，操作簡單）、芽抱桿菌、

鏈霉菌等

+缺點：缺乏翻譯后修飾系統(tǒng)；容易以包涵體形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系統(tǒng)水解

★外源基因表達的調控原件:復制子、抽壬（表達效率的關鍵因素）和終止壬、核蟒結合位息（即SD序

列及SD序列到起始密碼子AUG的距離）、識別翻譯后修飾信號

+用于原核表達的載體必須具備的條件：具有復制子、靈活的克隆位點和方便的選擇標記、很強的啟

動子、阻遏子（一般有）、強的終止子，所產生的mRNA應具有翻譯起始信號（起始密碼子AUG以及

SD序列）

★外源基因在大腸桿菌中的表達方式

+胞內表達：

非融合蛋白表達：蛋白質接近天然狀態(tài)，易被降解，易形成包涵體。有原核多肽基因

融合蛋白表達：表達效率高；產物穩(wěn)定；可以切除原核多肽，獲得天然外源蛋白

十分泌表達：有信號肽基因，形成周質表達或細胞外表達

★外源蛋白表達效率的影響因素

+外源基因密碼子：大腸桿菌具有偏好密碼子和稀有密碼子，外源基因應盡量設計成為大腸桿菌的偏

好密碼子

+mRNA的結構：改變一級結構；降低5'端二級結構穩(wěn)定性；調控3,端非翻譯區(qū)二級結構

+表達載體的選擇：表達方式；強的復制子（拷貝數(shù)高）；強的啟動子（轉錄效率高）；高效率的核糖體結

合位點；強的終止子（提高mRNA穩(wěn)定性）；適應范圍廣；穩(wěn)定性高；產物易純化。

+外源蛋白的穩(wěn)定性：采用融合蛋白形式表達；采用蛋白酶缺陷的突變菌株

真核細胞表達的特點及選擇

>常用的真核表達系統(tǒng)：酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)的比較

大腸桿菌巴斯德畢赤酵母

載體原核載體穿梭載體

調控序列原核原核和真核

表達形式包涵體、融合蛋白、分泌分泌

翻譯后修飾基本無有

生產方式發(fā)酵，操作簡單、經(jīng)濟發(fā)酵，操作較簡單、較經(jīng)濟：

★酵母表達體系的影響因素

+外源基因的結構

人外源基因5'端非翻譯區(qū)的序列和長度影響mRNA的翻譯效率

人起始密碼子兩側若容易形成RNA二級結構，將阻止翻譯進行

人富含A-T序列導致轉錄提前終止

人密碼子的偏好性

人高度復雜的胱氨酸結構基序影響表達效率

+表達形式及信號肽的選擇：無信號肽常胞內表達；有信號肽，胞外分泌型表達

+啟動子：多數(shù)畢赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2啟動子

+轉化子的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)越高，表達水平也越高

+誘導條件：甲醇誘導的濃度、時間以及溫度的選擇

+外源蛋白的降解：采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或調節(jié)pH值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白

的穩(wěn)定性。

>哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

+表達載體：病毒載體（腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒等）；質粒載體

+表達方式：瞬時表達、穩(wěn)定表達、誘導表達

>基因重組蛋白的主要分離技術：離心、沉淀（等電點沉淀法、鹽析法）、膜分離、雙水相萃取

>基因重組蛋白的主要純化技術：離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析、反相色譜和疏水色譜

>選擇分離純化方法的依據(jù)

+根據(jù)表達形式選擇

?分泌型：沉淀和超濾

?周質表達：溶菌酶處理+滲透壓休克

?胞內可溶表達：親和層析或離子交換層析

?胞內不溶表達（包涵體）：易與雜蛋白分開，但需要復性形成有活性的蛋白質。

+根據(jù)分離單元之間的銜接選擇

?先采用低分辨、分離規(guī)模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分離規(guī)模小、速度慢的方法。合

理選擇色譜分離次序

+根據(jù)分離純化工藝的要求選擇

?具有良好的穩(wěn)定性、重復性和較高的安全性；盡量較少組成工藝步驟；所用時間盡可能短；工藝和技

術必須高效

★基因工程藥物的質量控制與小分子藥物質量控制相比，不同的方面

+Mr遠大于小分子化學物質，致使適用于小分子藥物的鑒別方法無法用于基因工程藥物。如質譜

+基因工程藥物結構復雜，常需多種檢測方法

+兩者雜質性質差別較大。小分子藥物雜質主要來源于合成中原料殘留、合成副產物和純化中溶劑殘留；

基因工程藥物多為宿主蛋白殘留和宿主基因殘留，其檢測一般都用專用的試劑盒。

+藥物定量方面，基因工程藥物一般采用生化反應的方式

★基因工程藥物的質量控制

1、蛋白質含量的測定

+紫外吸收光譜：在280nm有最大吸收值。快速，無破壞性。不是嚴格定量，核酸可引起強干擾作用。

+BCA法：堿性條件與Cu2+絡合同時將Cu2+還原成Cu+（雙縮麻反應），再與二辛可寧酸形成紫色復

合物，在562nm有最大吸收值。需短時間lOmin內完成

+Lowry法：堿性條件蛋白質與銅形成復合物可還原磷鋁酸-磷鴇酸試劑，產生深藍色。特點：靈敏，

準確度高；操作步驟多，繁瑣；影響因素多（鹽酸胭、尿素、EDTA等）

+考馬斯亮藍法：靈敏，操作簡單，重復性好；抗干擾能力弱

+SDS-凝膠染色與掃描分析法

2、蛋白質純度的測定:電泳（SDS）、質譜法、色譜法、末端氨基酸分析法

3、蛋白質分子量的測定：SDS、凝膠色譜、質譜法

4、蛋白質等電點的測定

5、蛋白質序列分析

+N末端氨基酸序列分析：鑒定蛋白質的種類；C末端分析：判斷表達、純化過程中有無加工

6、蛋白質二硫鍵分析

7、蛋白質活性的測定

8、免疫測定法

9、內毒素分析、宿主蛋白和核酸殘留分析

基因工程藥物的實例：干擾素（IFN）、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（CMCSF）、人白細胞介素-20L-2）、

胰島素、人生長激素（hGH）

第三章劭揚細胞工程制藥

動物細胞的體外培養(yǎng)

★體外培養(yǎng)動物細胞的形態(tài):貼壁依賴性細胞，非貼壁依賴性細胞，兼性貼壁細胞

?貼壁依賴性細胞：成纖維樣細胞型（主要來源于中胚層組織）；上皮樣細胞型（主要來源于外胚層和內胚層

組織）

?非貼壁依賴性細胞：又叫懸浮細胞，一般呈圓球形。主要來源于血液、淋巴組織、雜交瘤細胞

?兼性貼壁細胞：如CHO細胞、小鼠L929細胞

動物細胞的生理特點

1）細胞的分裂周期長，一般為12~48h（Gl-S-G2fM）

2）細胞生長需貼附于基質，并有接觸抑制現(xiàn)象

3）正常二倍體細胞的生長壽命是有限的

4）動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感（如滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等的變化耐受力很弱）

5）動物細胞對培養(yǎng)基的要求高（需要12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無機鹽和微量元素、作為

主要碳源的葡萄糖,以及多種細胞生長因子和貼附因子,而且不同種類要求又有變化。）

6）動物細胞對蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同

培養(yǎng)條件要求高、成本貴，產量低;多半是分泌在胞外的,收集純化方便，得到了較完善的翻譯后修

飾

★動物細胞培養(yǎng)的條件

（一）環(huán)境條件：直接接觸的器材、防止污染（顯著地污染標志:pH值迅速改變，細胞外形模糊，甚至

出現(xiàn)細胞集落）、水質、曲（大多是72-7.4）、滲透壓、溫度、通氧量、基本營養(yǎng)物質

（二）營養(yǎng)要求：水、碳源、氮源、維生素、激素、無機鹽等

?碳源不能為無機物，大多只能利用葡萄糖

?氮源不能為無機物，主要利用各種氨基酸

?在多數(shù)情況下，需要添加5%-20%的小牛血清，或適量動物胚胎浸出液。

培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基

?天然培養(yǎng)基：主要見于早期階段，來源：血漿凝塊、淋巴液、血清（最常用有效）、羊水、腹水等。分

維持液（低或不含牛血清）和生長液（5%-20%牛血清）

?合成培養(yǎng)基：主要成分：糖、氨基酸、核昔酸前體、維生素、激素、緩沖體系、無機鹽等

?無血清培養(yǎng)基

①提高了細胞培養(yǎng)的可重復性，避免了由于血清批之間差異的影響；

②減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；

③供應充足、穩(wěn)定；

④細胞產品容易純化；

⑤避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；

⑥減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實驗結果的分析

血清的作用：提供各種生長因子和激素，貼附因子和伸展因子，可識別金屬、激素、維生素和脂類的結合蛋

白，必須的脂肪酸和微量元素

★其他常用溶液:平衡鹽溶液；培養(yǎng)基PH調整液；細胞消化液（胰蛋白酶，EDTA）;抗生素溶液

動物細胞培養(yǎng)的基本技術和方法★

★動物細胞培養(yǎng)的方法：原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、克隆培養(yǎng)

?細胞的原代培養(yǎng):組織塊培養(yǎng)法、單層細胞培養(yǎng)法。取動物組織塊一剪碎一分散處理（加胰蛋白酶或膠

原蛋白和EDTA）-洗滌純化f計數(shù)稀釋一培養(yǎng)

?細胞的傳代培養(yǎng):離心或酶消化法收獲細胞，計數(shù)后，以適當濃度接種到新的培養(yǎng)環(huán)境中

.單克隆培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)的基本技術：細胞分離（離心法；蛋白酶消化法）；細胞計數(shù)；細胞傳代；細胞的凍存（慢凍,液

氮,-196度）和復蘇（快融,投入37℃水浴融化）

?凍存主要步驟：活性好的細胞，加保護劑（DMSO等）混合；做好標記（細胞種類、日期等）；逐漸降低溫

度，最后放至液氮中；降溫梯度要合適，總的原則是慢凍

生產用動物細胞

人原代細胞：費錢費力，少用

人傳代細胞系：安全，特點：2n核型，貼壁依賴，接觸抑制，有限傳代（50代）

人轉化細胞系：自發(fā)轉化或人為轉化，失去了正常細胞的特點，可=無限增殖傳代，適宜大規(guī)模工業(yè)培

養(yǎng)

人工程細胞系：融合細胞系（仙臺病毒融合法、聚乙二醇融合法、電融合法）；基因工程細胞系

?病毒載體：牛痘病毒。腺病毒和逆轉錄病毒載體，桿狀病毒載體-昆蟲細胞系統(tǒng)

?基因工程細胞主要的篩選系統(tǒng)，

①HAT（次黃瞟吟、氨基喋吟、胸腺喀嚏）選擇系統(tǒng)，篩選tk\"gn爐的轉化細胞

②GPT（HAT、黃喋吟、甘氨酸、霉酚酸）選擇系統(tǒng)，篩選產的轉化細胞

③G418（GeneMcin）選擇系統(tǒng)，篩選Med的轉化細胞

④MTX選擇系統(tǒng)，篩選力?獷的轉化細胞

細胞庫的建立：原始細胞庫生產用細胞庫（MWCR,又稱工作細胞庫，主細胞庫一生產細胞庫）

常用生產用動物細胞:BHK-21,C127細胞,CHO-K1,COS細胞,MDCK細胞，WI-38,MRC-5,Namalwa,

Sf-9,Vero,SP2/0-Agl4

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)

★動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法

?懸浮培養(yǎng):適用于非貼壁依賴細胞或兼性貼壁細胞

優(yōu)點：操作簡便，培養(yǎng)條件均一，傳質傳氧較好，容易擴大培養(yǎng)，可以借鑒細菌培養(yǎng)的經(jīng)驗。

缺點：細胞培養(yǎng)密度較低。

?微載體培養(yǎng):用于培養(yǎng)貼壁細胞。充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點。理想的微載體應具備：生物相容性、

無毒性、表面惰性、比重適當（1。30~L045g/ml）s粒徑均一,在60~250卬1之間（溶脹后）、光

學透明、柔軟、耐高壓滅菌溫度、反復多次使用、制備簡單、原料充分

?多孔載體培養(yǎng):可用于懸浮細胞及貼壁細胞。細胞在網(wǎng)格內，能避免受到剪切力的損傷，因此培養(yǎng)體

系可以提高攪拌速度和通氣量。多孔載體的一般條件：具備生物相容性、機械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性

?微囊化培養(yǎng):避免剪切力對細胞造成的損傷；獲得較高細胞密度108個/ml；利于純化；可采用多

種生物反應器進行培養(yǎng)

?中空纖維解：把細胞接種在中空纖維的外腔，利用中空纖維模擬毛細血管提供營養(yǎng)。

理想的動物生物反應器必須具備的基本要求：

①體系中的各種材料，對細胞必須無毒性。

②

③生物反應器結構的傳質、傳熱和混合性能好。

④密封性能良好，可避免一切外來微生物的污染。

⑤培養(yǎng)環(huán)境多種物化參數(shù)可自動檢測和調節(jié)控制，控制的精確度高，且能保持環(huán)境質量的均一。

⑥可長期連續(xù)運轉，尤其對于動物細胞而言。

⑦容器加工制造時要求內面光滑，無死角。

⑧拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒便于操作消毒。

設備成本盡可能低。

★動物細胞生物反應器

+規(guī)模：實驗室規(guī)模：＜20L;中試規(guī)模：20-100L;生產規(guī)模：＞100L

+類型：攪拌罐式；氣升式；中空纖維式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性搖袋式細胞培養(yǎng)

+主要操作方式:

?分批式操作：能夠控制的參數(shù)只有PH、溫度和通氣量

?補料-分批（或流加式）操作：不斷地向系統(tǒng)中補充新的營養(yǎng)成分

?半連續(xù)式操作

?連續(xù)式操作和灌流式操作：后者取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞仍保留在反應器內，而連

續(xù)式培養(yǎng)則同時也取出了部分細胞。

轉基因動物

基本原理及步驟：外源目的基因的制備一外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞f選擇獲得攜有目的基

因的細胞f選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物f轉基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定f篩選所得的轉基因動物

品系

轉基因動物制作方法

+經(jīng)典的技術路線：基因顯微注射法,最常用、成功的方法，成功率低

+整合胚胎移植的技術路線：受精卵的成活率高達90%以上，外源基因整合率高，提高受孕率

+核移植（克?。┑募夹g路線：體細胞核移植；核移植前導入目的基因。

+整合卵受精的技術路線：卵母細胞導入目的基因后再與精子受精。

+具體方法:基因顯微注射法、反轉錄病毒感染法、胚胎干細胞方法，精子載體導入法、基因打靶

法、人工酵母染色體法★

轉基因動物研究出現(xiàn)的問題：制作轉基因動物效率低；外源基因在宿主基因組中的行為難以控制；轉基因表

達水平低

轉基因動物反應器：（bioreactor）目的片段在器官或組織中表達的轉基因動物。如乳腺、膀胱、血液等

動物細胞產品制造實例：類淋巴細胞干擾素、組織型纖溶酶原激活劑、單鏈尿性纖溶酶原激活劑-尿激酶

原、促紅細胞生成素（EP。）、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗

第皿章抗體工程制藥

概述

抗體工程應用于醫(yī)學領域：研究，以免疫轉印法檢測特定抗原；醫(yī)療，以毒素連結抗體攻擊病變女田胞；

檢驗，以ELISA偵測特定病原體；

多克隆抗體（polyclonalantibody,pAb）簡稱多抗。如:免疫血清（含多種特異性抗體）

實際意義：預防、治療感染性疾病，如：破傷風抗毒素血清（抗破傷風）；胎盤球蛋白（抗病毒感染）。副作

用:今超敏反應。臨床診斷，如：肥達氏反應（傷寒、副傷寒）。缺點：特異性差

單克隆抗體（monoclonalantibody,mAb）簡稱單抗★

優(yōu)勢：特異性高:只識別某一個特定的抗原決定簇。均一性好:其H鏈、L鏈及V區(qū)獨特性其完全一致，

所得到的抗體結構和生物學性狀完全一致。

雜交瘤細胞：既能產生單一抗體，又能無限增殖

抗體分子的結構和功能★

＞基本結構：四肽鏈結構

A重鏈（H鏈）和輕鏈（L闔天然Ig一分一壬史，…重鏈圓類，…輕鏈同型

重鏈可分為五類：U、Y、。、5、￡鏈IgM、IgG、IgA、IgD、IgE;輕鏈可分為K、入型。

A可變區(qū)（V區(qū)）、恒定區(qū)（C區(qū)）和錢鏈區(qū)（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶）

?VL、VH區(qū)各有3個超變區(qū)（也稱互補決定區(qū)，CDR1-3）,共同組成IQ的抗原識別部位,形成與抗原決

定簇互補的表位。可變區(qū)中的其它部分變化較小，稱為骨架區(qū)（FR）

?C區(qū)決定1g分子的異種抗原性，主要發(fā)揮抗體分子的效應功能。

＞抗體分子的價位：指抗體分子能結合的抗原表位數(shù)的多少。VH和VL的CDR區(qū)共同構成抗原的結合位點，

因此一個單體免疫球蛋白分子有兩個抗原結合點，故習慣將單體抗體分子稱為2價分子。

單克隆抗體的制備

產生雜交瘤細胞的三個關鍵點：B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的特性、細胞融合技術、雜交瘤細胞的篩選

單克隆抗體制備的基本過程（理解）：抗體與動物免疫,提取能夠產生抗體的B淋巴細胞,B淋巴細胞與小鼠的骨髓瘤

細胞在滅活的仙臺病毒/聚乙二醇的誘導下融合，并在特定的選擇培養(yǎng)基下箍選出雜交瘤細胞。在體外條件下做大規(guī)模

培養(yǎng)/注射到小鼠腹腔內增殖。再提取出大量的單克隆抗體，最后進行純化。

＞抗原和免疫：抗原的制備（通常和佐劑混合，增強免疫應答）、免疫動物（體內/體外免疫方法；動物的

選擇：一般采用與骨髓瘤供體細胞同一品系的動物）

＞細胞的融合和雜交瘤細胞的篩選

人細胞的融合：制備脾細胞懸液:最后一次免疫后三天，1X108個；制備骨髓瘤細胞懸液:對數(shù)生長期

細胞，（2?3）x1（y個；融合:40-50%PEG（MW4000）,37℃,5min

人★HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞

HAT培養(yǎng)基篩選原理：H（次黃瞟吟）；A（氨基蝶吟）；T（胸腺喀嚏）。骨髓瘤細胞不具備HGPRT和TK,

B淋巴細胞壽命短。影響細胞DNA的合成：H促進了次黃瞟聆鳥喋吟磷酸核糖轉移酶（HGPRT）

途徑；T促進了胸腺嚓咤激酶（體）途徑；內源性途徑（谷氨酰胺、鳥核昔酸單磷酸，二氫葉酸還

原酶途徑）被A（葉酸的拮抗物）阻斷

步驟：融合后細胞fHAT培養(yǎng)基fHT培養(yǎng)基f正常培養(yǎng)基

人雜交瘤細胞的檢測和克隆

抗體的檢測：僅少數(shù)雜交瘤細胞可以分泌預期抗體。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、間接免疫熒光法、放射

免疫測定法、流式細胞儀法

雜交瘤細胞的克隆：有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法。經(jīng)過3-4輪克隆化，才能達到100%孔內均為陽性

細胞克隆。耗時長（3-4月）

人雜交瘤細胞的凍存：凍存原始細胞

＞單克隆抗體的大量制備：體內接種法（皮下接種、腹腔接種）；體外培養(yǎng)法

＞單克隆抗體的鑒定和檢測

人單克隆抗體的檢測

?McAb特異性檢測：檢測有無抗原抗體結合；檢測有無交叉反應。ELISA、間接免疫熒光法

?McAb類和亞類的鑒定：類的鑒定一般在雜交瘤的克隆化過程中可以確定（兔抗鼠IgG或IgM作

為二抗用于ELISA）亞類的確定需要用標準抗亞類血清系統(tǒng)做雙擴散電泳或夾心ELISAo

?其他鑒定：中和活性鑒定；識別抗原表位鑒定；親和力鑒定；效價（滴度鑒定）；純度鑒定

人雜交瘤細胞的鑒定：主要是對雜交瘤細胞進行染色體分析

抗體治療疾病的機制：中和作用、導向作用、拮抗作用、ADCC、CDsAonist

抗體在疾病治療中的應用

?作為診斷試劑：病原微生物抗原抗體的檢測、腫瘤抗原的檢測、免疫細胞及其亞群的檢測、激素測定、

細胞因子的測定

?作為治療藥物：抗腫瘤、抗感染、抗器官移植排斥反應、治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應性疾病

制約抗體藥物迅速發(fā)展的主要障礙：免疫原性；分子量大

基因工程抗體

＞單克隆抗體的人源化

人嵌合抗體：人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。特點：具

備親本鼠源單抗相同的特異性和親和力；對人的免疫原性大大減少；可以接上不同亞類的人C區(qū)基因，

改變抗體功能；半衰期長；工程細胞系比人-人雜交瘤細胞穩(wěn)定；由于鼠VL和VH區(qū)的存在，仍有較

強免疫原性

人改形（型）抗體：把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改形

抗體，也就是人源化抗體。，抗體的免疫原性極低，而其抗原結合能力保持不變，

＞小分子抗體

人包括FobsFvs單鏈抗體及單域抗體等

?Fab片段：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與完整的輕鏈以二硫鍵連接而成。1/3

?Fv片段：由VH與VL非共價結合而成。在VH與VL的適當區(qū)域個引入一個半胱氨酸，形成鏈內二

硫鍵，成為二疏蕤1德定的―Mdisu用de-stablizedFv,dsF\^\1/6

?單鏈抗體（ScFv）:在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，即單鏈抗體。常

月的連接肽懸（GGGGS13

?單域抗體：即為VH或VL,約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，故稱單域抗體。單域

抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

人優(yōu)點：可以用細菌發(fā)酵生產，成本低；分子小，穿透力強；不含F(xiàn)c,沒有Fc帶來的效應；在體

內循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免

疫毒素或酶標抗體等。

＞多功能化抗體

人雙功能抗體（bsAb）:又稱雙特異性抗體，兩個針對不同抗原決定簇的ScFv以共價鍵或非共價鍵連接在

一起。

人融合抗體：Fc抗體融合蛋白；Fv抗體融合蛋白

人細胞內抗體：指在細胞內合成并作用于細胞內組分的抗體，也稱內抗體。在scFv的C端/N端插入其

他靶向信號

人最小識別單位：約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性

噬菌體抗體工程

噬菌體抗體庫技術的三個關鍵：RT-PCR技術；噬菌體展示技術；抗體原核表達技術。

★噬菌體抗菌庫技術的篩選:。固相或液相純化抗原的篩選、全細胞篩選、用切片組織進行篩選

第五章疫苗及其制備技術

1.活疫苗（livevaccine）選用無毒或弱毒但免疫原性高的菌種,經(jīng)培養(yǎng)、繁殖后制成的。活疫苗株進入機體后，

能繼續(xù)生長繁殖，對機體呈長時間刺激，持續(xù)產生抗體。這類菌（疫）苗有卡介菌（預防結核病的菌苗）、炭

疽菌苗、牛痘疫苗、狂犬病疫苗、鼠疫菌苗、脊髓灰質炎疫苗以及麻疹苗等。

2.死疫苗（killedvaccine）包括滅活疫苗（由完整的病毒或細菌經(jīng)滅活劑滅活后制成，即要使病原體充分死亡，

喪失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性）和亞單位疫苗（將病原體經(jīng)物理或化學方法處理,除去

無效物質，提取其有效抗原部分制備的一類疫苗）

★活疫苗特點★★死疫苗特點★

可在體內繁殖?丕能在體內繁殖，性質穩(wěn)定，安全性JS

有利于制備多價或多聯(lián)疫苗

系統(tǒng)免疫反應和局部免疫反應?

?比較安全,—丕發(fā)生全身性副反應.'…無毒力反祖現(xiàn)象

?免疫力持久，產量高，成本低

?受外界影響小，有利于保存運輸

?有毒力增強和反祖危險

?免疫劑量大，需多次免疫一,…成本高

抗原干擾現(xiàn)象

?只能誘導機體產生體液免疫

?保存條件苛刻

?通常需要用佐劑或攜帶系統(tǒng)來增強其免疫效果

★活疫苗★死疫苗DNA疫苗

?可在宿主細胞中復制?不能在宿主細胞中復制?可刺接抗原在細胞內合成

?毒力降低?無毒，不返強?可誘導細胞免疫

?免疫反應比較全面?免疫反應不太全面?制備技術容易標準化

?免疫劑量小?不會傳染給其它個體

?免疫保護期長?制備技術相對容易

重組亞單位疫苗

?將病原的主要保護性抗原蛋月基因在體外進行大量表達，純化其表達產物輔以佐劑制成疫苗--亞單位疫苗

?良好的安全性和穩(wěn)定性。利用非疫苗用蛋白作為抗原建立的診斷方法將可以區(qū)分.亞單位疫苴免疫的動物和

自然感染的動物

?適用于發(fā)病快，病程急，中和抗體能有效控制發(fā)病的傳染病。

?不適于病程發(fā)展緩慢，潛伏期長，感染巨噬細胞且有ADE效應的疾病。

活載體疫苗

?利用低致病力的痘病毒「痛疹病毒一腺病毒或細菌作為載體，將其它病原的主要保護性抗原基因插入到載

體基因組的非必需區(qū)形成新的重組體，在同源或兼容性好的啟動子驅動下隨載體的復制表達插入的外源基

因。

病毒活載體疫苗的缺點：使用同一載體的不同疫苗不能同時使用

疫苗制造流程

制造優(yōu)良疫苗的關鍵：優(yōu)良的菌種；適宜的培養(yǎng)方法；良好生產工藝；嚴格的檢驗和標準。

生產工藝流程：菌（毒）種f培養(yǎng)物（培養(yǎng)基、動物、禽胚或細胞等）f收獲抗原（培養(yǎng)液、含毒組織、胚液或細

胞液等）f配苗f分裝f凍干成活疫苗或滅活后制成滅活疫苗。

毒種的選擇與減毒

★毒株須具備的條件：

1）持有特定的抗原性；

2）有典型的形態(tài)和感染特定組織的特性，并能保持其生物學特性；

3）易在特定組織中大量繁殖；

4）不產生神經(jīng)毒素或能引起機體損害的其它毒素；

5）如制備活疫苗，繁殖過程中無恢復原致病性的現(xiàn)象；

6）未被其它病毒污染。

強毒種的選育：毒力強，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種,最后凍干保藏。這就是強毒菌種的標準

弱毒種的選育：初選的依據(jù)：生物性狀改變

細菌滅活疫苗制造：種子f培養(yǎng),滅活和無菌檢查-濃縮提高含菌量f配佐劑-分裝―動物安全試驗

細菌弱毒疫苗制造：菌種,培養(yǎng)-濃縮一配苗和凍干,動物安全試驗

病毒性動物組織苗（自家組織滅活苗；病毒弱毒疫苗）、病毒禽胚疫苗、病毒細胞疫苗、寄生蟲疫苗的制備

★疫苗產品的質量檢定:外觀檢查、pH值檢測、純度、宿主細胞DNA和蛋白殘留量、無菌檢查、熱原、

抗生素檢測、滅活效果的驗證、異常毒性檢查、穩(wěn)定性試驗、效力試驗（生物效

價）、佐劑的質量評價、疫苗標準品或參考品的研究

甲型肝炎減毒活疫苗：生產用細胞（人二倍體細胞）、細胞庫管理及檢定、細胞制備、細胞培養(yǎng)液、毒種名稱及

來源、種子批的建立、對照細胞外源因子檢查、病毒接種和培養(yǎng)、病毒提取（檢定合格的病毒收獲物經(jīng)凍融

禾口（或）超聲波處理，并采用適宜濃度的三氯甲烷抽提以提純病毒）、原液（同一細胞批生產的病毒收獲物經(jīng)提

取病毒后合并為二批原液）

流行性乙型腦炎疫苗：收液作毒力滴定與無菌實驗，加△福爾芻林“NZ2恒溫滅活—3。

滅活劑、保護劑和免疫佐劑

滅活劑種類

1.甲醛溶液：最常用。①蛋白質②核酸烷基化（丕加一生斷劑）作用于氨基、竣基、羥基、筑基

2.烷化劑：乙?；蚁﹣啺罚ˋEI）;二乙烯亞胺（B日）；縮水甘油醛。（使微生物核酸烷基化，滅活后加2%硫

代硫酸鈉中斷灰活）。烷化DNA分子中的鳥瞟聆或腺瞟聆等,妨礙RNA的合成。使病毒完全喪

失感染力,而保留其保護性抗原。

3.苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制

4.結晶紫：蛋白質變性（溶于有機溶劑）；用于診斷抗原的制備：雞白痢抗原

5.小丙酰內酷：病毒滅活劑，主要用于狂犬病滅活苗制備

!注意；滅活劑對人有害,有時對皮膚粘膜有強烈刺激性如:甲醛、6丙酰內酯

影響滅活作用的因素：滅活劑特異性；微生物種類和特性；滅活劑濃度；滅活溫度；滅活時間；滅活PH值；

有機物存在

保護劑的用途

①菌種或毒種保存：常用甘油作保護劑

②細胞株保存：常用二甲基亞颯（DMS。，一種細胞的保護劑）

③疫苗冷凍真空干燥制備時：加脫脂乳（或二甲基亞颯）和蔗糖等（不同國家有不同配方）

④干擾素類生物活性物質的保存：加葡聚糖

保護劑分類：機理——滲透劑（DM$。、甘油和蔗糖）非滲透齊ij（聚乙烯毗咯咤酮（PVP）和蛋白質）；分子量大小

——高分子物質、低分子物質；化學性質——復合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物

疫苗凍干保護劑組成：營養(yǎng)液；賦形劑；抗氧化劑

常用的凍干保護劑（穩(wěn)定劑）

＞細菌的保護劑

①需氧或兼氧厭氧菌：5%蔗糖脫脂乳或5%蔗糖、1.5%明膠;

②厭氧性細菌：含1.5%谷氨酸鈉的1%乳糖或10%脫脂乳或7.5%葡糖血清。

注:脫脂乳:20%脫脂奶粉溶于水配制而成。

＞病毒的保護劑

①5%蔗糖脫脂乳；

②馬立克814活細胞疫苗：保存液氮.穩(wěn)定劑為10%二甲基亞颯和50%犢牛血清的199液。

注:微生物保護劑緩沖液的組成比例,不同廠家有不同的配方。

常用的保護劑：5%蔗糖（乳糖）脫脂乳保護劑；明膠蔗糖保護劑；SPGA保護劑

免疫佐劑：

?氫氧化鋁膠（鋁膠）?油乳佐劑?乳化劑?白油佐劑?蜂膠佐劑?脂質體佐劑

?細胞因子類免疫佐劑（IL-2、IL-4、IL-12、IFN-Y）

?CpGDNA（指含有非甲基化CpG（胞喀嚏鳥瞟吟二核苜酸）基序的脫氧核糖核酸DNA）

?CpGOND（含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苦酸）

?基因工程減毒素（霍亂毒素，CT;大腸桿菌不耐熱毒素，LT;破傷風類毒素，TT）

?免疫刺激復合物（ISCOM,抗原：糖昔QuilA:膽固醇=1:1:1）

作用機理：抗原遞呈；抗原尋的；免疫調節(jié)

?CpGDNA對多種免疫細胞有激活作用：引起B(yǎng)細胞分化，直接激活單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞，

在IL-12協(xié)同下激活NK細胞，協(xié)同刺激抗原特異性B細胞和T細胞分化

?CpGODN的體內效應與應用：對天然免疫系統(tǒng)的刺激活性（抗感染、抗腫瘤活性）；對特異性免疫反應的

調節(jié)作用一一疫苗佐劑（對蛋白質抗原的作用；對DNA疫苗的作用）；過敏性疾病治療

第六章酶工程制藥

概述

酶是一類具有催化活性的生物大分子，包括蛋白質和核酸

一般催化劑的特征：1.只能進行熱力學上允許進行的反應；2.可以縮短化學反應到達平衡的時間，而不改變反

應的平衡點；3.通過降低活化能加快化學反應速度。

★酶的特點:高效性、專一性、反應條件溫和、可調節(jié)性。

酶的分類：六大類，氧化還原酶類（脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶、羥化酶以及加氧酶類）、轉移酶類、水解酶

類（淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶）、裂解酶類（醛縮酶、水化酶及脫氨酶）、異構酶類（消旋酶、順

反異構酶）和合成酶類（又稱為連接酶）

酶的來源和生產：直接從動植物獲得，即從生物體中分離和提純；化學合成方法；工業(yè)微生物發(fā)酵

發(fā)酵法產酶的優(yōu)點：微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全。微生物繁殖快，生產周期短，酶的產量高，成本

低。微生物具有較強的適應性和應變能力，可以通過適應、誘導、誘變以及基因工程等方法培育出新的高

產酶的菌株。

研究內容：酶的大量生產和分離純化；新穎酶的發(fā)現(xiàn)、研究和應用；酶的固定化技術和固定化酶反應器；基因

工程技術應用于酶制劑的生產；酶分子改造與化學修飾；有機介質中酶的反應；酶抑制劑、激活劑

的開發(fā)及應用研究；抗體酶、核酸酶的研究；模擬酶、合成酶的研究；酶的定向進化研究

酶的分離純化

分離純化遵循蛋白質分離純化的一般原則，但又有特殊性：

?低溫：一般1?4℃

?條件溫和：避免極端條件（劇烈攪拌、pH、鹽濃度等）

?加入保護劑：EDTA、2-筑基乙醇等

?對純化過程進行監(jiān)測：不斷檢測酶活力和蛋白濃度

★酶分離純化的步驟:預處理f初步純化高度純化f濃縮與干燥

＞酶的提取

?來源選擇:含目的多的原料。同時考慮原料的來源、取材方便經(jīng)濟等方面因素

?細胞破碎：機械法、物理法、化學法（有機溶劑、表面活性劑）、生物法（酶解）

?保護措施：采用緩沖系統(tǒng)；添加保護劑；抑制水解酶的作用；其他：注意溫度、攪拌、紫外光等的影響

＞酶的抽提：

?目標：將目的酶最大限度地溶解出來；保持生物活性。

?原則：相似相溶；使用遠離等電點的pH值，溶解度增加。

?方法：鹽溶液提?。ǔＳ肗aCI溶液）；酸、堿溶液提??；有機溶劑提取

A沉淀分離：等電點沉淀；鹽析；有機溶劑沉淀

＞酶的純化

?根據(jù)分子量大小分離：離心、膜分離、凝膠層析等

?根據(jù)電荷性質進行分離：離子交換、電泳等

?根據(jù)疏水作用進行分離：疏水層析、反相色譜等

?根據(jù)親和作用分離：親和層析

酶和細胞的固定化

游離酶的缺點：酶是蛋白質，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機溶劑對其有影響）。酶不能回收，無法重復使用。產物中混雜酶蛋

白，分離純化困難。

★固定化酶:

?優(yōu)點：（1）可提高酶的穩(wěn)定性。（2）酶能回收，易與產物分離，可反復使用。

?缺點：（1）存在擴散限制。適于催化小分子物質。（2）酶活性下降。

固定化細胞：

?優(yōu)越性：（1）降低成本，省去酶的分離純化工作：（2）既可作為單一酶，也可作為復合酶系完成部分代謝

過程。

?局限性：（1）細胞內多種酶的存在，會形成不需要的副產物。（2）細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限

制作用。

固定化酶（細胞）的制備

★傳統(tǒng)的酶固定化方法:載體結合法（物理吸附法、離子結合法、共價結合法）交聯(lián)法（常用戊二醛試劑法

包埋法（網(wǎng)格型、微囊型）

吸附法

固定化方法包埋法共價結合法交聯(lián)法

物理吸附法離子吸附法

制備難易易易較難難較難

結合程度弱中等強強強

活力回收高，酶易流失高高低中等

費用低低低高中等

底物專一性不變不變不變可變可變

酶固定化的新方法：光偶聯(lián)法；等離子體法；偶合固定化法；無載體固定化酶的新技術

★固定化酶（細胞）的性質和指標

＞固定化酶活力的改變：通常低于天然酶（有例外）

原因：酶的構象發(fā)生變化，影響活性中心的氨基酸；空間障礙：形成立體屏蔽；內擴散阻力使底物分子與

活性中心的接近受阻；包埋時，大分子底物不能透過膜

＞固定化酶的穩(wěn)定性：酶的耐熱性提高，對變性劑、抑制劑、pH值、蛋白酶以及操作條件的抵抗力增

加。

可能的原因：固定化增加了酶活性構象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形。抑制酶的自身降解。固定化

部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。

＞固定化酶的最適溫度變化：最適溫度與酶穩(wěn)定性有關。多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有

例外）

＞固定化酶的最適pH變化：帶負電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏

移。

＞固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km的變化：固定化酶的表觀Km隨載體的帶電性能變化。

＞固定化載體與酶的底物電荷相反時，固定化酶的表觀Km值降低；相同時，表觀Km值顯著增加。

＞固定化酶的作用專一性改變：與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導致酶的專一性發(fā)生

改變

＞固定化細胞的性質：有活性升高的現(xiàn)象；穩(wěn)定性的增加；最適溫度和最適pH常保持不變

＞★固定化酶（細胞）的評價指標：活力、偶聯(lián)率及相對活力、半衰期、熱穩(wěn)定性

?活力回收=（加入酶蛋白活力一上清液酶蛋白活力）/加入酶蛋白活力x100%

?偶聯(lián)率=固定化酶總活力/（加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力）XI00%

偶聯(lián)率=［，表明固定化對酶活性影響不明顯；

偶聯(lián)率＜1,表明固定化對降低酶活性；

偶聯(lián)率＞1,可能有細胞分裂，或從載體中排除影響酶活性的抑制劑

酶傳感器：主要由固定化酶膜和變換器組成

?生物傳感器：醵傳感器（酶電極;熱敏電阻酶傳感器「離子敏場效應晶體管酶傳感器,…光紅酸傳感

器）、組織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器

?酶傳感器的應用：水質監(jiān)測；葡萄糖傳感器和血糖測定儀；肉鮮度傳感器

酶反應器★