DB37T 4725.2-2024 動(dòng)物疫病診斷技術(shù) 第2部分：α皰疹病毒

37毒Diagnostictechniquesofanimaldisease—Part2:AlphaherpesvirusI本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定DB37/T4725《動(dòng)物疫病診斷技術(shù)》是針對(duì)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)不同動(dòng)物疫病的致病原，明確動(dòng)物疫病病原DB37/T4725擬由以下部分構(gòu)成。皰疹病毒（herpesviruses）是一類有包膜、基因組為雙鏈DNA的病毒。主要分為α皰疹病毒、疹病毒、γ皰疹病毒3種亞型。其中α皰疹病毒對(duì)動(dòng)物的危害程度最大。該病毒感染宿主廣泛，包括豬、1動(dòng)物疫病診斷技術(shù)第2部分：α皰疹病毒本文件適用于豬、雞、牛、馬、驢α皰疹病毒的流行病學(xué)調(diào)查、診斷GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范4.1豬偽狂犬病由豬偽狂犬病毒（Porcinepseudorabiesvirus，P4.2雞馬立克氏病傳播，另外，污染的飼料和飲水，以及飼養(yǎng)人員流動(dòng)也可傳播該病。2月齡～5月齡的雞常4.3牛傳染性鼻氣管炎由牛皰疹病毒1型（Bovineherpesvirus1，Bo由馬皰疹病毒1型、4型或8型（Equineherpesvirustype，2母豬分娩前或后1周出現(xiàn)食欲下降甚至廢絕，且出現(xiàn)早產(chǎn)，流產(chǎn)，產(chǎn)死胎或弱胎；公豬出現(xiàn)睪陰囊腫大，精子活力低。哺乳仔豬感染以后出現(xiàn)高熱潛伏期一般3周～4周，根據(jù)皰疹病毒侵害部位不同，分為四種類5.1.2.1神經(jīng)型：患病雞出現(xiàn)站立不穩(wěn)，呈“劈叉”姿勢(shì)，翅膀下垂，低頭或斜頸等為典型癥狀。5.1.2.4皮膚型：病雞常出現(xiàn)毛囊腫大或皮膚結(jié)節(jié)。5.1.3.2結(jié)膜角膜炎型：病牛出現(xiàn)結(jié)膜和角膜充血，眼瞼腫大，流淚，角膜渾濁，有壞死性斑點(diǎn)。5.1.3.3生殖器型：病母牛體溫升高，精神沉郁，食欲廢絕，外陰腫脹有小膿皰；出現(xiàn)子宮炎導(dǎo)致流而死亡。孕馬或孕驢出現(xiàn)流產(chǎn)，或驢駒死亡。以1歲～2歲馬或驢多發(fā)，3歲后呈隱5.2.1.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)與電泳分析3TTTGAATTCTTACGACACGGC鑒于PRV的檢測(cè)需要區(qū)分野毒感染還是由疫苗免疫造成，以5.2.1.2純化的DNA為模板，利用特異性引物分別進(jìn)行PCR檢測(cè)（引物序列見表2，gE引物用于鑒別野毒，gB引物用于常規(guī)檢測(cè)），qACAAGTTCAAGGCCCACATC5.2.1.4野毒分離與檢測(cè)分析核酸電泳結(jié)果，或qRT-PCR結(jié)果，選取判定為豬偽狂犬病毒陽(yáng)性的腦，肺臟或淋巴結(jié)等病料借5.2.1.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.2.1采集病料樣品4具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%的核酸膠進(jìn)行電泳分析以5.2.2.2純化的DNA為模版，利用），MDV073-FATTTGATTCAGATTTTGTTTMDV073-R5.2.2.4野毒分離與檢測(cè)成3%FBSDMEM，放置培養(yǎng)箱3天～5天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。5.2.2.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.2.5.3若DEF細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞出現(xiàn)變圓、聚集、拉5.2.3.1病料樣品采集以5.2.3.2純化的DNA為模板，利用），55.2.3.4野毒分離與檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液，放置培養(yǎng)箱3天～5天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。5.2.3.5數(shù)據(jù)處理分析5.2.4.1病料樣品采集將待測(cè)病料樣品借助試劑盒提取DNA作為模板，借助特異性引物（序列參見表5）進(jìn)行PCR檢測(cè)，具體操作步驟參照附錄A。將PCR產(chǎn)物利用1.0%核酸膠進(jìn)行電泳分析，目的片段大小為792bp，482bp或6以5.2.4.2純化的DNA為模板，利用），5.2.4.4野毒分離與檢測(cè)換成3%FBSMEM，放置培養(yǎng)箱3天～5天，每天借助倒置顯微鏡觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）。5.2.4.5數(shù)據(jù)處理分析5.3綜合判定若患病動(dòng)物（豬，雞，牛，馬或驢）出現(xiàn)呼吸困難，流產(chǎn)和神經(jīng)癥狀等，則可判定為疑似α皰疹病毒感染，需借助PCR，熒光定量PCR進(jìn)行7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)，又稱為無(wú)細(xì)胞和適溫延伸（72℃)等3個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成。體系包含DNA聚合酶，引物，模板等，常設(shè)定為30A.3試劑或材料A.3.2對(duì)應(yīng)靶基因的特異性引物。A.3.3實(shí)驗(yàn)室用水參考GB/T66A.3.6Agarose瓊脂糖。A.3.7標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量maker。A.4儀器設(shè)備A.4.2核酸電泳儀。A.5試驗(yàn)步驟用1.0%核酸膠進(jìn)行分析，待電泳結(jié)束，借助凝膠成像系統(tǒng)觀察11268qRT-PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PC11179TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGAGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGTCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGCTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGAGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTGCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGATTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCAAGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCTGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGAGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGATTTGATTCAGATTTTGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCATTCTCTGACTCCACGGATAGAATAGTACGGGTTGTACAAGAACCCGTTTTTTATTCAAATGCTCCCCCAATATATTTGGGTTTTGTCTTTCGGCCAGCATTAATGCGCGAACGGAACAACAGCGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTAATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTTACGACTCGTTCGCGCTCTCGACCGGGGACATTATCTACATGTCGCCCTTTTACGGGCTGCGCGAGGGCGCGCACCGCGACCAGCTACTCGCCGGAGCGCTTCCAGCAGATCGAGGGCTACTACAAGCGCGACATGGCCACGGGCCGGCGCCTCAAGGAGCCGGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCACGTGACGGTAGCCTGGGACTGGGTGCCCAAGCGCAAAAACGTGTGCTCGCTGGCCAAGTGGGGCGGACGAAATGCTGCGAGACGAGAGCCGCGGGAACTTCCGCTTCACGGCCCGCTCGCTCTCGGCGACCTTTGTGAGCGACAGCCCTTCGCGTTGCAGAATGTGCCGCTGAGCGACTGCGTGATCGAAGAGGCCGAGGCCGCGGTCGAGCGCGTCTACCGCGAGCGCTGGCACGCACGTGCTGTCGGGCAGCTTGGAGACGC.8牛皰疹病毒1型gB基因qRT-PCR參考序列(大小為97CTGGCACACGACGGACGATGTGTACACGGCGCTGGGCTCGGCGGGGCTCTACCGCACGGGCACCTCTGTGAACTGCATCGAACCTCAGCCAACCCAAGATGGTGTGCATAGAGAACAAATTCTACATCGCTTGCACAAACGAGCAGTGGAGGCAACGGCACCGATTCTTCCAACGTCACCGCCAAACAGCTGGAGCTCATCAAAACCACGTCGTCTATCGAGTTTGCCATGCTACAGTTTGCATCACATCCAATCCCACGTCAATGAAATGCTAAGTAGAATAGCAACTGCGTGGTGTACCCTCCAAAACAAAGAGCGGACCCTATGGAATGGTGAAGATTAACCCGAGCGCCATAGTCTCCGCAACCCTTGACGAGCGAGTTGCAGCGAGGGTCCTGGGGGACGTGATAGCTATAACGCACTGCGCCAAAATAGAGGGCAACGTGTACTTGCAAAACTCCATGCGCTCGATGGACAGTAACACGTGCTACTCCCGCCCCCACATTTACAATTACTAAGAATGCAAACAACAGAGGGTCGATAGAAGGCCAGCTGGGAGAGGAGAACGAGATTTTCACGGAGCGCAAGCTGATCGAGCCGTGCGCCCTCAATCAGAAGCGCTACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTACGTTTACTACGAGAACTACACGTTCGTCCGCTGCCCCCCACGGAAATCGAGGTTATCAGCACGTACGTTGAACTAAACTTGACCCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTCTGCCCCTGGTACACGCGGGCTGAGCTGGAGGACACCGGCCTGCTAGACTACAGCGAAATACAGCGCCGCAACCAGCTCCACGCTCTCAGGGCCATACGTCCCTGTCCGACAGATACAATGACAGGGTTCCGGTTTCGGTGGAGGAGATCTTCGGTCTCATCGACAGTAAGGATGTTCGTCAAAGGCCGAGTACCTCAGAGATAACATCATGCACCACGCGTACCACGACGACGAGGACGAGGTGGAGCTTGATTTGGTGCCGTCCAAGTTTGCAACTCCGGGGGCCAGAGCCTGGCAGACCACCAACGATACTACGTCTTACGTGGGGTGGATGCCATGGAGGCACGTCAACGTCTGTCAACTGCATCGTCGAGGAGGTGGAGGTTGCCGCAACTCGCTCGTCAAGAGTGGCGGAAACAATAGCGCTTGGGTTAACCTTTACCATCTCATTCCAGAGGGTCCGCTGTTTTGTAGTGTACACCACGCAGTTGCTATCCTACTTAGCATCTCATTAACGTGGGATTGGATGTGATCGTATGCAAACTGTAGCCAAACTCAATAGAGGACGTTGTTTTGATTAGCTCTAGTTGTTTGGCGGTGACGTTGGAAGAGTTTGTACTATTCGCAGCCTCCCGTTTGTGTAGGCGATGTAGTATTTGTTCTCTGTGGAGGCTCTCTTGGGTTGGAGTAGGTTCTGGTATTGATAGTAGCGACCTGTCGATTGGTATTATGGTTTGCGTTGGGGTTTAACAGATTTTTTAGGTCATAGG