壁虎醇提物對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706增殖及凋亡蛋白表達(dá)的影響

1/1壁虎醇提物對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706增殖及凋亡蛋白表達(dá)的影響壁虎醇提物對(duì)人食管癌細(xì)胞EC9706增殖及凋亡蛋白表達(dá)的影響作者：

王曉蘭王建剛宋佳玉李瑞芳【摘要】目的研究壁虎醇提物對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞株EC9706的生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制。

方法通過MTT法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間壁虎醇提物對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用;倒置顯微鏡觀察不同濃度壁虎醇提物作用細(xì)胞24h后細(xì)胞形態(tài)的改變;吉姆薩染色后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變;SP免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)。

結(jié)果6～8mg/ml壁虎醇提物作用于細(xì)胞24，48，72h后能夠明顯抑制EC9706食管鱗癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)(Plt;0.01,與陰性對(duì)照比較)，抑制率分別為13%～76%,37%～88%,54%～93%,抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性;Geimsa染色可見凋亡細(xì)胞;免疫組化結(jié)果顯示,壁虎醇提物(6,7mg/ml)處理細(xì)胞24h后，與陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白無明顯變化，而Bax蛋白表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比值升高。

結(jié)論壁虎醇提物能夠抑制EC9706細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值升高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】中藥壁虎;醇提物;食管癌細(xì)胞;凋亡蛋白壁虎又名蝎虎、天龍、守宮，是我國(guó)傳統(tǒng)的治療腫瘤的中藥材，《四川中藥志》關(guān)于壁虎的功效有驅(qū)風(fēng)，破血積包快，治腫瘤的記錄，大量臨床和基礎(chǔ)研究顯示壁虎確有抗腫瘤作用[1,2]。

我們前期工作研究表明干壁虎粉可以抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，抑制小鼠S180肉瘤的增殖，初步探討其抗腫瘤作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，下調(diào)VEGF、bFGF蛋白表達(dá)有關(guān)[3～5]。

本實(shí)驗(yàn)研究了干壁虎的醇提物對(duì)人食管鱗癌EC9706細(xì)胞的增殖和凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，為中藥壁虎抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1器材1.1藥品中藥壁虎(安徽省亳州市永剛飲片有限公司)，批號(hào)：

090301。

1.2細(xì)胞EC9706食管癌細(xì)胞株，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院王立東教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.3試劑絲裂霉素C(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：

H33020786);胎牛血清(Gibco公司);胰酶(Sigma公司);RPMI-1640干粉(Gibco公司);MTT粉劑(Sigma公司);二甲基亞砜(天津市化學(xué)制劑廠);鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)公司)。

1.4儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);倒置顯微鏡XSZ-D2型(重慶光學(xué)儀器廠);超凈工作臺(tái)SP-DJ-2B型(浙江省金沄市榮華儀器制造有限公司);ZS-板式酶標(biāo)儀(中科院生物物理所制造);86-3型超聲儀(上海超聲波儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司);冷凍干燥儀(德國(guó)MARTINCHRIST公司);96、6孔培養(yǎng)板為美國(guó)Costar公司產(chǎn)品。

2方法2.1藥物提取及配制2.1.1壁虎醇提物的提取取干壁虎1000g粉碎，加入一定體積預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液(pH7.4)浸泡過夜后超聲30min，超低溫離心機(jī)離心(8500r/min,20min)，取上清，加入無水乙醇使其終濃度為55%,4℃放置并攪拌(每30分鐘攪拌1次)，4h后離心(8500r/min,20min)，取上清，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(55℃)回收乙醇，濃縮液冷凍干燥得到壁虎醇提物，-20℃保存待用。

以上操作均4℃條件下進(jìn)行。

2.1.2藥物配制將壁虎醇提物以RPMI1640完全培養(yǎng)液配置8mg/ml母液，0.22m微孔濾膜過濾,母液稀釋得7.5，7，6.5，6，5.5mg/ml供實(shí)驗(yàn)用,以上藥物均實(shí)驗(yàn)前新鮮配用。

2.2MTT法[6]測(cè)定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用EC9706細(xì)胞株生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液中,37℃恒溫,5%CO2，95%飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100l，實(shí)驗(yàn)分3組，即實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔并設(shè)空白調(diào)零孔。

將接種EC9706細(xì)胞的培養(yǎng)板置于37℃,5%CO2,95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，棄去原有的培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組分別加入各200l的6種不同濃度壁虎醇提物,陰性對(duì)照組加200l培養(yǎng)液,陽性對(duì)照孔組加終濃度為20g/ml絲裂霉素C200l,混勻后置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24,48,72h后取出培養(yǎng)板，每孔加入20l濃度為5mg/ml的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h終止培養(yǎng),吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入二甲基亞砜150l,置37℃搖床中10min,使結(jié)晶物充分溶解后在酶聯(lián)檢測(cè)儀于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值(OD值),并按下式計(jì)算抑制食管癌細(xì)胞的百分率。

抑制率(%)=[(陰性對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/陰性對(duì)照組平均OD值]100%2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察96孔板細(xì)胞接種方法同MTT法，分別加入5.5，6，6.5，7，7.5，8mg/ml濃度壁虎醇提物作用24h后，取出96孔板在倒置顯微鏡觀察每孔細(xì)胞形態(tài)改變，拍照。

細(xì)胞爬片后，按常規(guī)方法用吉姆薩染色，于光學(xué)顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。

2.4S-P法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液后，以1105個(gè)/ml的細(xì)胞濃度接種于內(nèi)含有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，24h細(xì)胞貼壁后換用新鮮培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和藥物組，實(shí)驗(yàn)組加入6，7mg/ml壁虎醇提物2ml，陽性組加入2ml絲裂霉素C,使其終濃度為20g/ml,陰性對(duì)照組加入同體積的RPMI1640培養(yǎng)液，24h后取出6孔板，細(xì)胞爬片用PBS浸洗，4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS浸洗;0.3%Trixon-100通透液通透30min,PBS浸洗;每張爬片滴加1滴3%過氧化氫，孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性，PBS浸洗;每張爬片滴加1滴封閉用非免疫性動(dòng)物血清，室溫下孵育10min，吸去多余液體;每張爬片滴加1滴鼠抗人Bcl-2一抗，37℃孵育1h，PBS浸洗;每張爬片滴加1滴生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育10min.PBS浸洗;每爬切片滴加1滴鏈親和素一過氧化物酶溶液，37℃孵育10min，PBS浸洗;每張爬片滴加100l新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下掌握顯色程度，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

用同樣方法檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)。

以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照。

Bcl-2陽性表達(dá)在胞漿或胞膜，Bax陽性表達(dá)在胞漿。

每張爬片隨機(jī)選取6個(gè)不同部位，顯微鏡下拍照，應(yīng)用成都泰盟BI-2000生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化陽性細(xì)胞進(jìn)行分析，測(cè)定陽性細(xì)胞的平均光密度值。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料結(jié)果以s表示,Plt;0.05表示差異有顯著性。

3結(jié)果3.1MTT法檢測(cè)結(jié)果5.5，6，6.5，7，7.5，8mg/ml壁虎醇提物作用24h對(duì)EC9706細(xì)胞的抑制率分別為8%，13%，23%，40%，68%，76%;作用48h后對(duì)EC9706細(xì)胞的抑瘤率分別為28%，37%，56%，77%，86%，88%;繼續(xù)作用至72h后，壁虎醇提物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更為明顯，與陰性對(duì)照組比較，壁虎醇提物能夠顯著抑制了EC9706細(xì)胞的生長(zhǎng)(Plt;0.01)，其抑制作用隨時(shí)間、濃度的增加而不斷加強(qiáng)，呈一定劑量依賴性和時(shí)間依賴性(見表1，圖1～2)。

24，48，72h壁虎醇提物的IC50值分別為7.14，6.20，5.80mg/ml。

表1不同濃度壁虎醇提物對(duì)EC9706食管癌細(xì)胞的增殖抑制作用3.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察5.5～8mg/ml壁虎醇提物處理細(xì)胞24h后，倒置顯微鏡下觀察，陰性對(duì)照組細(xì)胞大小均一呈上皮型貼壁生長(zhǎng)，相互連接成片，細(xì)胞多呈梭形，形狀規(guī)則，生長(zhǎng)旺盛。

壁虎醇提物組細(xì)胞胞漿發(fā)生空泡變性，細(xì)胞數(shù)量明顯減少,貼壁細(xì)胞變小、變圓并浮起，形態(tài)完整性受破壞,形成大量細(xì)胞碎片,上述細(xì)胞改變隨藥物濃度增加，表現(xiàn)越明顯。

Geimsa染色顯示,陰性對(duì)照組細(xì)胞胞漿染色較淺呈淡藍(lán)色，胞核染成紫紅色，細(xì)胞胞漿少，核漿比例大，核膜表面光滑，形態(tài)大小均一，核仁清晰可見;7mg/ml壁虎醇提物處理細(xì)胞24h后，部分細(xì)胞呈凋亡形態(tài)改變，細(xì)胞體積縮小，核膜表面不光滑、皺縮，形態(tài)不規(guī)則;染色質(zhì)固縮，核深染。

3.3免疫組化檢測(cè)凋亡蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，壁虎醇提物和絲裂霉素C處理EC9706細(xì)胞24h后，Bax蛋白表達(dá)顯著增加(Plt;0.01),而Bcl-2的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)，Bax/Bcl-2的比值增加。

結(jié)果見表2，圖3～4。

表2壁虎醇提物對(duì)EC9706細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響4討論壁虎雖未被載入《中國(guó)藥典》，但大量的臨床報(bào)道證明，壁虎對(duì)消化道腫瘤治療有獨(dú)特的療效，且毒副作用小[1]。

盡管壁虎抗腫瘤作用明確，但其成分十分復(fù)雜、作用機(jī)制不清楚、臨床適應(yīng)證不明確。

目前對(duì)壁虎抗腫瘤的活性成分研究較少，本課題研究了壁虎醇提物對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞EC9706增殖抑制作用，結(jié)果表明壁虎醇提取物在5.5～8mg/ml劑量下體外以劑量和時(shí)間依賴性的方式抑制人食管癌細(xì)胞株EC9706增殖。

光鏡下可見細(xì)胞隨著藥物濃度增加，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞體積逐漸變小變圓，直至細(xì)胞碎裂。

Giemsa染色可見凋亡細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核表面不光滑、皺縮，形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)固縮，核深染。

細(xì)胞凋亡是一種非常復(fù)雜的生理和病理過程，是受控于基因指導(dǎo)的主動(dòng)性細(xì)胞自我消亡過程，是細(xì)胞固有的功能。

其形態(tài)特征包括細(xì)胞固縮、染色質(zhì)聚集、邊集至核膜下及凋亡小體形成[7]。

現(xiàn)在普遍認(rèn)為，無論藥物的靶點(diǎn)何在，多種化療藥物最終主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死而達(dá)到治療目[8]。

凋亡的線粒體通路主要由Bcl-2家族成員所調(diào)控，該家族可分為兩個(gè)亞群：

一個(gè)亞群Bcl-2，Bid，Bcl-X，Bcl-W等抗凋亡蛋白組成;另一個(gè)亞群由Bax，Bak，Bik，Bcl-xs等促凋亡分子組成[9]。

下調(diào)Bcl-2或上調(diào)Bax可促進(jìn)多種因素誘導(dǎo)的多種腫瘤細(xì)胞凋亡,反之則抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[10]，Bcl-2蛋白與Bax蛋白的比值直接影響著細(xì)胞受到刺激后發(fā)生凋亡的比率，兩者的平衡是決定細(xì)胞死亡和存活的重要因素。

因此，Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)比例具有重要的生理意義。

本研究結(jié)果表明壁虎醇提取物能夠誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株EC9706凋亡，增強(qiáng)Bax的蛋白表達(dá)、通過升高Bax/Bcl-2比值而實(shí)現(xiàn)對(duì)EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)。

綜上所述，壁虎醇提取物對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞株增殖有抑制作用，藥物作用效果具有較明顯的時(shí)-效和量-效關(guān)系，其抑制作用可能通過上調(diào)Bax的表達(dá)，通過改變Bax/Bcl-2的比值而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)中所用的醇提取物乃是一種混合物，其抑制腫瘤作用主要由一種成分起作用還是由多種成分協(xié)同起作用，有待進(jìn)一步研究。

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