尼帕病毒專題知識(shí)講座培訓(xùn)課件

一.病毒因子

1.微生物分類和實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)分級(jí)

尼帕病毒（Nipahvirus，NiV）屬于屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、亨尼帕（Henipavirus）病毒屬中的一員。該屬為新近分類的病毒屬，包括NiV和亨德拉病毒（HendraVirus）２個(gè)病毒成員。根據(jù)衛(wèi)生部《人間傳播的病原微生物名錄》的危害程度分類，NiV屬于第一類病原微生物，涉及病毒培養(yǎng)、未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均要在（A）BSL-4實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20242.流行情況1998年9月至1999年4月馬來西亞爆發(fā)NiV疫情，257人感染，105人死亡，死亡率為40.8%；116萬多頭豬被撲殺。2001年，印度亦發(fā)生NiV傳染，死亡率為75%。2001~2011年孟加拉國先后暴發(fā)8次NiV疫情，平均死亡率為63.6%。泰國和柬埔寨均從果蝠中檢測到NiV。2009年，中國中科院武漢病毒所石正麗研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究組首次發(fā)現(xiàn)中國大陸蝙蝠體內(nèi)存在NiV或尼帕樣病毒抗體，提示我國存在尼帕或類似病毒的自然疫源地。2尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20243尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20243.病毒基因組結(jié)構(gòu)及分類NiV基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，基因組大小為18252bp或18246bp，目前已獲得NiV全長基因序列。NiV有6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，分別編碼6個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白——核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、脂蛋白或吸附蛋白（G）、大蛋白（L）或RNA多聚酶。4尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/2024目前，NiV還沒有統(tǒng)一的分型方法，Chang等通過Genbank所有分離病毒株的N、M、P、F、G和L基因開放閱讀框進(jìn)行序列對(duì)比和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，NiV有三個(gè)進(jìn)化分支，分別是馬來西亞經(jīng)典毒株，柬埔寨分離株，孟加拉分離株。馬來西亞流行的NiV和孟加拉流行的NiV基因組差異較大（同源性為91.8%）。從柬埔寨果蝠中檢測到的NiV與馬來西亞NiV毒株相似。從泰國果蝠中檢測到NiVRNA有一份與馬來西亞NiV毒株的RNA序列類似，另外7份與孟加拉NiV毒株的RNA序列類似。經(jīng)對(duì)印度分離的NiV基因序列分析表明，與孟加拉分離株的同源性在核酸水平為99.2%，氨基酸水平為99.8%，顯示了病毒的同源性。5尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20246尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20244.病原因子的理化特性通過負(fù)染技術(shù)可知,NiV呈多形性或圓形,由囊膜和核衣殼組成,大小為200-300nm,在細(xì)胞膜上完成發(fā)育過程,核衣殼結(jié)構(gòu)呈螺旋形,核衣殼直徑13.0-18.0nm,螺距5.5-7.0nm,外由具有纖突

的囊膜所包被。NiV在體外不穩(wěn)定,對(duì)熱和消毒劑較敏感,NiV在體外不穩(wěn)定，對(duì)熱敏感，56℃30min即可使其滅活。NiV與其它副粘病毒相同，一般的消毒劑諸如0.5%次氯酸鈉、0.5%酚或75%乙醇以及肥皂等清潔劑很容易將其滅活。7尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20245.病毒的培養(yǎng)特性NiV在很多哺乳動(dòng)物細(xì)胞多能生長，如在Vero、BHK細(xì)胞中生長良好，但在昆蟲細(xì)胞中不能生長。在培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生明顯的CPE（cytopathiceffect，致細(xì)胞病變效應(yīng)）。表現(xiàn)為多個(gè)細(xì)胞融合成多核巨細(xì)胞形成特征性合胞體，在細(xì)胞漿中形成包涵體。將臨床標(biāo)本接種細(xì)胞后5-7天就能觀察到病變，如果用高效價(jià)病毒接種Vero細(xì)胞，24小時(shí)后即可看到明顯病變。8尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20246.宿主范圍NiV可以感染多種動(dòng)物，如貓、狗、馬、山羊等，但豬是該病毒的主要傳染源，而果蝠是該病毒的自然宿主，在其尿樣和咬過的水果中，均能分離到到NiV9尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20247.傳播途徑NiV感染患者的唾液、氣管和鼻腔的分泌物以及尿液中，均可分離到病毒。果蝠的尿液與吃剩下的水果中帶有NiV。其流產(chǎn)胎兒和其它分娩產(chǎn)物也可能含有NiV。豬的呼吸道分泌物帶有NiV，也未排除尿液中帶有病毒的可能性。已證實(shí)其它動(dòng)物的感染主要是與感染豬的接觸。2001–2008年孟加拉和印度爆發(fā)疫情原因可能是：1飲食用了被感染果蝠的尿液或唾液污染了的水果或水果產(chǎn)品（如未加工的椰棗汁）。2密切接觸或暴露于感染病人的分泌物或排泄物（如唾液、尿液、嘔吐物或排泄物）導(dǎo)致的NiV直接由人傳染給人。用倉鼠進(jìn)行的氣溶膠傳播實(shí)驗(yàn)表明[1]，NiV通過氣溶膠傳播的可能性較低（EDWit，etal，NipahVirusTransmissioninaHamsterModel.PlosNeglectedTropicalDiseases,

2011,

5(12):e1432）10尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20248.傳播速度NiV在感染豬場之間傳播很快，同一豬場內(nèi)傳播可能是直接通過身體接觸，也可能是健康豬直接接觸病豬的尿、唾液、氣管分泌物等而引起。也可通過垂直傳播，此外也可能是通過使用人工授精等方式傳播。11尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20249.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染劑量金黃地鼠經(jīng)鼻腔內(nèi)接種NiV6×105PFU(plaqueformingunit，噬菌斑形成單位)，接種后9-21天發(fā)病死亡；

非洲綠猴經(jīng)氣管內(nèi)接種NiV2.5×103PFU，接種后12天即可導(dǎo)致動(dòng)物死亡；

雪貂經(jīng)口鼻途徑接種NiV500、5,000、50,000TCID50(Tissuecultureinfectivedose，50%組織細(xì)胞感染量)，可導(dǎo)致雪貂發(fā)熱、食欲不振、重度消沉、咳嗽、流鼻涕、呼吸困難，個(gè)別雪貂見有中樞神經(jīng)障礙癥狀；

豬：經(jīng)口鼻途徑實(shí)驗(yàn)感染（2.5×105PFU）豬可引起輕度臨床癥狀，如體溫升高和輕度呼吸癥狀（呼吸頻率增加和輕度咳嗽），但經(jīng)口腔和皮下接種感染（5×104TCID50）可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀。

12尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/202410.臨床及病理變化NiV感染人：NiV可引起人類腦炎，進(jìn)展快，病死率高。潛伏期為4-60d，90%的病例少于2周。主要臨床癥狀為體溫升高、頭痛、頭暈和嘔吐。50%以上的病例有意識(shí)減退和顯著的腦干功能障礙。其它癥狀還有節(jié)段性肌痙攣、反射消失、肌張力減退、高血壓、心動(dòng)過速等。除中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀外，有一些病例有呼吸道癥狀，如呼吸困難、咳痰，胸部聽診雙側(cè)肺部有啰音。嚴(yán)重的病人可發(fā)生并發(fā)癥，包括敗血癥、胃腸道出血、腎功能損害等。

13尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/2024直接的死因主要是腦炎，特別是累及到腦干。存活者中，75%可完全康復(fù)，其余25%有殘存的神經(jīng)系統(tǒng)損害。在急性期有正常意識(shí)的病人中，經(jīng)過大約2周的平均病程后，均可完全康復(fù)，而在急性期有意識(shí)減低的病人中，僅15%可完全康復(fù)。此外，急性期病人的唾液、氣管和鼻腔的分泌物以及尿液中，均可分離到病毒。人感染NiV后病變最嚴(yán)重的器官是腦，其他器官（如肺、心臟和腎等）也可出現(xiàn)充血等相應(yīng)病變，組織學(xué)檢查可見血管炎，小動(dòng)脈、靜脈與毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷，血管壁壞死、出血和血栓形成等。腦、肺和腎的血管內(nèi)皮有大的融合細(xì)胞形成。出現(xiàn)血管炎的血管周圍有微小壞死和缺血灶。免疫組化法檢測腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、周圍神經(jīng)原細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞，可檢NiV抗原。14尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/2024NiV感染豬：豬病死率低，為5-15%，感染率高達(dá)100%，潛伏期為7-14d。豬的尼帕病毒感染可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)癥狀，但臨床特征隨豬的年齡不同而異。小于６個(gè)月的豬出現(xiàn)急性體溫升高、呼吸困難、咳嗽、發(fā)抖、肌肉抽搐、后肢痙攣性或無力性麻痹、步態(tài)不協(xié)調(diào)等。成年豬可出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、唾液分泌增多、流涕、易激怒、頭部顫動(dòng)、口緊閉、眼球震顫、抽搐，甚至突然死亡，母豬可能早產(chǎn)。

15尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/2024豬感染NiV后肺部可出現(xiàn)不同程度的病變、出血；氣管和支氣管充滿泡沫樣、有時(shí)血水樣液體；腦部充血、水腫；腎也有類似病變。豬的組織病理學(xué)變化與人類似，用免疫組化法檢測，在感染的血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺支氣管上皮細(xì)胞，也可檢出高濃度的尼帕病毒抗原。臨床診斷時(shí)，NiV需要與能夠引起豬急性死亡或呼吸道、神經(jīng)癥狀的疾病加以鑒別。16尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/202411.預(yù)防與治療措施(1)特異性受體近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)ephrinB2配體為尼帕病毒的特異性受體。這一發(fā)現(xiàn)將有助于進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制,并為促進(jìn)有效藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。(2)疫苗研制目前處于研究階段的NiV病疫苗包括DNA疫苗、滅活疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗以及病毒樣粒子疫苗等，雖然在實(shí)驗(yàn)研究過程中呈現(xiàn)了一定保護(hù)效果，但均未進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。17尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/2024(3)治療先前的臨床試驗(yàn)表明，抗病毒藥Ribavirin(利巴韋林)可減少發(fā)熱時(shí)間，緩解癥狀，降低急性腦炎死亡率，其衍生物EICAR、6-氮尿苷(6-aza-uridine)、吡唑呋喃菌素(pyrazo-furin)在體外試驗(yàn)中對(duì)NiV顯示出很強(qiáng)的抑制作用；干擾素誘生劑poly(I)-poly(C12U)在動(dòng)物模型中具有抵抗NiV致死性攻擊的作用。(GEORGES-COURBOTMC,CONTAMINH,FAUREC,etal.Poly(I)-poly(C12U)butnotribavirinpreventsdeathinahamstermodelofNipahvirusinfection[J].AntimicrobAgentsChemother,2006,50:1768-1772.

BOSSARTKN,BRODERCC.DevelopmentstowardseffectivetreatmentsforNipahandHendravirusinfection[J].ExpertRevAntiInfectTher,2006,4:43-55.)18尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20241病原學(xué)檢測

1.1NiV分離鑒定NiV能夠在多種培養(yǎng)細(xì)胞中生長并快速增殖至較高的滴度。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)和兔腎細(xì)胞RK-13細(xì)胞系對(duì)NiV尤為敏感。通常在病毒感染3d內(nèi)能夠觀察到病毒病變效應(yīng)(CPE)，但一般來說在細(xì)胞上傳代2次，每次5d所達(dá)到的分離效果更為穩(wěn)定。經(jīng)低毒量穩(wěn)定傳代后的病毒再次感染細(xì)胞后24-48h，細(xì)胞出現(xiàn)以形成合胞體為特征的CPE，并且感染早期，合胞體中所有細(xì)胞核位于合胞體中央，而晚期則被運(yùn)送至合胞體外，并聚集在其周圍[1]。(HYATTAD，ZAKISR，GOLDSMITHCS，etal.UltrastructureofHendravirusandNipahviruswithinculturedcellsandhostanimals[J].MicrobesInfect，2001，3：297-306)

二.實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

19尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/20241.2分子診斷技術(shù)NiV的基因組全序列已被測出，研究者們可以在此基礎(chǔ)上針對(duì)NiV的分子診斷技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的研發(fā)。目前，已經(jīng)被報(bào)道的針對(duì)NiV的分子檢測技術(shù)有兩種，分別為熒光定量RT-PCR和雙重套式RT-PCR。

20尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/2024(1)熒光定量RT-PCR：該方法敏感度高、特異性強(qiáng)，并且不需要接觸活的感染性病毒，具有生物安全性的優(yōu)勢。其檢測靈敏度可以達(dá)到１PFU[2]

（GUILLAUMEV，LEFEUVREA，F(xiàn)AUREC，etal.SpecificdetectionofNipahvirususingreal-timeRT-PCR(Taqman)[J].JVirolMethods，2004，120:229-237.）并且有被學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)可的相關(guān)引物和探針：Primer1：5’—TCAGCAGGAAGGCAAGAGAGTAA—3’；Primer2：5’—CCCCTTCATCGATATCTTGATCA—3’；Taqmanprobe：5’—6FAM—CCTCCAATGAGCACACCTCCTGCAGT—AMRA—3’為NiV的實(shí)驗(yàn)室快速診斷提供了技術(shù)支持[3]。(MUNGALLBA，MIDDLETOND，CRAMERIG，etal.Felinemodelofacutenipahvirusinfectionandprotectionwithasolubleglycoprotein-basedsubunitvaccine[J].Jvirol，2006，80，12293-12302)21尼帕病毒專題知識(shí)講座8/23/2024(2)雙重套式RT-PCR：Wacharapluesadee等描述了一種帶有內(nèi)參的雙重套式RT-PCR檢測技術(shù)。該技術(shù)能夠用于對(duì)果蝠尿樣的檢測，并且加入內(nèi)參大大降低PCR相關(guān)的抑制因素帶來的假陰性的結(jié)果，提高檢出準(zhǔn)確率，在NiV流行病學(xué)調(diào)查時(shí)大大提高NiV監(jiān)測數(shù)據(jù)的可靠性[4]。(WACHARAPLUESADEES，HEMACHUDHAT.DuplexnestedRT-PCRfordetectionofNipahvirusRNAfromurine