蛋白質(zhì)的純化與鑒定

關(guān)于蛋白質(zhì)的純化與鑒定LectureOutline蛋白質(zhì)的分離純化的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的分離純化原則和程序蛋白質(zhì)的含量測定蛋白質(zhì)純度鑒定蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)層析技術(shù)蛋白層析的主要技術(shù)8/21/20242第2頁,共110頁，星期六，2024年，5月第七部分蛋白層析的主要技術(shù)第3頁,共110頁，星期六，2024年，5月蛋白層析的主要技術(shù)GelFiltrationChromatography(GFC)IonExchangeChromatography(IEXorIEC)AffinityChromatography(AC)HydrophobicInteractionChromatography(HIC)8/21/20244第4頁,共110頁，星期六，2024年，5月I.GelFiltrationChromatography（GFC）第5頁,共110頁，星期六，2024年，5月GelChromatography凝膠過濾（gelfiltration）(Porath,Flodin,1959)分子篩層析（molecularsievechromatography）(Hjertén,Mosbach,1962)排阻層析（exclusionchromatography）(Pedersen,1962)

指混合物隨流動相經(jīng)固定相的層析柱時，混合物中各組份按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。Gelfiltrationisatechniqueofliquidchromatographywhichseparatesmoleculesaccordingtotheirsizes.第6頁,共110頁，星期六，2024年，5月基本原理凝膠層析的數(shù)理關(guān)系凝膠層析的優(yōu)點凝膠層析的缺點凝膠介質(zhì)凝膠類型的選擇其它條件選擇Gelfiltration第7頁,共110頁，星期六，2024年，5月一、基本原理

樣品固定相流動相小分子被延滯小分子大分子較快流出

分子篩效應分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。第8頁,共110頁，星期六，2024年，5月（一）純化：對生物大分子的純化。如病毒、蛋白質(zhì)、酶、激素、抗體、核酸和多糖等。應用：第9頁,共110頁，星期六，2024年，5月Gelfiltrationpurificationofanenzyme:

SDSanalysisM-LMWmarkers1-Startmaterial2-Poolfromionexchange3-PoolfromHIC4-PoolfromSuperdex75pg4321MM67k43k30k第10頁,共110頁，星期六，2024年，5月（二）分子量的測定：球形蛋白質(zhì)的洗脫體積主要是由它的分子量決定的，在一個相當?shù)姆肿恿糠秶鷥?nèi)，洗脫體積大約是分子量對數(shù)的線性函數(shù)。用相同形狀的和已知的蛋白質(zhì)作出一條校正曲線，測定洗脫體積后可從校正曲線得到分子量。第11頁,共110頁，星期六，2024年，5月Highlyefficientdesaltinginlessthan1minute

（三）溶液的濃縮：加入干膠，溶液的水和小分子被膨脹的凝膠吸收。（四）去除干擾的小分子：脫鹽（鹽可被看作是小分子）、EDTA、生物標記等。1020304050secAlbuminNaCl第12頁,共110頁，星期六，2024年，5月（五）更換緩沖液：為接下來的實驗更換緩沖液體系（六）測定平衡常數(shù)：例如藥物的蛋白結(jié)合率。藥物本身分子量較小，與蛋白結(jié)合后成為分子量較大的物質(zhì)，通過凝膠過濾將二者分開。第13頁,共110頁，星期六，2024年，5月二、凝膠層析的數(shù)理關(guān)系

1、柱床體積(VT)

2、洗脫體積（Ve）即欲分離物質(zhì)通過層析柱洗脫下來所需洗脫液的總體積。3、外水體積（V0）4、內(nèi)水體積（Vi）5、凝膠干體積（Vg）6、分配系數(shù)（Kd）

第14頁,共110頁，星期六，2024年，5月柱床體積VT凝膠干體積Vg內(nèi)水體積Vi存在于柱床內(nèi)凝膠外面空隙之間的水相體積，相應于一般層析法中流動相的體積。顆粒內(nèi)部所含水相的體積它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量相減求得。凝膠體積以及顆粒內(nèi)外間隙體積的總和。

VT=1/4

D2h外水體積V0VT=Vg+V0+Vi數(shù)理關(guān)系VoidvolumeVoVolumeofthegelmatrixVgPorevolumeVi第15頁,共110頁，星期六，2024年，5月洗脫體積VeVoVeVolumeConcentration第16頁,共110頁，星期六，2024年，5月

Ve-VoKd=————Vi分配系數(shù)（Kd

）：特點：（1）與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮∮嘘P(guān)（2）與柱的長短粗細無關(guān)

每個溶質(zhì)分子在流動相和固定相之間有一個特定的分配系數(shù)（Kd）Ve=Vo+KdViKdisdifficulttogetbecauseViisdifficulttomeasure第17頁,共110頁，星期六，2024年，5月(3)Ve=Vo+ViKd=1分子完全不被排阻完全向凝膠顆粒內(nèi)部擴散在兩相分配的比值為1,最后流出.(1)Ve=VoKd=0分子完全被排阻于凝膠顆粒之外全部分布于流動相里,最先流出。(2)0<Kd<1Ve=Vo+ViKd為溶質(zhì)以某種程度向凝膠顆粒內(nèi)擴散

Kd=0

0＜Kd<1

Kd=1洗脫體積第18頁,共110頁，星期六，2024年，5月

三.凝膠層析的優(yōu)點

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。凝膠本身不與樣品發(fā)生化學反應。

2.操作條件較溫和。用來分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)。

3.樣品得率高,重復性好,可進行大量樣品的分離純化。4.最快的更換緩沖液第19頁,共110頁，星期六，2024年，5月四、凝膠層析的缺點1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用。如芳香族化合物與脂蛋白等。第20頁,共110頁，星期六，2024年，5月葡聚糖（glucose）瓊脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纖維素（cellulose）五、凝膠介質(zhì)第21頁,共110頁，星期六，2024年，5月

1959年P(guān)orath和Flodin合成（商品名為Sephadex）（1）結(jié)構(gòu)：基本骨架：葡聚糖（dextran）交聯(lián)劑：3-氯代-1,2-環(huán)氧氯丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。1.葡聚糖凝膠第22頁,共110頁，星期六，2024年，5月（2）特點：交聯(lián)度：交聯(lián)劑越多，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密?？紫队。笈蛎浺灿?，機械強度高，分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低，分離物質(zhì)的分子量大?；瘜W性質(zhì)：

穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸、堿和一般有機溶劑,耐熱耐堿不耐強酸第23頁,共110頁，星期六，2024年，5月Sephadex的分級范圍

G10<700G15<1,500G251,000~5,000G501,500~30,000G753,000~70,000G1004,000~150,000G1505,000~400,000G2005,000~800,000吸水性G類的型號表示每克干凝膠吸水量（ml）x10如G-50

每克干凝膠吸水量為5ml。第24頁,共110頁，星期六，2024年，5月由瓊脂制成的線性多糖，由D-半乳糖和3，6-脫水L-半乳糖交替組成。大孔凝膠，工作范圍的下限幾乎是Sephadex的上限，可分離MW40萬以上的物質(zhì)，可用來分離核酸及病毒瓊脂糖凝膠不帶電荷，不受微生物作用而降解對實驗條件要求高(溫度＜40℃,pH=4.5-9.0)2.瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose，Biogel-A)第25頁,共110頁，星期六，2024年，5月型號

近似的瓊脂糖濃度(%)多糖

蛋白質(zhì)

Sepharose2B

220×106

40×106Sepharose4B45×106

20×106Sepharose6B61×106

4×106第26頁,共110頁，星期六，2024年，5月是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似，但化學性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定，可在pH2-11范圍內(nèi)使用.3、聚丙烯酰胺凝膠第27頁,共110頁，星期六，2024年，5月■各種層析膠體：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGelPBioGelAacrylamideagarose第28頁,共110頁，星期六，2024年，5月

1.組分離：當兩種成分分子量差距很大時采用，例如脫鹽。凝膠選擇使高分子量的洗脫體積在外水（Vo），低分子量的洗脫體積接近Vt。脫鹽一般推薦SephadexG-25。2.分級分離：當分離幾種分子量接近的組分時，避免幾種成分的洗脫體積接近Vo或Vt。3.分子量測定：要使樣品分子量落在選擇性曲線的線性部分及處于校正標準品的中間。一般推薦使用SephacrylS-200superfine,SephacrylS-300superfine或SepharoseCL-6B。六、凝膠類型的選擇第29頁,共110頁，星期六，2024年，5月七.其它條件選擇

1.柱的選擇

長的層析柱分辨率要比短的高。但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過1m，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。2.樣品的選擇：樣品體積占床體積的1-5%,粘度小。

3.洗脫液的選擇：完全不帶電荷的物質(zhì)可以用蒸餾水洗脫。帶電荷的物質(zhì)可以用Tris-HCl、磷酸鹽緩沖液，最重要的要考慮洗脫液對樣品的作用，如pH、離子強度、清潔劑等，是否會引起蛋白分解，影響酶、輔酶、激素的活性。第30頁,共110頁，星期六，2024年，5月

八、凝膠過濾的實驗（一）、凝膠的準備

Sephadex干粉狀，用前需要膨脹，一般用蒸餾水進行，注意不要用電磁攪拌，以免破壞凝膠顆粒。不同類型的凝膠膨脹的時間不同：

G-25,G-50膨脹過夜

G-75一天

G-100二天

G-200三天在沸水中膨脹可縮短時間，并可除去氣體。

Sephacryl,Sepharose,SepharoseCL是膨脹好的。第31頁,共110頁，星期六，2024年，5月

（二）、裝柱將凝膠懸液調(diào)成大約75%。用負壓泵脫氣。如果是加熱后或冰箱中取出，要放置達室溫。層析柱放置在避免過度通風和陽光直射的地方，防止溫度變化。排掉層析床支持物內(nèi)的氣體。層析柱調(diào)到垂直位置。凝膠懸液要一次倒入柱內(nèi)，避免分層。第32頁,共110頁，星期六，2024年，5月

（三）、檢查層析柱以藍葡聚糖2000（2mg/ml）為樣品，觀察色帶在柱內(nèi)洗脫時移動的形狀判斷層析柱的質(zhì)量，同時其洗脫體積又可作為外水體積。（四）、加樣

1.手工加樣

2.加樣閥加樣要求進入凝膠的樣品前緣在同一水平。（五）、洗脫洗脫裝置用蠕動泵將洗脫液泵入層析柱。要注意洗脫液的供給，不要走干，一旦走干，層析柱必須重新裝才能使用。（六）、凝膠的清洗凝膠在使用數(shù)次后，一些雜質(zhì)會吸附到上面，影響分離效果，需清洗后才能恢復原樣。

Sephadex,，Sepacryl，SepharoseCL可用0.2MNaOH。

Sepharose可用4<pH<9緩沖液及非離子清潔劑。第33頁,共110頁，星期六，2024年，5月

(七)、凝膠的儲存和防止微生物生長使用中的柱子里，因為有緩沖液的不斷流動，微生物不易生長，未用的柱子和放在容器中的凝膠懸液要采用抗菌劑預防微生物的生長，抗菌劑必須不與樣品作用。通常用的防腐劑有：疊氮鈉0.02%，三氯丁醇0.05%，硫柳汞0.005%，洗必太0.002%，汞苯鹽（乙酸:硝酸）0.001-0.01%。

Sephadex,，Sephacryl,，Sepharose和SepharoseCL都可以在加防腐劑后以膨脹狀態(tài)儲存。最好在4℃冷藏，但要防止凍結(jié)，因為凍結(jié)將破壞凝膠顆粒。

Sephadex可以干燥后儲存，干燥的程序是徹底清洗膠，除掉鹽和雜質(zhì)，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，換稍濃一些的乙醇，依次增加乙醇的濃度，最后用96%乙醇，使膠皺縮，布氏漏斗抽慮，60-80℃烘干。第34頁,共110頁，星期六，2024年，5月II.IonExchangeChromatographyUsefulatallstagesofpurificationandatallscales第35頁,共110頁，星期六，2024年，5月基本原理離子交換劑的類型離子交換劑與緩沖液的選擇應用離子交換層析的優(yōu)點IonExchangeChromatography第36頁,共110頁，星期六，2024年，5月一、原理用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動相中的某種離子進行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型混合物的層析方法。第37頁,共110頁，星期六，2024年，5月低鹽高鹽分離結(jié)束第38頁,共110頁，星期六，2024年，5月帶電荷不同蛋白在特定pH值下有不同帶電性質(zhì)第39頁,共110頁，星期六，2024年，5月離子交換樹脂如何分離蛋白質(zhì)洗脫樹脂與樹脂結(jié)合力第40頁,共110頁，星期六，2024年，5月二、離子交換劑的類型在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團（一）按活性功能基團帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑——

帶負電荷，與陽離子交換陰離子交換劑——帶正電荷，與陰離子交換?

陰離子交換樹脂對化學試劑及熱都不如陽離子交換樹脂穩(wěn)定。膠體膠體第41頁,共110頁，星期六，2024年，5月陽離子交換基強酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂第42頁,共110頁，星期六，2024年，5月陰離子交換基強堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素第43頁,共110頁，星期六，2024年，5月

基質(zhì)電荷基團反離子商品名纖維素—O—CH2——COO-

·Na+CM-纖維素纖維素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2·Cl-DEAE-纖維素聚苯乙烯—————SO3-·

Na+732陽離子樹脂

聚苯乙烯——N+（CH2）4·Cl-717陰離子樹脂第44頁,共110頁，星期六，2024年，5月離子交換樹脂離子交換纖維素離子交換凝膠（二）按載體種類不同第45頁,共110頁，星期六，2024年，5月1.離子交換樹脂：聚苯乙烯樹脂：苯乙烯二乙烯苯聚苯乙烯母體交聯(lián)劑第46頁,共110頁，星期六，2024年，5月離子交換樹脂的性質(zhì)1、一般離子交換劑的特性多孔性：疏松、多孔網(wǎng)狀，活性基團在網(wǎng)孔內(nèi)不溶性：不溶于稀酸、稀堿、有機溶劑穩(wěn)定性：離子交換性：具相當數(shù)量的可交換或帶電基團第47頁,共110頁，星期六，2024年，5月Dowex100149

mDowex50297

mDowex20840

m

2、交聯(lián)度：

合成樹脂時所用的交聯(lián)劑在原料總重量中所占的百分比交聯(lián)度越大樹脂的網(wǎng)孔越小膨脹性小交換量少交聯(lián)度越小樹脂的網(wǎng)孔越大膨脹性大交換量大

膨脹性增加易引起樹脂的機械變形破損第48頁,共110頁，星期六，2024年，5月陽離子交換樹脂

強酸型磺酸基

-SO3-H+

中等酸型磷酸根

-O-PO2H2

亞磷酸根-O-POH2

弱酸型羧基-COOH陰離子交換樹脂

強堿季胺基團[-N+(CH3)3]

弱堿叔胺、仲胺、伯胺基團

可引入的解離基團第49頁,共110頁，星期六，2024年，5月操作過程：

1.裝柱；

2.離子交換；

3.洗脫第50頁,共110頁，星期六，2024年，5月三、離子交換劑與緩沖液的選擇（一）離子交換劑的選擇必須考慮的影響因素1．陰、陽離子交換劑的選擇2．強、弱離子交換劑的選擇3．不同離子型交換劑的選擇4．不同基質(zhì)離子交換劑的選擇第51頁,共110頁，星期六，2024年，5月陰、陽離子交換劑的選擇測定pI確定穩(wěn)定pH范圍堿性分子在偏酸性環(huán)境中穩(wěn)定：細胞色素c

酸性分子在偏堿性環(huán)境中穩(wěn)定：核酸、HCG第52頁,共110頁，星期六，2024年，5月離子交換劑的選擇圖第53頁,共110頁，星期六，2024年，5月不同離子型交換劑的選擇選用何種類型離子交換劑?取決于離子交換劑對諸反離子的結(jié)合力。為了提高交換容量，一般應選擇結(jié)合力較小的反離子。據(jù)此，強陽性和強陰性離于交換劑應分別選擇H型和OH型；弱酸性和弱堿性離子交換劑應分別選擇Na型和Cl型。第54頁,共110頁，星期六，2024年，5月不同基質(zhì)離子交換劑的選擇1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小

大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素第55頁,共110頁，星期六，2024年，5月1、緩沖液pH的選擇

2、緩沖液離子組成的選擇3、緩沖液離子強度的選擇（二）緩沖液的選擇第56頁,共110頁，星期六，2024年，5月1、緩沖液pH的選擇

①要求：起始緩沖液能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，洗脫液能使有效成分從離子交換劑上解離下來。②pH值與目標物pI的關(guān)系（pH=pI±1）③選用弱陽離子交換劑時，pH高于其pK；選用弱陰離子交換劑時，pH低于其pK；第57頁,共110頁，星期六，2024年，5月2、緩沖液離子組成的選擇①采用陽離子交換劑應選用陰離子緩沖液，如：磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽②采用陰離子交換劑應選用陽離子緩沖液，如：Tris③緩沖液離子不影響被分離物的活性、測定、溶解度。第58頁,共110頁，星期六，2024年，5月3、緩沖液離子強度的選擇①起始緩沖液能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，一般小于0.1mol/L。②洗脫液能使有效成分從離子交換劑上解離下來，一般0.15mol/L（或采用pH洗脫）。第59頁,共110頁，星期六，2024年，5月

原則：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離子或基團

改變pH或離子強度

增強洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力洗脫方式：梯度洗脫(三)洗脫劑的選擇第60頁,共110頁，星期六，2024年，5月四、應用

分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及他帶電的生物分子。第61頁,共110頁，星期六，2024年，5月五、離子交換層析的優(yōu)點應用范圍廣：20種氨基酸中，大部分帶正電或負電。處理量大，附載系數(shù)高，一步縮小樣品體積很多。去除雜質(zhì)能力強，如對核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及電荷性有差別的蛋白均可去除。分離能力強?？煞旁诩兓に嚨娜魏我徊?。第62頁,共110頁，星期六，2024年，5月III.AffinityChromatography(AC)

親和層析

第63頁,共110頁，星期六，2024年，5月親和層析ACAffinitychromatographyisatechniqueofliquidchromatographywhichseparatesbiomoleculesthroughbiospecificinteractions.基本原理分離過程特點應用第64頁,共110頁，星期六，2024年，5月一、原理生物分子間存在很多特異性的相互作用，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合，這種結(jié)合力就稱為親和力。親和層析通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行分離純化。第65頁,共110頁，星期六，2024年，5月酶：基質(zhì)類似物，抑制劑，輔酶抗體：抗原，病毒，細胞細胞：細胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸：互補堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶，結(jié)合蛋白激素或藥物：受體，載體蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，細胞表面受體，細胞具有專一性親和力的生物分子對第66頁,共110頁，星期六，2024年，5月DefinitionsinAffinityChromatographyMatrix(基質(zhì)或載體):aninertgeltowhichaligandcanbecoupledLigand(配基):acomponentwhichinteractsspecificallywiththetargetCoupling(偶聯(lián)):covalentattachmentoftheligandtothematrixBinding(結(jié)合):associationbetweentheligandandthetargetMatrixSpecificligand第67頁,共110頁，星期六，2024年，5月第68頁,共110頁，星期六，2024年，5月（一）載體的選擇1、載體要求：（1）不溶性（2）滲透性：疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有良好的液體流動性（3）化學和機械性能穩(wěn)定（4）具備大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蝕第69頁,共110頁，星期六，2024年，5月2、常用載體（1）纖維素特點：價廉、來源充足纖維性、非均一性限制大分子的摻入非專一性吸附嚴重用于抗體和酶的純化（2）葡聚糖凝膠特點：化學及物理性質(zhì)穩(wěn)定多孔性比瓊脂糖低第70頁,共110頁，星期六，2024年，5月

（3）瓊脂糖凝膠濃度商品2％Sepharose2B4%Sepharose4B6%Sepharose6B

凝膠濃度越低結(jié)構(gòu)越疏松即多孔性越高機械強度越低第71頁,共110頁，星期六，2024年，5月（4）聚丙烯酰胺凝膠（5）多孔玻璃特點：不受微生物的侵蝕耐酸、堿、有機溶劑表面非專一性吸附特點：物理化學性質(zhì)穩(wěn)定抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強可供化學反應的酰胺基較多第72頁,共110頁，星期六，2024年，5月（二）配基的選擇1、對于欲純化的物質(zhì)應有專一親和力2、必須具備能被修飾的功能基團3、配基偶聯(lián)的位置，需不影響與大分子連接的部位。4、親和柱制備首選大分子配基。第73頁,共110頁，星期六，2024年，5月以酶和底物為例：E+LELKL=[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0：起始濃度當L0》E0時KL=[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/KLKd=結(jié)合酶/游離酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KLKLKL：解離常數(shù)E：酶L：底物EL：復合物第74頁,共110頁，星期六，2024年，5月（三）固相化——將配體以共價鍵連接于固相基質(zhì)上制成固相化吸附劑載體的排斥效應小孔經(jīng)凝膠會明顯阻止大分子物與配基結(jié)合載體的空間障礙載體影響了配基的空間，特別是小分子配基。需加碳氫鏈“手臂”，長度需適中。第75頁,共110頁，星期六，2024年，5月二、親和層析的過程1、裝柱和平衡2、上樣、親和吸附3、洗脫無效洗脫吸附效率不高有效吸附第76頁,共110頁，星期六，2024年，5月影響吸附的因素

1、緩沖液離子成份強度、pH、溫度等都有影響。

2、流速盡可能慢，<10ml/cm2/小時3、上柱樣品用平衡層析柱緩沖液溶解，濃度約20mg蛋白/ml.

4、上樣體積取決于親和力，低則上樣量減少，一般柱床體積的5％。

第77頁,共110頁，星期六，2024年，5月

（1）非特異性洗脫法：需改變緩沖液的pH，離子濃度，介電常數(shù)和溫度。a．分段洗脫法：在惰性蛋白質(zhì)流出后，更換緩沖液，包括組成，pH、離子濃度或溫度的改變

b．梯度洗脫法：連續(xù)改變緩沖液濃度，使洗脫能力逐漸加強（2）特殊洗脫：當?shù)鞍孜骄o密或上述方法洗脫會引起失活，可用專一的化學方法裂解配基與載體的連接鍵，再用透析或凝膠層析法去除配基。洗脫方法第78頁,共110頁，星期六，2024年，5月

（3）專一洗脫技術(shù)

a.競爭性效應：用與固定配基相同的游離配基進行洗脫。b.陰性洗脫：在雙底物或多底物存在的親和系統(tǒng)中，如果撤掉其中某一底物，使被吸附的大分子解吸附。例：在前導底物100uMNADH存在下，乳酸脫氫酶強烈吸留在固定的丙酮酸類似物上，在洗脫液中不含NADH時，脫氫酶被迅速洗脫。第79頁,共110頁，星期六，2024年，5月

已使用過的柱，經(jīng)過再生，去除非特異吸附的雜質(zhì)后，可重復使用。再生步驟：起始緩沖液重復平衡一次用高離子強度和低離子強度溶液處理用弱酸或弱堿溶液處理4、親和柱的再生：第80頁,共110頁，星期六，2024年，5月三、特點1、只需一步純化步驟，非常簡單2、產(chǎn)物非常純＞95%第81頁,共110頁，星期六，2024年，5月三、特點3、可從很稀的溶液中純化到所需物質(zhì)4、還可去除已變性或部分降解物質(zhì)5、但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應用范圍受到了一定的限制6、載體較昂貴，機械強度低，配基制備困難，有的配基本身要經(jīng)過分離純化第82頁,共110頁，星期六，2024年，5月四、應用1、分離和純化2、分辨化學或遺傳學上修飾的酶3、純化親和標記的活化中心肽段和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究4、純化人工合成的多肽和蛋白質(zhì)5、解釋酶作用機理第83頁,共110頁，星期六，2024年，5月IV.Hydrophobicinteractionchromatography（HIC）疏水層析第84頁,共110頁，星期六，2024年，5月基本原理操作介質(zhì)的選擇配基的選擇疏水層析的影響因素疏水層析的優(yōu)點疏水層析第85頁,共110頁，星期六，2024年，5月

疏水層析亦稱疏水作用層析(hydrophobicinteractionchromatography，HIC)，它也屬于吸附層析一類,通過表面疏水性的差異來分離蛋白質(zhì)的柱層析方法。一、疏水層析的原理第86頁,共110頁，星期六，2024年，5月

不同蛋白質(zhì)表面及內(nèi)部疏水區(qū)的多少、大小、強弱、分布及空間位阻效應各不相同，這也是HIC分離蛋白質(zhì)的根本所在。在20種氨基酸中有8種是疏水性氨基酸，其強弱順序為Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。第87頁,共110頁，星期六，2024年，5月第88頁,共110頁，星期六，2024年，5月（一）疏水作用蛋白質(zhì)與固定相結(jié)合原理蛋白質(zhì)表面存在的疏水補丁蛋白質(zhì)發(fā)生（局部可逆性）變性時，原本隱藏于分子內(nèi)部的疏水殘基暴露至分子表面疏水層析的特性：即在高鹽濃度下，暴露于分子表面的疏水殘基容易與疏水性固定相結(jié)合洗脫原理

通過降低流動相的離子強度，將結(jié)合于固定相的物質(zhì)按結(jié)合能力的大小依次洗脫下來（疏水作用弱的物質(zhì)先被洗脫下來，隨著離子強度的進一步降低，結(jié)合能力強的物質(zhì)也被逐漸洗脫）第89頁,共110頁，星期六，2024年，5月（二）吸附劑根據(jù)基質(zhì)的性質(zhì)不同分為：1.親水性吸附劑：目前這類吸附劑主要是交聯(lián)瓊脂糖（Sepharose）,配體有苯基和辛基化合物。二者耦合而成特點：不耐壓，一般僅用于常壓層析系統(tǒng)2.非親水性吸附劑：這類吸附劑的基質(zhì)有硅膠、樹脂等，配體為苯基、辛基和烷基等，二者通過共價鍵結(jié)合特點：耐壓，機械性能好。不僅適用于常壓層析，特別適用于高壓層析（如HPLC等）第90頁,共110頁，星期六，2024年，5月二、操作1.制備層析柱2.加樣與洗脫3.層析柱再生第91頁,共110頁，星期六，2024年，5月Equilibration1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionEquilibratethecolumnandadjustthesampletobindingconditionsHydrophobicligandGelmatrixWatermolecules第92頁,共110頁，星期六，2024年，5月Sampleapplication1.Equilibration2.Sampleapplication3.

Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroups第93頁,共110頁，星期六，2024年，5月Washingoutunboundmaterial1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-boundproteins第94頁,共110頁，星期六，2024年，5月Elution1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionTargetelutesConc.saltAbs第95頁,共110頁，星期六，2024年，5月ElutionConc.saltAbs1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionMorestronglyboundproteins第96頁,共110頁，星期六，2024年，5月樣品的準備：往樣品中添加足夠濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達到與平衡液基本一致，并調(diào)節(jié)樣品溶液的pH使其滿足吸附條件。HIC的樣品體積受樣品中組分濃度和介質(zhì)的結(jié)合容量的影響，對于稀釋樣品無需濃縮可以直接加樣第97頁,共110頁，星期六，2024年，5月洗脫的方式：

采用降低流動相中鹽濃度的方式洗脫（最常用）；通過往流動相中添加有機溶劑，如：乙二醇、丙醇、異丙醇等，降低流動相極性的方式洗脫（溶劑中穩(wěn)定性良好的物質(zhì)）往流動相中添加去污劑等，去污劑本身能與介質(zhì)發(fā)生強烈吸附，從而將結(jié)合在其上的目標組分置換下來（分離膜蛋白）第98頁,共110頁，星期六，2024年，5月洗脫理論：疏溶劑理論：1976年由Sinanoglu等人提出，認為由于溶質(zhì)分子有減少其與水接觸的非極性表面的傾向，而增加了與疏水配基結(jié)合的概率。自由能分離理論：1979年Vanoss等人提出，認為生物體界面自由能比水低，與配基產(chǎn)生范德華力，這個引力隨溶液鹽析能力的改變而改變。熵分離理論：1984年Regnier提出，認為高鹽溶液中，蛋白質(zhì)疏水區(qū)域的鄰近分子是有序排列，疏水部分易于配基結(jié)合，減弱了水分子排列的有序度，表面水分子被排斥開，使體系熵增加。第99頁,共110頁，星期六，2024年，5月三、介質(zhì)的選擇主要有多糖類如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類。其中，半剛性的瓊脂糖類凝膠仍是應用最廣泛的疏水介質(zhì)；

近年來研制超大瓊脂糖(superporous)，在擴散孔的基礎(chǔ)上增加了對流孔，在流速較高的條件下獲較好的分辨率；殼聚糖具有良好的生物相容性和化學穩(wěn)定性，近年來在疏水層析中也得到了應用。

第100頁,共110頁，星期六，2024年，5月介質(zhì)的再生、貯存再生：常規(guī)用蒸餾水清洗，如有疏水性很強的物質(zhì)如脂類、變性蛋白等牢固結(jié)合在介質(zhì)上，則需合適的清洗劑進行清洗，NaOH溶液是其中常用的一種清洗劑，它在清洗層析柱的同時還能使微生物鈍化失活起到消毒的效果。此外，促溶鹽類的水溶液也是良好的清洗劑。貯存：一般懸浮在20%的乙醇中，如在水溶液體系中保存，則需添加一定量的防腐劑，以防止微生物