蛋白質組學研究技術進展

關于蛋白質組學研究技術進展蛋白質組學背景隨著人類基因組計劃的完成和對基因組研究的深入，人們認識到單純依靠基因組信息并不可能完全揭示生命的奧秘。這是因為蛋白質才是生物功能的體現者，所以必需考慮基因編碼的蛋白質具有什么功能。第2頁,共47頁，星期六，2024年，5月不僅如此，基因在轉錄和翻譯過程中存在轉錄和翻譯水平的調控,蛋白質往往還要經過剪接、修飾、加工之后，最終才能成為有功能的蛋白質；而且生物體不同組織、不同分化程度和在不同環(huán)境下，所表達的蛋白質是不同的，所以單純從基因組水平上并不能完全揭示生命活動的規(guī)律。在這種背景下，蛋白質組學應運而生。1994年，MarcWilkim在Siena雙向凝膠電泳(two—dimen．sionalelectrophoresis，2-DE)會議上最早提出了蛋白質組(proteome)概念，并于1995年7月的Electrophoresis(電泳)雜志上發(fā)表。第3頁,共47頁，星期六，2024年，5月蛋白質組學是以生物體的全部或部分蛋白為研究對象，研究它們在生命活動過程中的作用、功能。蛋白質組學較之前的基因組學對于生命現象的解釋更直接、更準確。蛋白質對生命活動的直接作用比基因復雜得多．對于某一種生物或有機體來說，基因組是唯一的，而蛋白質組隨細胞的種類、功能、生理狀態(tài)、環(huán)境條件和病理狀態(tài)而不斷變化，因此僅僅從基因的角度來研究是不夠的。第4頁,共47頁，星期六，2024年，5月

隨著對蛋白質組學的深入理解和具體工作的開展，人們逐漸認識到在短時間內建立蛋白質組學“完整的”數據庫和實現網絡資源共享是難以實現的，因為條件尚未成熟。于是結構蛋白質組學研究著重于尋找和篩選任何有意義的因素引起的2個樣本之間的差異蛋白質譜，揭示細胞生理和病理狀態(tài)的進程與本質、對外界環(huán)境刺激的反應途徑，以及細胞調控機制，同時獲得對某些關鍵蛋白的定性和功能分析，因此，差異蛋白質組學研究技術應運而生。第5頁,共47頁，星期六，2024年，5月1、雙向凝膠電泳技術1975年,意大利生化學家O’Farrell（奧法雷爾）發(fā)明了雙向電泳(two—dimensionalgeleldctropgoresis，2-DE)技術。該技術應用兩個不同分離原理為依據進行分離，即利用蛋白質分子的等電點(PI)和相對分子量的不同進行分離．第一向電泳是蛋白質的等電聚焦，根據蛋白質等電點差異進行分離，該分離技術采用固定pH梯度技術(IPG)可以實現等電點只差0．01pH單位的蛋白質的分離；第二向電泳是利用蛋白質相對分子量差異進行分離，可分離相對分子量在100×103～150×103的蛋白質。第6頁,共47頁，星期六，2024年，5月第7頁,共47頁，星期六，2024年，5月例如：番茄種子空間搭載與地面后代葉片的差異蛋白質組研究。CK-2是對照組，MIR-2是實驗組。第8頁,共47頁，星期六，2024年，5月圖1用不同裂解液裂解后的CK-2雙向電泳圖左圖裂解液中的去垢劑用的是CHAPS,右圖裂解液中的去垢劑是NP-40。第9頁,共47頁，星期六，2024年，5月圖2

對照樣品CK以及和平號搭載樣品MIR的雙向電泳結果圖第10頁,共47頁，星期六，2024年，5月樣品MIR-2和對照組CK-2的雙向電泳結果進行了IMAGEMASTER軟件分析,共找到了42個表達差異2倍以上的蛋白質點,對其中26個差異比較明顯的蛋白質點進行了ESIQ-TOFMS/MS質譜分析,共鑒定出10個蛋白質點,鑒定的蛋白質在對照組均表現為上調,在空間站搭載樣品中表現為下調。第11頁,共47頁，星期六，2024年，5月2-DE的局限性:重復性差;自動化程度低,費時費力;對過大(>100ku)和過小(<10ku)的分子量的蛋白質、低豐度蛋白質(<1000copies)、極酸或極堿和難溶的蛋白質如膜蛋白等分離困難。第12頁,共47頁，星期六，2024年，5月2、雙向差異凝膠電泳技術

雙向差異凝膠電泳(twodimensiondifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)是一種新出現的熒光標記的定量蛋白質組學技術，比經典的2-DE具有更高的動力學范圍和靈敏性。該方法通過引入內標使得多個樣品在一塊膠上分離，進而減少了實驗條件不一致引起的誤差。DIGE技術可檢測到表達差異小于10％的蛋白，統(tǒng)計學可信度達到95％以上。第13頁,共47頁，星期六，2024年，5月DIGE系統(tǒng)基于熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)技術，是利用電荷和分子量的差異分離蛋白質混合物，并通過多通道激光掃描分析不同蛋白質的第二向SDS凝膠圖像。DIGE系統(tǒng)結合了新型熒光技術、樣品多路技術(samplemultiplexing)和圖像分析等特有的技術，是一套優(yōu)于經典的2-DE的完整的系統(tǒng)。第14頁,共47頁，星期六，2024年，5月DIGE的試驗流程AmershamPharmaciaBiotech,LifeScienceNews,7,2001

第15頁,共47頁，星期六，2024年，5月例如：曹曉艷等利用雙向差異凝膠電泳技術和質譜檢測技術在“新世紀”杏的小蕾期、大蕾期、自花授粉后24h、異花授粉24h后的花柱中共檢測到1500個蛋白點，其中66個差異表達的蛋白點，證明“新世紀”杏花花柱對自體與異體花粉感應在蛋白質組水平上有差異。第16頁,共47頁，星期六，2024年，5月a小蕾期b大蕾期c自花授粉后24hd異花授粉后24h第17頁,共47頁，星期六，2024年，5月DIGE技術與傳統(tǒng)的2-DE方法相比,優(yōu)點在于:重復性大大提高、蛋白質樣品的差異表達更精確直觀、動態(tài)范圍更寬、染色時間短、熒光標記不會影響質譜分析結果。缺點是其標記方法只適用于含有賴氨酸的蛋白質;對于賴氨酸含量少的蛋白質的DIGE標記有一定的困難。因為只有一小部分蛋白質被標記,大部分蛋白質在Cy3、Cy5標記的譜圖上看不到。第18頁,共47頁，星期六，2024年，5月3、同位素親和標簽技術同位素親和標記(isotope-codedaffinitytags,ICAT)技術最早由Gygi等提出。ICAT技術是利用一種新的化學試劑-同位素親和標簽試劑預先選擇性地標記某一類蛋白質,分離純化后,質譜(massspectrometry,MS)鑒定。并根據質譜圖上不同ICAT試劑標記的一對肽段離子的強度比例,定量分析它的母體蛋白質在原來細胞中的相對豐度。第19頁,共47頁，星期六，2024年，5月ICAT試劑由三部分組成。①試劑與蛋白質反應的基團,這個基團特異結合肽鏈中半胱氨酸殘基的巰基;②中間的連接子,可以結合穩(wěn)定的同位素;③親和標簽-生物素(Biotin),可以和卵白素結合,選擇分離ICAT標記的多肽。試劑分為兩種形式,分別稱之為“重”(連接子含有8個氘原子)和“輕”(連接子含有8個氫原子);由8個氘原子與8個氫原子分別標記的ICAT質量正好相差8Da。第20頁,共47頁，星期六，2024年，5月

ICAT技術的具體操作流程是:①兩種來源密切相關而不同狀態(tài)的細胞裂解,蛋白質被還原;②兩種樣品中各加入不同的ICAT試劑標記;③標記完全后的兩種樣品混合,胰酶水解成大小不同的肽段;④固相陽離子柱交換,除去所有殘留的胰酶、去垢劑、還原劑和ICAT試劑;第21頁,共47頁，星期六，2024年，5月⑤標記與未標記的肽段經卵白素親和層析分離;⑥標記的肽段洗脫后經液相色譜(liquidchromatography,LC)再次分離,串聯質譜(tandemmassspectrometry,MS/MS)分析,通過比較峰型完全一樣的一對肽段峰的離子強度,可以推斷出兩種樣品中同一種蛋白的相對含量,再將質譜檢測數據提交數據庫檢索,鑒定相對應的蛋白質。第22頁,共47頁，星期六，2024年，5月Han等通過乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)誘導人類骨髓白血病細胞(HL-60)的細胞表面蛋白的分化,使用ICAT試劑標記分化的蛋白,鑒定了未誘導的和誘導的HL-60細胞的491種蛋白的豐度比。Hardwidge等通過ICAT結合電噴霧離子化串聯MS方法首次大規(guī)模地分析人類細胞對病原體腸致病性大腸桿菌(EPEC)的反應,他們在Caco-2單細胞層中分離并鑒定了超過2000種單一蛋白,其中13%與EPEC引起的腹瀉相關。第23頁,共47頁，星期六，2024年，5月與雙向電泳技術相比,ICAT技術有如下優(yōu)點:①因為分離在肽段水平上進行,可以對膜蛋白進行鑒定和定量;②通過選擇標記含半胱氨酸肽段,降低了蛋白質混合物的復雜性③比較兩種或更多種來源密切相關的蛋白質樣品,可以得到不同狀態(tài)下蛋白表達量的變化比例。④對于含有多個半胱氨酸殘基的蛋白質,通過重復檢索含多半胱氨酸的肽段可得到肯定的鑒定和定量;⑤因為ICAT技術建立在色譜分離的基礎上,任何促進蛋白質溶解的試劑均可使用;⑥能夠直接鑒定和測量低豐度蛋白質。第24頁,共47頁，星期六，2024年，5月其最大的缺點是蛋白質序列中必須含有半胱氨酸，那些在功能上有重要作用但不含半胱氨酸的蛋白質將會被遺失。第25頁,共47頁，星期六，2024年，5月4、同位素標記相對和絕對定量技術由美國應用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)開發(fā)的同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術是一種新的、功能強大的可同時對四種或八種樣品進行相對或絕對定量研究的方法。第26頁,共47頁，星期六，2024年，5月iTRAQ試劑由三個部分組成：第一部分為肽段反應基團，由于它活躍的化學性質，在弱堿性條件下可以迅速和伯胺基團反應，也就是和肽段的氨基端以及賴氨酸的ε氨基發(fā)生共價化學反應，從而使得每個肽段都帶上標記。第二部分為報告基團，它是由一系列C、N、O的穩(wěn)定同位素組合而成的分子量相隔1Da的小分子，在iTRAQ4-plex中，包含114、115、116、117Da四種報告基團；在iTRAQ8-plex中，包括從113至121Da八種不同分子量的報告基團，由于苯丙氨酸的immoniumion分子量為120Da，所以分子量為120Da的報告離子沒有被采用。第27頁,共47頁，星期六，2024年，5月ReportergroupMass:114to117PeptideReactiveGroupIsobaricTag:TotalMass=145BalancegroupMass:31to28PRG第28頁,共47頁，星期六，2024年，5月第三部分為平衡中性基團，平衡基團主要消除報告基團所引入的質量差異，因此不同標記試劑的平衡基團分子量也相對應發(fā)生變化，使得平衡基團和報告基團的質量之和最終為一個定值，這樣在質譜檢測的一級譜圖上就觀察不到質量偏差.第29頁,共47頁，星期六，2024年，5月由于iTRAQ試劑是由一系列C、N、O的穩(wěn)定同位素組合而成，其基本分子結構沒有發(fā)生變化，不同標記試劑標記的相同肽段在物理化學特性上沒有差異，因而其色譜保留時間和質譜離子化效率也基本一致，從而保證經不同標記試劑標記后的相同肽段能同時進行質譜分析。iTRAQ試劑標記好的多肽在進行一級質譜分析時不發(fā)生斷裂，在二級質譜檢測前進行碰撞誘導解離，此時iTRAQ試劑的報告基團和平衡基團發(fā)生斷裂，產生的報告基團用于后續(xù)的定量分析，平衡基團由于中性丟失無法被檢測，反應基團則仍偶聯在肽段的N端。第30頁,共47頁，星期六，2024年，5月等量不同來源的蛋白樣品（一般每個樣品100ug）經過還原烷基化、胰酶消化成肽段后，分別用帶有不同大小報告基團的iTRAQ試劑進行標記。待標記反應完全之后，將不同報告基團標記的肽段等量混合，利用多維液相色譜對混合肽段進行分離，最終進入質譜進行定性和定量分析。由于標記的肽段的理化性質基本一致，因此不同樣品來源的同一肽段將被同時洗脫和離子化。實驗流程第31頁,共47頁，星期六，2024年，5月在進行一級質譜檢測時，不同報告基團標記的同一肽段的分子量一致，在譜圖中疊加成一個峰，從而便于質譜儀進行母離子選擇。在進入二級質譜檢測時，母離子碎裂成一系列的碎片離子及報告離子，碎片離子則可以用于肽段的序列鑒定，產生的報告離子則可用于蛋白的定量分析，通過比較不同分子量大小的報告離子質譜峰強度來對不同樣品來源的肽段進行定量比較。第32頁,共47頁，星期六，2024年，5月第33頁,共47頁，星期六，2024年，5月第34頁,共47頁，星期六，2024年，5月第35頁,共47頁，星期六，2024年，5月第36頁,共47頁，星期六，2024年，5月蘋果酸脫氫酶第37頁,共47頁，星期六，2024年，5月四分體：C1S1單核期：C2S2

二核期：C3S3

7.21華大差異蛋白結果.xls可育不育第38頁,共47頁，星期六，2024年，5月在本實驗室做的關于BNS不育系與轉換系的花藥差異蛋白的研究中，用2-DE做出來的結果是：在單核靠邊期-二核期，分離出來的差異蛋白為14個；而用iTRAQ做出來的結果為：單核期的差異蛋白為85個，二核期的差異蛋白為84個。而且，iTRAQ可以比較四分體-二核生長過程中的蛋白質的變化。2-DE與iTRAQ結果的比較第39頁,共47頁，星期六，2024年，5月1、通量高，能夠同時對多達8組的樣品進行定量比較，大大降低了實驗過程中所引入的技術誤差。2、覆蓋率高，iTRAQ試劑與肽段的氨基端或多肽賴氨酸殘基上的氨基基團發(fā)生共價反應，幾乎所有的肽段都能被標記用于定量分析，使得定量的結果更為準確。3、標記效率高，體外進行，反應迅速，98%肽段在30分鐘內都能被標記。優(yōu)點第40頁,共47頁，星期六，2024年，5月4、定量技術準確度高，iTRAQ是基于質譜二級譜圖進行蛋白質同時進行定性和定量分析，產生的報告離子位于質譜的低分子量區(qū)域，低分子量區(qū)域是質譜定性和定量較為準確的區(qū)域，從而使得定量結果更為準確。5、離子化效率高，iTRAQ試劑能夠增強肽段的離子化效率，不同樣品來源的母離子在一級質譜檢測時分子量一致，一級信號的疊加使得二級的譜圖質量更高。第41頁,共47頁，星期六，2024年，5月應用1、疾病標志物探尋，通過iTRAQ策略對多對正常組和疾病組的蛋白進行定性和定量分析，找出與疾病相關的差異蛋白用于標志物的篩選和機制研究。2、信號通路的研究，鑒于該技術的高通量，可以對特定信號通路不同時間點的蛋白表達水平進行定量比較，構建信號調控網絡。3、蛋白復合物成分定性和定量的分析，該技術可用于免疫共沉淀或其它方法所分離的蛋白復合體進行定性和定量的比較，比較不同樣品中的復合物成分變化。第42頁,共47頁，星期六，2024年，5月4、蛋白翻譯后修飾的定量分析，iTRAQ試劑標記的是多肽的N端