巴氏染色原理及操作步驟

PAGEPAGE5巴氏染色原理及操作步驟巴氏染色法是脫落細(xì)胞染色中最好的染色方法。蘇木素染液，細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木素精堿性染料以離子或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。分化：蘇木素染色之后，用水洗去未結(jié)合在細(xì)胞上的染液，但是在細(xì)胞核中結(jié)合過多的染料和細(xì)胞漿中吸附的染料必須用分化液1%鹽酸酒精脫去，才能保證細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色的分明，把這個(gè)過程稱為染色的分化作用。因酸能破壞蘇木素的醌型結(jié)構(gòu)，使色素與組織解離，分化不可過度。藍(lán)化：分化之后蘇木素在酸性條件下處于紅色離子狀態(tài)，在堿性條件下處于藍(lán)色離子狀態(tài)，而呈藍(lán)色，所以分化之后用水洗去酸而中止分化，再用弱堿性水使蘇木精染上的細(xì)胞核變呈藍(lán)色，稱藍(lán)化作用，一般多用自來水浸洗即可變藍(lán)，也可用溫水（50度溫水最佳）變藍(lán)。EA50染液的酸堿度對于巴氏染色的成功起著關(guān)鍵作用，EA50染液由伊紅、亮綠、等染料配成。伊紅、亮綠、橘黃等屬于酸性染料，在溶解媒中其發(fā)色團(tuán)是負(fù)離子部分，發(fā)色團(tuán)可與蛋白質(zhì)中帶正電的氨基結(jié)合，從而是胞漿顯藍(lán)色、綠色、橘黃色或紅色，但蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷的多少是隨溶液的PH值而改變的，在偏堿環(huán)境中，蛋白質(zhì)的羧基游離增多（帶負(fù)電），在偏酸環(huán)境中蛋白質(zhì)氨基游離增多（帶正電），磷鎢酸在染色過程中，不但作為媒染劑可增加染料的著色力，同時(shí)磷鎢酸與碳酸鋰還是一對弱酸弱堿，實(shí)際上是一對緩沖劑，可中和分化及藍(lán)化時(shí)可能留下的少量酸或堿，保證染色達(dá)到理想效果，其適用于上皮細(xì)胞及間皮組織的標(biāo)本，是陰道脫落細(xì)胞檢查中最常用的染色方法，該染色法不但具有顯示細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰、分色明顯、透明度好、胞漿受色鮮艷等特點(diǎn)。巴氏染色法將胞核染為深藍(lán)色；鱗狀上皮底層、中層及表層角化前細(xì)胞胞質(zhì)染綠色，表層不全角化細(xì)胞胞質(zhì)染粉紅色，完全角化細(xì)胞胞質(zhì)呈桔黃色；細(xì)菌：灰色；滴蟲：淡藍(lán)灰色；黏液：淡藍(lán)色或粉紅色；中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞胞質(zhì)均為藍(lán)色；紅細(xì)胞染粉紅色；高分化鱗癌細(xì)胞可染成粉紅色或桔黃色；腺癌胞質(zhì)呈灰藍(lán)色。巴氏染色的操作方法及注意事項(xiàng)染色有4個(gè)步驟：1、固定；2、核染色；3、胞漿染色；4、透明。主要達(dá)到以下要求：1、核的結(jié)構(gòu)清晰；2、透明度高；3、分色恰當(dāng)。一、固定固定的目的細(xì)胞制片的迅速固定是制片過程中關(guān)鍵的一步，否則會(huì)影響細(xì)胞學(xué)診斷的準(zhǔn)確性。對于不同的標(biāo)本需要不同的固定方法。最為常用的固定方法是95％酒精作為固定液的濕固定法。酒精作為一種脫水劑能夠防止細(xì)胞內(nèi)的酶捋蛋白質(zhì)分解而自容，并凝固細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等，使其保持與組織生活相仿的成分，從而使細(xì)胞各部分，尤其核染色質(zhì)易于著色。對于巴氏染色來說，酒精固定最為重要的。如果酒精濃度不足引起的固定不佳，可造成細(xì)胞的人為變化，并可導(dǎo)致假陽性或假陰性的診斷。1、固定方法濕固定法：作為用95％酒精固定液固定的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本一定使用濕固定法。制片制備完后，趁標(biāo)本新鮮而又濕潤時(shí)，立即放入盛有95％酒精的固定缸內(nèi)。制片在固定液內(nèi)至少保持15-30min。固定時(shí)間通常不超過1周。這種制片染色后，顏色鮮艷，結(jié)構(gòu)清晰。如果細(xì)胞制片需要送至另一實(shí)驗(yàn)室或郵寄他處染色時(shí)，可以固定15min后，把制片取出后立即密封的容器中或者使用甘油防止制片干燥。因?yàn)闊o論固定前或固定后的制片，如果發(fā)生干燥后都會(huì)影響染色的效果。2、固定注意事項(xiàng)固定液的過濾：為了防止細(xì)胞污染，凡是使用過的固定液，必須過濾后才能再使用。使用過長的固定液，必須用酒精相對密度計(jì)測定，酒精濃度低于90％時(shí)應(yīng)該及時(shí)更換新液。濕固定的重要性：標(biāo)本再新鮮時(shí)及時(shí)固定時(shí)保證染色效果的重要因素。如蘇木素對細(xì)胞核的染色，巴氏染色中胞漿的特殊著色作用，均可因標(biāo)本干燥后固定而大受