細(xì)胞模型篩選抗SARS病毒藥物試驗(yàn)技術(shù)要求

細(xì)胞模型篩選抗SARS病毒藥物試驗(yàn)技術(shù)要求新近發(fā)現(xiàn)的非典型肺炎的病原SARS病毒，目前尚沒有理想的動(dòng)物模型可用于對(duì)抗SARS病毒藥物的篩選。為此用細(xì)胞模型篩選研究抗SARS病毒的藥物，對(duì)評(píng)價(jià)藥物抗病毒活性或效果具有重要提示價(jià)值。為規(guī)范細(xì)胞模型抗SARS病毒藥物的篩選研究，制定本技術(shù)要求。本技術(shù)要求適用于化藥、中藥、生物制品等擬用于SARS治療或預(yù)防藥物（不包括預(yù)防用疫苗），并將根據(jù)SARS病毒學(xué)研究的進(jìn)展適時(shí)修訂。一、試驗(yàn)材料要求

（一）病毒

1．毒株：應(yīng)采用SARS流行期臨床分離且經(jīng)相關(guān)部門確證的SARS病毒毒株（建議選用2-3株）。

2．毒種庫(kù)：試驗(yàn)前將病毒先在敏感細(xì)胞上傳數(shù)代，增加毒力，待毒力穩(wěn)定后，收獲病毒分裝一定數(shù)量的小管，在-80℃低溫冰箱或液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

3．檢定：毒種庫(kù)毒種須經(jīng)外源因子檢測(cè)合格后方可用于篩選試驗(yàn)，每次試驗(yàn)取一支，不得回凍再用于篩選。（二）細(xì)胞

1．細(xì)胞株：選用對(duì)SARS病毒敏感的傳代細(xì)胞株，如VeroE6、2BS細(xì)胞等。

2．細(xì)胞庫(kù)：收集大量培養(yǎng)的細(xì)胞分管液氮凍存以保留足夠的

傳代細(xì)胞。試驗(yàn)前先復(fù)蘇細(xì)胞傳數(shù)代，使培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛穩(wěn)定后，

開始接種細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行試驗(yàn)。

3．檢定：細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞須經(jīng)外源因子檢測(cè)合格后方可用于篩選試驗(yàn)，每次試驗(yàn)取一支，不得回凍再用于篩選。（三）待測(cè)藥物

試驗(yàn)前編號(hào)登記、標(biāo)明藥名、來(lái)源、批號(hào)、重量或體積、溶媒、溶解度、穩(wěn)定性和保存條件等。（四）其他

本試驗(yàn)研究必須在生物安全3級(jí)試驗(yàn)室進(jìn)行，毒種的管理使用必須符合國(guó)家的有關(guān)規(guī)定。二、篩選試驗(yàn)

（一）預(yù)備試驗(yàn)

1．病毒毒力測(cè)定

選擇敏感細(xì)胞用于病毒培養(yǎng)，加入10倍系列稀釋的5-7個(gè)濃度的病毒培養(yǎng)液。適宜條件下培養(yǎng)后每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變（CPE）或用MTT染色法觀察細(xì)胞存活狀態(tài)，用Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)感染劑量（TCID50），每濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定毒力。

2．藥物對(duì)細(xì)胞毒性的測(cè)定

以細(xì)胞病變或MTT染色法為觀察指標(biāo)，前法可觀察3-5天，每個(gè)藥物至少設(shè)4個(gè)濃度進(jìn)行測(cè)定，用Reed-Muench法求出對(duì)細(xì)胞無(wú)毒的最大濃度（TD0）和半數(shù)中毒濃度（TD50）。每濃度藥液至少3管，重復(fù)試驗(yàn)3次。（二）篩選試驗(yàn)

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)求出病毒的TCID50和藥物的TD0后，在SARS病毒的敏感細(xì)胞模型上進(jìn)行抗病毒活性篩選，適宜的培養(yǎng)液及培養(yǎng)條件培養(yǎng)。96孔板，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，每孔加100μl（100TCID50左右）病毒感染，吸附2小時(shí)后，傾出病毒。然后加入待測(cè)藥物，只做一個(gè)最大無(wú)毒濃度（TD0），4個(gè)孔。試驗(yàn)設(shè)病毒對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照及陽(yáng)性藥物對(duì)照。以病毒對(duì)照孔出現(xiàn)病變達(dá)75%以上（即4+時(shí)），可終止試驗(yàn)。

倒置顯微鏡觀察對(duì)細(xì)胞的致病變作用（CPE），將給藥孔與病毒對(duì)照孔進(jìn)行比較，如最大無(wú)毒濃度藥物無(wú)抑制病毒CPE作用則不繼續(xù)做，如有抑制作用須進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。（三）補(bǔ)充試驗(yàn)

最大無(wú)毒濃度（TD0）的藥物如有抗病毒作用，應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)充篩選試驗(yàn)。模型和培養(yǎng)條件同上。

試驗(yàn)設(shè)藥物試驗(yàn)組、病毒對(duì)照組及細(xì)胞對(duì)照組。每孔加入100TCID50左右病毒感染，吸附2小時(shí)，傾出病毒。選用最大無(wú)毒濃度（TD0）藥液，2倍或者10倍系列稀釋的5-7個(gè)濃度，每濃度4孔，每孔100μl，分別加入未感染或感染的細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，每天用倒置顯微鏡觀察，記錄細(xì)胞病變程度。當(dāng)病毒對(duì)照病孔病變達(dá)4+時(shí)可終止試驗(yàn)，判定藥物的效果。試驗(yàn)須重復(fù)3次。

用CPE法，對(duì)各組進(jìn)行比較。

用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)有效濃度（IC50）及治療指數(shù)（TI）。

TI=半數(shù)中毒濃度（TD50）/半數(shù)有效濃度（IC50）

以上初篩及進(jìn)一步藥效評(píng)價(jià)方法一般是針對(duì)治療性給藥（病毒感染細(xì)胞后給藥）的藥物；若為預(yù)防性藥物，則建議相應(yīng)調(diào)整給藥與感染的順序（病毒感染前給藥，病毒感染時(shí)及感染后均應(yīng)洗去藥物），以考察其預(yù)防效果。三、結(jié)果評(píng)價(jià)

鑒于目前SARS疾病的理想動(dòng)物模型尚未建立，且體內(nèi)外藥效學(xué)結(jié)果的相關(guān)性尚不明確，體外藥效學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果僅是評(píng)價(jià)藥物療效重要參考指標(biāo)。在這種情況下,盡量提供更多的反映藥