蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測定

關(guān)于蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測定

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測定。

第2頁,共31頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定是一項(xiàng)非常復(fù)雜的工作第3頁,共31頁，星期六，2024年，5月A.樣品必需純（>97%以上）；B.知道蛋白質(zhì)的分子量；C.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；D.測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。E.測定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。（1）測定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求第4頁,共31頁，星期六，2024年，5月（2）蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)測定方法氨基酸組成分析氨基酸末端分析蛋白質(zhì)中肽鏈的拆離肽鏈的部分降解及肽片斷的分離肽段氨基酸順序測定及肽段重疊二硫鍵與酰胺基的定位

第5頁,共31頁，星期六，2024年，5月①測定蛋白質(zhì)氨基酸殘基組成根據(jù)蛋白質(zhì)分子量，計(jì)算出構(gòu)成蛋白質(zhì)的各種氨基酸的數(shù)量；采用經(jīng)典的陽離子交換色譜分離、茚三酮柱后衍生法，對蛋白質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分含量進(jìn)行分析。第6頁,共31頁，星期六，2024年，5月②測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目

通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

第7頁,共31頁，星期六，2024年，5月由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分單獨(dú)分離出來；幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的

-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基；用過氧酸氧化或巰基化合物還原二硫鍵斷裂，用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，防止其重新被氧化；

如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)。

③二硫健的斷裂及多肽鏈的拆分第8頁,共31頁，星期六，2024年，5月★巰基的保護(hù)用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化第9頁,共31頁，星期六，2024年，5月用酶溴化氫選擇性降解多肽鏈產(chǎn)生的肽段用酸水解、堿水解（針對色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自動(dòng)分析儀測定；測定并計(jì)算出蛋白質(zhì)的氨基酸種類和數(shù)量；用Edman反應(yīng)分析各肽段氨基酸順序；④多肽鏈的選擇性降解及肽段的氨基酸組成和順序的測定第10頁,共31頁，星期六，2024年，5月獲得的各肽段的氨基酸順序彼此間的交替重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序；

確定多肽鏈中二硫鍵的位置。⑤利用酶選擇性降解和溴化氰選擇性降解第11頁,共31頁，星期六，2024年，5月2、多肽鏈氨基酸順序分析多肽鏈降解必須滿足兩個(gè)條件：選擇性強(qiáng)、反應(yīng)產(chǎn)率高主要方法包括酶解法和化學(xué)法第12頁,共31頁，星期六，2024年，5月某些蛋白水解酶能夠選擇性的水解多肽鏈中的某一類肽鍵；主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸；胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、以及其他疏水性強(qiáng)酶解法第13頁,共31頁，星期六，2024年，5月特點(diǎn)：專一性較強(qiáng)，水解速度快斷裂位點(diǎn)：賴氨酸或精氨酸殘基的羧基參與形成的肽鍵R1=Lys（賴、K）和Arg（精、R）R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點(diǎn)胰蛋白酶（trypsin）第14頁,共31頁，星期六，2024年，5月特點(diǎn)：專一性稍弱，Leu、Met和His稍慢斷裂位點(diǎn)：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AAR2=Pro（抑制）肽鏈水解位點(diǎn)糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質(zhì)有關(guān):酸性：-/堿性：+第15頁,共31頁，星期六，2024年，5月特點(diǎn)專一性與糜蛋白酶相似，較弱；斷裂位點(diǎn)：兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快R1=Pro（抑制）pH2.0肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶Pepsin第16頁,共31頁，星期六，2024年，5月特點(diǎn)：專一性較差斷裂位點(diǎn)：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏水性強(qiáng)氨基酸殘基的羧基端肽鍵R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強(qiáng)的AA水解速度較快嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)第17頁,共31頁，星期六，2024年，5月木瓜蛋白酶：

專一性差斷裂位點(diǎn)：對Arg和Lys殘基的羧基端肽鍵敏感葡萄球菌蛋白酶：

高專一性斷裂位點(diǎn)：Glu和Asp殘基的羧基端肽鍵

——磷酸緩沖液

Glu殘基的羧基端肽鍵

——碳酸氫銨、醋酸銨緩沖液）梭菌蛋白酶：

高專一性斷裂位點(diǎn)：Arg殘基的羧基端肽鍵第18頁,共31頁，星期六，2024年，5月溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵?；瘜W(xué)法第19頁,共31頁，星期六，2024年，5月---選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵溴化氰水解法(Cyanogenbromide)第20頁,共31頁，星期六，2024年，5月N末端的測定二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL法）；異硫氰酸苯脂法（PITC法）；C末端的測定羧肽酶法；硼氫化鋰法；肼解法（2）多肽鏈的末端氨基酸測定第21頁,共31頁，星期六，2024年，5月N末端測定方法比較C末端更加成熟、可靠和準(zhǔn)確，主要的方法有：二硝基氟苯法（DNFB法）

肽鏈N末端氨基與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)，生成二硝基苯的衍生物（DNP-肽），其經(jīng)酸水解后生成的DNP-氨基酸可用有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯）抽提，再與其他氨基酸分開，鑒定得知N末端的氨基酸。N末端的測定第22頁,共31頁，星期六，2024年，5月二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法。第23頁,共31頁，星期六，2024年，5月熒光劑二甲氨基萘磺酰氯（dansyl-chloride,DNS-Cl）可以作為標(biāo)記試劑專一地與肽鏈N末端氨基反應(yīng)生成DNS-肽；同樣，酸水解后可得DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用層析法鑒定；DNS-氨基酸于360nm或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，根據(jù)熒光點(diǎn)的位置，確定N末端的氨基酸。此方法反應(yīng)原理同DNFB法，但其靈敏度比DNFB法高約100倍，用于層析分析的樣品只需1nmol。二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）

第24頁,共31頁，星期六，2024年，5月二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有強(qiáng)烈的黃色熒光,靈敏性是DNFB法的100倍.第25頁,共31頁，星期六，2024年，5月基本原理：偶聯(lián)--環(huán)化--轉(zhuǎn)化異硫氰酸苯酯能與N末端氨基偶聯(lián)生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-肽）異硫氰酸苯酯法（PITC法）第26頁,共31頁，星期六，2024年，5月

在酸性溶液中，PTC-肽經(jīng)環(huán)化裂解生成PTC-氨基酸和N末端少一個(gè)氨基酸的剩余多肽，前者可用于N末端氨基酸鑒定，但是該產(chǎn)物不穩(wěn)定，很快進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成3-苯基-2-乙內(nèi)酰硫脲-氨基酸（PTH-氨基酸）。第27頁,共31頁，星期六，2024年，5月

生成的PTH-氨基酸非常穩(wěn)定，它在268nm處有強(qiáng)吸收峰。剩余多肽鏈的N末端仍是自由的，可以進(jìn)一步與異硫氰酸苯酯反應(yīng)進(jìn)行第二步降解。這樣就可以從N末端開始逐次降解下去，進(jìn)行順序測定。該方法也稱Edman順序降解，它是制造氨基酸順序分析儀的理論基礎(chǔ)。第28頁,共31頁，星期六，2024年，5月一般說來，C末端測定較N末端分析的誤差大?？刹捎玫姆椒ㄓ校?．羧肽酶法：羧肽酶能特異地水解C末端氨基酸形成的肽鏈，而用于測定C末端氨基酸。羧肽酶分A、B、C、Y4種，羧肽酶A使用最多，但對C末端的Pro、Arg、Lys及Hyp不起作用。羧肽酶B，只釋放C末端的Lys和Arg，可以和羧肽酶A互補(bǔ)使用。羧肽酶C的作用范圍寬。但對C末端的Hyp或連續(xù)幾個(gè)甘氨酸（-Gly-Gly-Gly）無作用。羧肽酶Y也具很寬的作用范圍。2．硼氫化鋰法（LiBH4法，也稱“還原法”）：硼氫化鋰可以與C末端氨基反應(yīng)生成相應(yīng)的α-氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用層析法分離、鑒定。3．肼解法（hydrazinoly