SN∕T 4821-2017 牛脊椎畸形綜合征TaqMan探針PCR檢測方法

牛脊椎畸形綜合征TaqMan探針PCRI1TaqMan探針TaqMan探針(TaqManprobes)2漩渦混勻器。冰箱(2℃~8℃、-20℃、-80℃)。5.2試劑與耗材5.2.1試劑級別：除另有規(guī)定，本方法試驗用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的二級水，所用化學(xué)試劑均為分5.2.2DEPC水：按照附錄B制備，推薦使用商品化DEPC處理的無DNA酶和RNA酶的水。5.2.3飽和酚和異丙醇：分析純，使用前預(yù)冷至-20℃。5.2.6熒光PCR試劑盒。5.2.710%SDS:配制方法見附錄B。6引物與探針序列上游引物(CVM-F)5’-AGCTGGCTCACAATTTGT下游引物(CVM-R)5’-CTCAAA擴(kuò)增序列參見附錄CPROBE1:5’VIC:TCATGGCAGTICTPROBE2:5’FAM:TCATGGCATTTCTCABHQ-3’采用DEPC水將每條引物和探針配制成100phol/L儲存液，置-20℃或更低溫度凍存；使用時取適量配制成10μmol/L工作液，避免多次凍融。8.1將血液樣品200μL,加入2mL塑料離心管中，加20μL蛋白酶K,8.2混合液置于55℃水浴2.5h。8.3向勻漿液中按1:1比例加酚/三氯甲烷/異戊醇混合液(25:24:1),輕輕震蕩5min后12000r/min離心5min。8.4吸上層水相400μL于一滅菌塑料離心管中，再次加入等體積酚/三氯甲烷/異戊醇混合液，輕輕震蕩混勻5min,12000r/min離心5min。8.5吸上層水相500μL于一塑料離心管中，加入兩倍體積的無水乙醇，-20℃放置2h;12000r/min離心5min,傾去上清液。8.6向DNA沉淀中加入75%乙醇溶液500pL,輕輕混勻后12000r/min離心5min,傾去上清液，室8.7向DNA沉淀中加70μLTE緩沖液，溶解沉淀-20℃保存?zhèn)溆谩?9.1設(shè)立對照以CVM的野生型(G/G型)的DNA作野生型對照；以雜合型(G/T型)的DNA作雜合型對照；以突變型(T/T型)的DNA為純合型對照；以滅菌雙蒸水作陰性對照。反應(yīng)體系：體積為25μL,包括實時熒光PCR反應(yīng)混合液12.5pL(DNA聚合酶1U～2U,熒光PCR緩沖液，Mg?SO?2.5mmol/L~4.0mmol/L,dNTP0.25mmol/L,ROX染引物各1pL,一對探針各1pL,DNA模板2μL,加雙蒸水補(bǔ)至25pL。9.3熒光PCR反應(yīng)熒光素設(shè)定：ReportDye設(shè)置為FAM和VIC,QuenchDye都設(shè)定為BHQ,ReferenceDye設(shè)定為None。第一階段，預(yù)變性94℃3min;第二階段，擴(kuò)增94℃30s,60℃30s,72℃30s,40個循環(huán)。熒光收集設(shè)置在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時進(jìn)行，試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。9.4結(jié)果判定9.4.1質(zhì)控對照判定選擇FAM和VIC通道進(jìn)行結(jié)果分析野生型(G/G型)對照樣品：出現(xiàn)一條擴(kuò)增曲線，為FAM的典型擴(kuò)增曲線；Ct值小于30。雜合型(G/T型)對照樣品：出現(xiàn)兩條典型擴(kuò)增曲線，為FAM和VIC的擴(kuò)增曲線。Ct值小于30。空白對照：應(yīng)無曲線出現(xiàn)，Ct值顯示為None。(參見附錄D,牛脊椎畸形綜合征的TaqMan探針PCR檢測參考圖譜)。質(zhì)控對照不出現(xiàn)上述結(jié)果視為本次實驗無效。在質(zhì)控有效的條件下進(jìn)行結(jié)果判定。檢測樣品出現(xiàn)一條FAM探針擴(kuò)增曲線，且Ct值≤30,則樣品判定為CVM野生型(G/G型)陽性檢測樣品出現(xiàn)一條VIC探針擴(kuò)增曲線，且Ct值≤30,則樣品判定為CVM突變型(T/T型)陽性。若待檢樣品出現(xiàn)特征性擴(kuò)增出上述任一條曲線Ct值介于30和35之間時，應(yīng)重新進(jìn)行實時熒光PCR檢測。若則重新檢測的Ct值仍介于30和35之間，則可以根據(jù)擴(kuò)增出的曲線對照質(zhì)控參考圖譜判斷陽性類型。若重新檢測的結(jié)果中Ct值≥35時，無法判斷實驗結(jié)果?？梢赃x擇其他檢測方法，或重新采集該牛的血液樣品進(jìn)行檢測。4牛脊椎畸形綜合征(ComplexVertebralMa5至1L。6AGCTGGCTCACAATTTGTAGGTCTCATGGCAG/TTTCTC