(高清版)GB∕T 38496-2020 消毒劑安全性毒理學(xué)評價程序和方法

C50中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)消毒劑安全性毒理學(xué)評價程序和方法Txv2020-03-06發(fā)布2020-10-01實施國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會ⅠGB／T38496—2020前言 2術(shù)語和定義 3消毒劑安全性毒理學(xué)評價程序 4消毒劑毒理試驗項目確定原則 5毒理試驗用受試物的要求 6消毒劑安全性評價的毒理試驗方法 6.1急性經(jīng)口毒性試驗 6.2急性吸入毒性試驗 6.3皮膚刺激試驗 6.4急性眼刺激試驗 6.5陰道黏膜刺激試驗 6.6皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗 6.7亞急性經(jīng)口毒性試驗 6.8致突變試驗 6.9亞慢性毒性試驗 6.10致畸胎試驗 6.11慢性毒性試驗 7對消毒劑的安全性評價 ⅢGB／T38496—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所、湖北省疾病預(yù)防控制中心、上海市疾病預(yù)防控制中心。1GB／T38496—2020消毒劑安全性毒理學(xué)評價程序和方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了消毒劑安全性毒理學(xué)評價的程序、確定毒理試驗項目的原則、對毒理試驗用受試物（受檢消毒劑樣品）的要求、毒理試驗方法和對毒理試驗結(jié)果的安全性評價。本標(biāo)準(zhǔn)適用于在我國生產(chǎn)或國外生產(chǎn)在我國銷售和使用的消毒劑以及器械或裝置產(chǎn)生的消毒劑的毒理學(xué)安全性評價。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。2.1新消毒劑利用新材料、新工藝技術(shù)和新殺菌原理生產(chǎn)的消毒劑。3消毒劑安全性毒理學(xué)評價程序消毒劑安全性毒理學(xué)評價程序采用分階段系統(tǒng)法，逐階段進行毒理試驗，毒理試驗依次分為四個階段，如果前一階段毒理試驗結(jié)果不符合安全性要求，應(yīng)增做其后階段相應(yīng)的毒理試驗。3.2消毒劑安全性評價毒理試驗a)急性經(jīng)口毒性試驗。b)急性吸入毒性試驗。1)一次完整皮膚刺激試驗；2)一次破損皮膚刺激試驗；3)多次完整皮膚刺激試驗。d)急性眼刺激試驗。f)皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗。a)亞急性毒性試驗。1)體外哺乳動物L(fēng)5178Y細胞基因突變試驗（體細胞基因水平，體外試驗2)體外哺乳動物V79細胞基因突變試驗（體細胞基因水平，體外試驗3)體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗（體細胞染色體水平，體外試驗4)小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗（體細胞染色體水平，體內(nèi)試驗2GB／T38496—20205)哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗（體細胞染色體水平，體內(nèi)試驗6)程序外DNA修復(fù)合成試驗(DNA水平，體外試驗7)小鼠精原細胞染色體畸變試驗（性細胞染色體水平，體內(nèi)試驗）。a)亞慢性毒性試驗；4消毒劑毒理試驗項目確定原則確定毒理試驗項目，取決于消毒劑的特點、使用范圍和安全性評價前一階段毒理試驗的結(jié)果。4.2消毒劑必做的毒理試驗項目消毒劑均應(yīng)進行以下試驗項目：a)急性經(jīng)口毒性試驗；項致突變試驗。4.3消毒劑增做的毒理試驗項目根據(jù)消毒劑使用范圍，除4.2必做的2項毒理試驗外，分別增做以下試驗：a)使用于室內(nèi)空氣的消毒劑，增做急性吸入毒性試驗和急性眼刺激試驗。1)偶爾使用或間隔數(shù)日使用的消毒劑，增做一次完整皮膚刺激試驗；2)手消毒劑增做多次完整皮膚刺激試驗；3)接觸破損皮膚（包括用于注射部位、手術(shù)切口部位消毒）的消毒劑，增做一次破損皮膚刺激試驗；4)接觸創(chuàng)面（包括用于外科換藥、燒傷皮膚消毒）的消毒劑，增做一次破損皮膚刺激試驗和急性眼刺激試驗。c)使用于黏膜的消毒劑，增做急性眼刺激試驗，使用陰道黏膜消毒的，增做陰道黏膜刺激試驗。d)使用于游泳池水的消毒劑，增做急性眼刺激試驗。e)在消毒過程中接觸手和（或）皮膚的消毒劑，增做一次完整皮膚刺激試驗。4.4新消毒劑增做的毒理試驗項目4.4.1在我國首次生產(chǎn)和（或）銷售含有新的殺菌主要成分的新消毒劑，應(yīng)做的毒理試驗：a)急性經(jīng)口毒性試驗（包括小鼠和大鼠b)亞急性經(jīng)口毒性試驗；c)3項致突變試驗（包括反映體細胞基因水平、體細胞染色體水平和性細胞染色體水平三種類型試驗d)亞慢性經(jīng)口毒性試驗；4.4.2根據(jù)消毒劑的成分，可能有致敏作用的，增做皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗。3GB／T38496—20205毒理試驗用受試物的要求5.1受試物應(yīng)是按照消毒劑生產(chǎn)者既定的生產(chǎn)工藝和配方進行規(guī)范化生產(chǎn)的消毒劑，其成分和濃度應(yīng)與實際生產(chǎn)和銷售的相同。5.2生產(chǎn)者應(yīng)提供受試物的物理、化學(xué)性質(zhì)的資料（包括消毒劑的配方、殺菌有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和含5.3在急性經(jīng)口毒性試驗、急性吸入毒性試驗、亞急性毒性試驗、致突變試驗、亞慢性毒性試驗、致畸胎試驗、慢性毒性試驗和致癌試驗時，采用消毒劑原形樣品。消毒劑原形是指在銷售過程中原包裝的粉劑、片劑或原液。對于二元包裝的消毒劑，按產(chǎn)品使用說明比例混合配制后作為消毒劑原形樣品。5.4在皮膚刺激試驗、急性眼刺激試驗和陰道黏膜刺激試驗中所用樣品的濃度，應(yīng)是對皮膚、黏膜消毒時應(yīng)用濃度的5倍。對使用產(chǎn)品原液對皮膚、黏膜進行消毒的消毒劑，則采用消毒劑原液作為試驗樣本。5.5在皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗時，采用的誘導(dǎo)濃度應(yīng)為引起皮膚輕度刺激反應(yīng)的最高濃度或原液，激發(fā)濃度應(yīng)為不引起皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度或原液。6消毒劑安全性評價的毒理試驗方法6.1急性經(jīng)口毒性試驗6.1.1.1檢測消毒劑對實驗動物的急性毒性作用和強度。6.1.1.2為亞急（慢）性毒性試驗和致突變試驗提供劑量選擇的依據(jù)。大鼠體重180根據(jù)不同的急性毒性試驗設(shè)計方法，選用適當(dāng)?shù)膭游飻?shù)量，通常分為4個~6個劑量組。一般小鼠每組選用8只~10只動物，動物總數(shù)不少于50只；大鼠每組選用5只~6只動物，動物總數(shù)不少于30只。-對數(shù)圖解法：計算LD50,隨機分為5個~6個劑量組。通常最高劑量組的動物死亡率應(yīng)大于或等于最低劑量組動物死亡率應(yīng)小于或等于可先以較大的組距，對少量動物進行預(yù)試驗，找出其粗略致死劑量范圍，然后再設(shè)計正式試驗的劑量分組?；蛘甙凑盏姆椒ㄔO(shè)個個劑量組。6.1.4.2受試物的配制：用水或食用植物油為溶劑配制成溶液，或采用0.5%羧甲基纖維素配制成混懸液。體重，大鼠灌胃量不超過1.0體重。若受試物毒性很低，一次灌胃容量太大，可在24h內(nèi)分成2次~3次給予，其總劑量作為一日劑量計算。4GB／T38496—20206.1.4.4染毒后觀察動物的中毒表現(xiàn)和死亡數(shù)及死亡時間，并對死亡動物和觀察期滿處死動物進行尸體解剖，肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)有異常的組織或臟器，尚需進一步作組織病理學(xué)檢查。觀察時間14d。d內(nèi)的各劑量組動物死亡率計算LD50（半數(shù)致死-對數(shù)圖解法的概率單位，與所試動物數(shù)有關(guān)，故應(yīng)另在表2中查找。示例：某組死亡率為的概率單位，查表1。先在表的左側(cè)第一列上找到40,而后在表的第一行找到5,兩者交叉點處的4.87,即為的概率單位。某組用10只實驗動物，如果全部存活（死亡率為0%),查表2,其概率單位為3.04。表1百分率-概率單位換算表死亡率的十位數(shù)死亡率的個位數(shù)01234567890 表2相應(yīng)于反應(yīng)率為及的概率單位該組動物數(shù)反應(yīng)率該組動物數(shù)反應(yīng)率0%100%0%100%———234567895GB／T38496—2020用方格紙繪散點圖，橫軸表示劑量的對數(shù)值（x縱軸為概率單位值（y將各組數(shù)值點在圖上。6.1.5.1.3按各點的分布趨勢，用直尺繪出一條最適合于各點的直線，使線上方的點到線的總距離與線下方的點到線的總距離相近，此線應(yīng)盡量靠近概率單位為5的點及附近的點。按式式和式計算可信限：式中：S—LD50的標(biāo)準(zhǔn)差；時相應(yīng)的劑量對數(shù)值；時相應(yīng)的劑量對數(shù)值。式中：Sm—LD50的標(biāo)準(zhǔn)誤；相應(yīng)的死亡率間所用的動物數(shù)?？尚畔奘街校篖D50—半數(shù)致死劑量；Sm—LD50的標(biāo)準(zhǔn)誤?？尚畔?。動物，組距劑量遞增公比為，即以此類推。此劑量系列排列如下ttt表用于每組只動物組距劑量遞增公比為即tt=0、±1、±2、±3、…。每組只動物、組距倍可信限各劑量組動物死亡數(shù)劑量組劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t可信限可信限可信限00356.36~13.500455.84~10.86GB／T38496—2020各劑量組動物死亡數(shù)劑量組劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t2(3)組3(2)組可信限可信限可信限0055 012501354.89~12.901454.41~10.5015502254.67~13.502354.00~13.5024502550335034510355.66~14.610454.98~11.31055112511354.02~16.711453.42~11.2115512253.80~14.812353.05~12.512452.55~10.213352.43~10.820354.66~16.620453.74~12.4205521250.839~4.293.89~19.921352.86~16.221452.16~12.922252.66~17.47GB／T38496—2020各劑量組動物死亡數(shù)劑量組劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t2(3)組3(2)組可信限可信限可信限22351.89~14.800445.46~15.1005401344.54~18.201444.14~13.6015402244.31~19.102343.70~15.202443.32~11.5025403343.14~12.2034410444.50~17.2105411341.63~10.23.51~22.011443.03~15.311542.70~10.312243.28~23.612342.62~17.712442.11~13.213341.97~14.220441.43~10.33.07~22.220542.71~11.721340.980~15.002.11~32.321440.327~4.481.52~20.822240.883~16.622340.573~11.900535.22~14.801433.60~21.58GB／T38496—2020各劑量組動物死亡數(shù)劑量組劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t2(3)組3(2)組可信限可信限可信限01533.74~12.402333.15~24.602432.86~16.2025303332.66~17.403432.33~11.910533.98~17.111431.04~14.22.23~30.511532.09~15.112330.840~17.51.81~37.612430.310~4.740.668~10.21.44~22.013330.602~11.31.30~24.4每組只動物、組距倍可信限各劑量組動物死亡數(shù)劑量組劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t2(3)組3(2)組可信限可信限00355.007~15.700454.47~11.20055——01254.30~18.501353.42~14.701452.93~10.802253.19~15.702352.53~12.502459GB／T38496—2020各劑量組動物死亡數(shù)劑量組劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t2(3)組3(2)組可信限可信限02550335034510354.26~17.610453.51~12.0105511253.48~21.611352.55~16.511452.00~11.9115512252.34~18.012350.534~4.441.69~14.112451.29~10.31335203520452.29~13.8205521252.43~28.121351.53~20.721451.00~14.622250.434~7.2822350.819~17.900444.003~18.600501343.06~24.501442.67~15.8015402242.83~26.502342.25~18.7GB／T38496—2020各劑量組動物死亡數(shù)劑量組劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t2(3)組3(2)組可信限可信限02440254033403440.463~2.8810443.01~22.6105411340.658~10.42.08~32.711441.67~18.911541.40~10.512240.594~11.51.88~36.312340.423~7.4812440.305~4.800.966~15.213340.871~16.820440.539~10.420541.41~12.621340.307~18.30.970~58.021440.592~30.022240.262~21.40.830~67.822340.137~13.000.433~41.000533.77~18.101432.16~31.501532.29~13.802330.558~12.21.76~38.602431.53~20.7025303330.434~7.28034310532.51~22.411430.333~16.91.05~53.4GB／T38496—2020各劑量組動物死亡數(shù)劑量組劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t劑量t2(3)組3(2)組可信限可信限11530.958~18.612330.244~23.10.771~73.0012430.172~10.30.545~32.613330.148~12.10.467~38.1如20只動物（雌雄各半）一次灌胃劑量5000體重。也可采用其他方法如寇氏(法固定劑量法(及上下法(等。6.1.6急性經(jīng)口毒性試驗分級評價規(guī)定急性經(jīng)口毒性試驗分級評價規(guī)定見表5。表5急性經(jīng)口毒性試驗分級體重毒性分級LD50≥5000實際無毒500≤LD50<5000低毒50≤LD50<500中等毒1≤LD50<50高毒LD50<1劇毒6.2急性吸入毒性試驗檢測消毒劑對實驗動物的急性吸入毒性作用和強度。GB／T38496—2020染毒濃度的設(shè)計、動物分組、觀察期限、觀察指標(biāo)等可按6.1的要求進行。急性吸入毒性試驗可采用靜式染毒法或動式染毒法。6.2.3.3.1靜式染毒是將實驗動物放在一定體積的密閉容器（染毒柜）內(nèi)，加入一定量的消毒劑，并使其揮發(fā)，造成實驗需要消毒劑濃度的空氣，一次吸入性染毒2h。6.2.3.3.2染毒柜的容積以每只染毒小鼠不少于3L/h空氣計，每只大鼠不少于30L/h計。6.2.3.3.3計算染毒濃度，染毒濃度一般應(yīng)采用實際測定濃度。在染毒期間一般可測4次~5次，求其平均濃度。在無適當(dāng)測試方法時?？捎檬?4)計算染毒濃度：式中：6.2.3.4.1動式染毒是采用機械通風(fēng)裝置，連續(xù)不斷地將含有一定濃度消毒劑的空氣均勻不斷地送入染毒柜，并排出等量的染毒氣體，維持相對穩(wěn)定的染毒濃度。一次吸入性染毒2h。6.2.3.4.2氣體消毒劑，經(jīng)流量計與空氣混合成一定濃度后，直接輸入染毒柜。易揮發(fā)液體消毒劑，通過空氣鼓泡或適當(dāng)加熱促使揮發(fā)后輸入染毒柜。若消毒劑現(xiàn)場使用采取噴霧法時，可采用噴霧器或超聲霧化器使其霧化后輸入染毒柜。6.2.3.4.3計算染毒濃度，染毒濃度一般應(yīng)采用動物呼吸帶實際測定濃度，每30min一次，取其平均值。若無適當(dāng)?shù)臏y試方法，也可采用式(5)計算染毒濃度：式中：a—氣化或霧化消毒劑量，單位為立方米(m3)內(nèi)無一死亡可判定。GB／T38496—20206.2.4急性吸入毒性試驗評價規(guī)定急性吸入毒性試驗評價規(guī)定見表6。表6急性吸入毒性分級3毒性分級LC50≥10000實際無毒1000≤LC50<10000低毒100≤LC50<1000中等毒10≤LC50<100高毒LC50<10劇毒6.3皮膚刺激試驗檢測消毒劑對實驗動物皮膚的刺激（腐蝕）作用和強度。每次試驗至少3只皮膚完好的健康家兔或豚鼠。6.3.3.1.1試驗用受試物的濃度一般為皮膚消毒應(yīng)用液的5倍或使用消毒劑原液。h,用脫毛劑或剪刀將家兔或豚鼠背部脊柱兩側(cè)的毛去掉。去毛范圍，各約不得損傷皮膚。直接滴于面積為2.5的一側(cè)去毛完整皮膚上，或滴于同樣大小的2層~4層紗布上并敷貼在一側(cè)去毛皮膚表面，然后用一層無刺激塑料膜或油紙覆蓋，再用無刺激膠布固定。另一側(cè)去毛皮膚作為空白對照（或溶劑對照）。敷貼時間為4h。對于用后清洗的消毒劑，敷用時間至2h。試驗結(jié)束后，用溫水或無刺激性溶劑除去殘留受試物。h觀察皮膚局部反應(yīng)，并按表7進行刺激反應(yīng)評分。表7皮膚刺激反應(yīng)的評分標(biāo)準(zhǔn)皮膚刺激反應(yīng)皮膚刺激反應(yīng)評分紅斑形成無0勉強可見1明顯2嚴(yán)重3紫紅色紅斑，并有焦痂4GB／T38496—2020皮膚刺激反應(yīng)皮膚刺激反應(yīng)評分水腫形成無0勉強可見1皮膚隆起，輪廓清楚2水腫隆起約13水腫隆起超過146.3.3.2一次破損皮膚刺激試驗的去毛皮膚上，用酒精清潔、消毒暴露皮膚，待酒精揮發(fā)后，用滅菌刀片或注射針頭在皮區(qū)內(nèi)劃一個“井”形的破損傷口，并在該破損皮區(qū)內(nèi)染毒。注意皮膚破損僅達表皮，不要傷及真皮。6.3.3.2.2試驗用受試物的濃度、手術(shù)前的皮膚準(zhǔn)備、手術(shù)后受試物的涂抹、局部皮膚反應(yīng)的觀察和評分方法按6.3.3.1的要求進行。注意鑒別感染和原發(fā)性刺激反應(yīng)的區(qū)別，若有感染可疑，應(yīng)進行重復(fù)測試。6.3.3.3多次完整皮膚刺激試驗涂在一側(cè)皮膚上，受試物的濃度同6.3.3.1.1,另一側(cè)涂溶劑作為對涂抹后24觀察結(jié)果，按表7評分。為了便于受試物的涂抹和結(jié)果觀察，必要時應(yīng)剪毛。對照區(qū)的處理方法同試驗區(qū)。在各個觀察時間點，按照表7對動物的皮膚紅斑與水腫形成情況進行評分，并分別按時間點將3只動物的評分相加，除以動物數(shù)，獲得不同時間點的皮膚刺激反應(yīng)積分均值（刺激指數(shù)）。取其中最高皮膚刺激指數(shù)，按表8評定該受試物對動物皮膚刺激強度的級別。表8皮膚刺激強度分級皮膚刺激指數(shù)DI刺激強度級別0≤DI<0.5無刺激性0.5≤DI<2.0輕刺激性2.0≤DI<6.0中等刺激性6.0≤DI≤8.0強刺激性按式(6)計算每天每只動物皮膚刺激指數(shù)(DI),并以表8判定皮膚刺激強度。GB／T38496—2020n×14n×14式中：DI—皮膚刺激指數(shù)；d的紅斑和水腫總積分；n—受試動物數(shù)；14—多次皮膚試驗刺激天數(shù)。6.4急性眼刺激試驗檢測消毒劑對實驗動物眼睛的急性刺激和腐蝕作用。使用3只家兔。試驗前檢查家兔雙眼，有異常者不能用于試驗。6.4.3.1試驗用受試物一般為黏膜或空氣消毒應(yīng)用液的5倍濃度的溶液或消毒劑原液。mL,滴入家兔一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)。另一側(cè)眼以生理鹽水作為正常對照。d,肉眼觀察家兔眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷與恢復(fù)情況。如果72h內(nèi)未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，或第或第14鏡檢查角膜及虹膜變化。按表9對家兔眼角膜、虹膜和結(jié)膜的急性刺激反應(yīng)進行評分，并分別計算每只動物在3個不同觀察時間(24的角膜損害、虹膜損害、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫四方面的“平均評分”（即每只動物h評分之和除以觀察數(shù)3)。分別以動物眼角膜、虹膜和結(jié)膜充血、水腫的平均評分和恢復(fù)時間，按表10、表11判定受試物對眼睛的刺激強度。表9家兔急性眼刺激反應(yīng)的評分標(biāo)準(zhǔn)眼損害表現(xiàn)評分角膜損害無潰瘍形成或混濁0散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見1半透明區(qū)易分辨，虹膜模糊不清2出現(xiàn)灰白色半透明區(qū)，虹膜細節(jié)不清，瞳孔大小勉強可見3角膜不混濁，虹膜無法辨認4虹膜損害正常0反應(yīng)1出血、肉眼可見破壞，或瞳孔對光無反應(yīng)2GB／T38496—2020眼損害表現(xiàn)評分充血血管正常0血管充血呈鮮紅色1血管充血呈深紅色，血管不易分辨2彌漫性充血呈紫紅色3水腫無水腫0輕微水腫（包括瞬膜）1明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻2水腫至眼瞼近半閉合3水腫至眼瞼大半閉合4表10眼刺激性反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)（一）損傷類型分級標(biāo)準(zhǔn)可逆性損傷無刺激性動物中至少有2只動物的平均評分符合上述標(biāo)準(zhǔn)，另外1只動物的刺激反應(yīng)在21d內(nèi)完全恢復(fù)a輕刺激性3只動物中有2只動物的平均評分：角膜損害≥1;虹膜損害≥1;結(jié)膜充血≥2;結(jié)膜水腫且7d內(nèi)全部動物的刺激反應(yīng)完全恢復(fù)a可逆性損傷刺激性b3只動物中有2只動物的平均評分：角膜損害≥1;虹膜損害≥1;結(jié)膜充血≥2;結(jié)膜水腫且21d內(nèi)全部動物的刺激反應(yīng)完全恢復(fù)不可逆性損傷腐蝕性c至少有1只動物的角膜、虹膜或結(jié)膜的刺激反應(yīng)在21d的觀察期內(nèi)未完全恢復(fù)或（和）b刺激性是指接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性反應(yīng)。c腐蝕性是指接觸受試物后所產(chǎn)生的不可逆性組織損傷。平均評分動物數(shù)只恢復(fù)時間ad損傷類型角膜損害虹膜損害結(jié)膜充血結(jié)膜水腫<2≥2≤21可逆性損傷無刺激性角膜損害或虹膜損害或結(jié)膜充血或結(jié)膜水腫≥2≥2≤7可逆性損傷輕刺激性≤21刺激性GB／T38496—2020平均評分動物數(shù)只恢復(fù)時間ad損傷類型角膜損害或虹膜損害≥2 不可逆性損傷腐蝕性b角膜損害或虹膜損害或結(jié)膜充血或結(jié)膜水腫≥1≥1>21a恢復(fù)時間是指動物刺激反應(yīng)評分恢復(fù)至角膜損害=0,虹膜損害=0,結(jié)膜充血=0或1,結(jié)膜水腫=0或1的時間。d尚存在角膜粘連或血管翳，也可判為腐蝕性。6.5陰道黏膜刺激試驗檢測消毒劑對實驗動物陰道黏膜的刺激作用和強度。試驗前應(yīng)檢查動物陰道口有無分泌物、充血、水腫和其他損傷情況。如有炎癥或（和）損傷，應(yīng)棄用。選擇未交配的動物進行試驗。分為染毒組和對照組，每組3只。6.5.4.1稀釋使用的消毒劑采用黏膜消毒時應(yīng)用液5倍濃度的溶液作為受試物。若應(yīng)用液為原液的消毒劑則用原液作受試物。對照組采用生理鹽水。的注射器連接。注射器和導(dǎo)管注滿受試液備用。每只動物各準(zhǔn)備一套。6.5.4.3一次陰道黏膜刺激試驗的染毒方法：將動物仰面固定，暴露出會陰和陰道口。將導(dǎo)管用受試液并用注射器緩慢注入2mL受試液，抽出導(dǎo)管，完成染毒。對照組動物用生理鹽水作同樣處理。6.5.4.4由于動物陰道容積的個體差異，有時受試液注入后可能有溢出，可用消毒棉或軟紙拭去。h,采用氣栓法處死動物，剖腹取出完整的陰道，縱向切開，肉眼觀察是否有充血、水腫等表現(xiàn)，供病理取材時參考。然后將陰道放入福爾馬林溶液中固定24h以上，選取陰道的兩端和中央（即位于恥骨聯(lián)合處附近）3個部位的組織制片，HE染色后，進行組織病理學(xué)檢查。6.5.5.1組織病理學(xué)檢查結(jié)果，按表12規(guī)定對陰道黏膜的刺激反應(yīng)進行評分。GB／T38496—2020表12陰道黏膜刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)a陰道組織反應(yīng)反應(yīng)評分A.上皮組織完整—正常0細胞變性或變扁平1組織變形2局部糜爛3廣泛糜爛或潰瘍4B.白細胞浸潤（每個高倍視野）無0極少<25個1輕度25個~50個23重度＞100個4C.血管充血無0極少1輕度2中度3重度伴血管破裂4D.水腫無0極少1輕度2中度3重度4a刺激反應(yīng)積分=A+B+C+D。6.5.5.2將實驗組3只動物3個部位的刺激反應(yīng)積分相加后，再除以觀察總數(shù)（動物數(shù)×3),得出實驗組陰道黏膜刺激反應(yīng)的平均積分，最大記分為16（見表12)。6.5.5.4將實驗組平均積分減去對照組平均積分得出刺激指數(shù)后，按表13進行刺激強度分級。表13陰道黏膜刺激強度分級陰道黏膜刺激指數(shù)DI陰道黏膜刺激反應(yīng)強度0≤DI<1無1≤DI<5極輕輕度9≤DI<12中度DI≥12重度6.5.5.5當(dāng)對照組動物陰道黏膜刺激反應(yīng)平均積分大于9時，應(yīng)采用6只動物進行復(fù)試，以鑒別是否與操作損傷有關(guān)。GB／T38496—20206.6皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗檢測消毒劑重復(fù)接觸后，實驗動物產(chǎn)生皮膚變態(tài)反應(yīng)的可能性及其強度。將豚鼠隨機分為實驗組、陰性對照組和陽性對照組，每組動物至少16只。6.6.4.1對實驗組豚鼠，給予受試物誘導(dǎo)和激發(fā)處理。陽性對照組給予陽性致敏物（如：2,4-二硝基氯苯）誘導(dǎo)和激發(fā)處理。陰性對照組僅給以受試物激發(fā)處理。6.6.4.2誘導(dǎo)處理濃度允許引起皮膚輕度刺激反應(yīng)。激發(fā)濃度可低于誘導(dǎo)濃度，并不得引起原發(fā)性刺激反應(yīng)。如果原液不引起皮膚刺激反應(yīng)，誘導(dǎo)和激發(fā)均使用原液。h將豚鼠背部左側(cè)3范圍內(nèi)去毛。取誘導(dǎo)濃度的消毒劑溶液（或原液）直接涂在2左側(cè)去毛皮膚上或滴于同樣大小的2層~4層紗布上，再將其敷貼在樣方法重復(fù)一次。d,將激發(fā)濃度的消毒劑溶液0.5直接涂在2右側(cè)脫毛皮膚去毛區(qū)。然后，用一層塑料膜或油紙和無刺激膠布固定，6h后將敷貼的受試物洗去。24h和48h后觀察皮膚反應(yīng)，按表14對皮膚反應(yīng)進行評分。嚴(yán)重水腫3表14嚴(yán)重水腫3皮膚反應(yīng)評分紅斑形成水腫形成無紅斑0輕微紅斑1中度紅斑2嚴(yán)重紅斑3水腫性紅斑4無水腫0輕度水腫1中度水腫26.6.4.5實驗室開展皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗初期，或使用新的動物種屬或品系時，應(yīng)同時設(shè)陽性對照組，陽性對照物可使用2,4-二硝基氯代苯。為保證試驗方法的可靠性，在進行該類試驗時，每隔半年應(yīng)使用陽性對照物檢查一次。若檢測報告中需要用非本次陽性對照組的實驗數(shù)據(jù)時，應(yīng)注明其實驗日期。陽性對照組的操作程序同實驗組，以陽性致敏物替代受試物。GB／T38496—20206.6.4.6陰性對照組，僅對動物給予受試物的激發(fā)處理，每次試驗應(yīng)設(shè)置。6.6.5.1化學(xué)物質(zhì)引起的過敏性接觸性皮炎，屬遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。對于動物，僅見皮膚紅斑和水腫。按表15評定致敏強度。表15致敏強度分級標(biāo)準(zhǔn)a致敏率%致敏強度0~8極輕度9~28輕度29~64中度65~80強度81~100極強度時，可判為未見皮膚變態(tài)反應(yīng)。6.7亞急性經(jīng)口毒性試驗6.7.1.1檢測消毒劑多次接觸對實驗動物的蓄積毒性作用及其靶器官，并確定其最大未觀察到有害作用劑量和最小觀察到有害作用劑量。6.7.1.2為亞慢性、慢性毒性或致癌試驗的劑量設(shè)計提供依據(jù)。一般用嚙齒類動物，首選大鼠，所用大鼠應(yīng)為6周~8周齡，每組至少10只，雌雄各半。將實驗動物隨機分為4組(3個劑量組和1個對照組）。選擇受試物劑量時，高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，但不引起死亡，如果出現(xiàn)動物死亡應(yīng)不超過中間劑量組應(yīng)可觀察到輕微的毒性效應(yīng)；低劑量組應(yīng)不引起任何毒性效應(yīng)（屬未觀察到有害作用劑量）。至于具體的劑量設(shè)計，可考慮高劑體重的消毒劑，高劑量應(yīng)用1000體重。另以受試物溶劑代替受試物進行試驗，作6.7.4.2灌胃法每天灌胃一次，每周稱體重，并按體重調(diào)整受試物的給予量。h處死實驗動物，檢測各項觀察指標(biāo)。GB／T38496—2020觀察動物中毒表現(xiàn)，每周稱量體重一次。包括血紅蛋白含量、紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及其分類計數(shù)等。例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素氮、肌酐、血清總蛋白和白蛋白、總膽固醇等。必要時，可根據(jù)所觀察到的受試物毒性效應(yīng)，或與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的毒性作用，選擇其他一些生化指標(biāo)。測量肝、腎等重要臟器的重量，并計算其臟器重量系數(shù)。實驗結(jié)束時，處死所有動物，進行全面的肉眼尸檢，并將尸檢發(fā)現(xiàn)的異常組織和主要臟器和組織（如進行高劑量組和陰性對照組動物的肝、腎、胃腸和其他可能受損的臟器的組織病理學(xué)檢查。如大體解剖發(fā)現(xiàn)異常或高劑量組動物組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)病變，還應(yīng)對中、低劑量組動物相應(yīng)的器官進行組織病理學(xué)檢查。將各實驗組動物觀察指標(biāo)與陰性對照組加以比較，并進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，注意各劑量組間的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系。評定受試物的最小觀察到有害作用劑量和最大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。6.8.1體外哺乳動物L(fēng)5178Y細胞基因突變試驗檢測消毒劑對體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞的基因突變作用，以作為評價消毒劑致突變性的依據(jù)。為完全培養(yǎng)液。以或培養(yǎng)液加入馬血清丙酮酸鈉青霉素和鏈霉素配制而成(于冰箱中保存?zhèn)溆?。為無血清培養(yǎng)液。以或培養(yǎng)液加入丙酮酸鈉青霉素和鏈霉素等配制而成(于冰箱中保存?zhèn)溆谩?.8.1.2.3馬血清：將過濾除菌后的馬血清，經(jīng)56℃作用30min滅活補體。分裝后，于-20℃保存?zhèn)溆?。GB／T38496—2020集落用培養(yǎng)基用或培養(yǎng)液加入馬血清丙酮酸鈉瓊脂0.37%配制而成。無鈣鎂磷酸鹽緩沖液無鈣鎂磷酸二氫鉀(KH2PO4)磷酸氫二鈉(氯化鉀(KCl)氯化鈉(NaCl)雙蒸水（壓力蒸汽滅菌）6.8.1.2.6受試物：最好能直接溶于F10P與F0P培養(yǎng)液中。否則應(yīng)先溶于二甲基亞砜(DMSO),而后再加于上述培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO的量應(yīng)低于1%（體積分?jǐn)?shù)）。6.8.1.2.7陽性對照物：選用甲基磺酸乙酯(EMS),絲裂霉素C(MMC),甲基硝基亞硝基胍(MNNG),苯并（a）芘(BaP)等。三氟胸苷(TFT)：用生理鹽水配成100μg/mL溶液，可凍存3個月。6.8.1.2.9肝微粒體酶混合液(S9混合液取健康的雄性成年SD或Wistar大鼠，體重150g左右，約周齡周齡溶于玉米油中濃度按體重一次腹腔注射。5d后，斷頭處死動物，取出肝臟稱重后，用預(yù)冷的0.15mol/L氯化鉀溶液沖洗肝臟數(shù)次。每克肝（濕重）加0.15mol/L氯化鉀溶液3mL。剪碎肝臟，在冰浴中用玻璃勻漿器制成肝勻漿。以上操作應(yīng)注意無菌和局部冷環(huán)境。將肝勻漿用低溫(0℃~4℃)高速離心機，以9000g離心10min。取上清液即為S9,分裝于無菌冷凍安瓿中。S9制成后，應(yīng)進行無菌檢查，以及用間接致癌物鑒定其活性。合格者置-80℃或液氮中儲存?zhèn)溆?，儲存期不超過半年。S9混合液應(yīng)以上述S9液在臨用時按無菌要求配制。一般配成含10%S9的混合液。其配方如下：氯化鉀氯化鎂葡萄糖磷酸·氧化型輔酶試驗以小鼠淋巴瘤L5178Y細胞［胸苷激酶(TK)座位為雜合子(tk+/tk-)]檢測TK基因的突變。為減少細胞的自發(fā)突變率，在制備該細胞試驗用懸液時，先將其在加有THMG的F10P培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,殺滅培養(yǎng)液中所存在的自發(fā)突變細胞(tk-/tk-),然后將細胞懸浮于THG培養(yǎng)液（不含氨甲喋呤的THMG培養(yǎng)液）中培養(yǎng)1d~3d。THMG含下列4種成分，各成分的終末濃度如下：胸苷次黃嘌呤氨甲喋呤甘氨酸mol/Lmol/Lmol/Lmol/L6.8.1.4.1一般設(shè)4個劑量組。有細胞毒性的受試物，最高劑量組的細胞存活率為10%~20%,無細胞毒性受試物最高劑量不超過10mmol/L或5mg/mL。GB／T38496—20206.8.1.4.2同時應(yīng)有陰性（溶劑）對照組、陽性對照組和未處理對照組。陽性與陰性對照組的操作程序同實驗組，陽性對照組用陽性對照物代替受試物，陰性（溶劑）對照組用受試物溶劑代替受試物。6.8.1.4.3除未處理對照組外，實驗組和其他對照組，還均應(yīng)包括有加S9混合液和不加S9混合液的兩部分。將新清除了自發(fā)突變體的細胞群體，用F10P培養(yǎng)液制成懸液。以無菌燒瓶加入細胞懸液和F10P培養(yǎng)液至100mL，細胞終末密度為7×103個／mL~8×103個／mL。培養(yǎng)物以含5%二氧化碳的空氣充氣后，加蓋密閉，于36℃±1℃進行培養(yǎng)。L5178Y細胞的細胞增殖周期約為10h~11h，在常規(guī)培養(yǎng)24h后，細胞數(shù)將增加約5倍。用稀釋法維持生長，每天將細胞培養(yǎng)物用F10P培養(yǎng)液作4倍稀釋（或隔天用F10P培養(yǎng)液作24倍稀釋繼續(xù)培養(yǎng)。實驗前一天用F10P培養(yǎng)液和F0P培養(yǎng)液各50%的對半混合液（馬血清終末濃度為5%）稀釋。的對半混合液將細胞培養(yǎng)物稀釋至1×106個／mL，并分種于50mL有蓋述試管內(nèi)加入一定濃度的受試物，并以含5%二氧化碳的空氣充氣后加蓋密閉，于36℃±1℃培養(yǎng)4h。處理結(jié)束后，以200g離心10min，除去含受試物的上清液，收集細胞。細胞用Hanks液洗滌，再密閉，于36℃±1℃振蕩培養(yǎng)，開始表達。細胞的表現(xiàn)型表達時間為2d。表達開始后24h和48h經(jīng)計數(shù)后將細胞稀釋至3×105個／mL。表達結(jié)束后，取10mL培養(yǎng)物經(jīng)離心后除去大部分上清液。并將細胞在留下的約1mLF10P培養(yǎng)基中混懸。將細胞懸液移入含100mL集落培養(yǎng)基的燒瓶中。此時細胞密度為3×104個／mL。在36℃±1℃振蕩培養(yǎng)30min。取出0.5mL后，向余下的細胞懸液中加入1.0mLTFT貯存液，繼續(xù)振平板作突變體的選擇。將先前取出的0.5mL細胞懸液用集落培養(yǎng)基先作1∶100稀釋，細胞懸液濃含細胞200個（稱為VC平板）。待瓊脂凝固后，置二氧化碳培養(yǎng)箱（36℃±1℃）中靜置培養(yǎng)10d。計數(shù)各個平皿中出現(xiàn)的集落數(shù)（m）。按式（7）、式（8）計算絕對集落形成效率（Ea）和相對集落形成效率（Er按式（9）計算突變頻率EGB／T38496—2020式中：Ea—絕對集落形成效率；m—形成集落數(shù)，單位為細胞集落數(shù)（CFUn—接種細胞數(shù)，單位為細胞個數(shù)。式中：Er—相對集落形成效率；Ea1—實驗組絕對集落形成效率；Ea0—溶劑對照組絕對集落形成效率。式中：MF—突變頻率；—TFT平板集落數(shù)，單位為細胞集落數(shù)（CFU—VC平板集落數(shù)，單位為細胞集落數(shù)（CFUf—稀釋系數(shù)為2×10-4。對細胞，自發(fā)突變頻率推薦可接受的范圍為。6.8.1.6.2用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)檢驗方法處理，當(dāng)各劑量組MF與陰性（溶劑）對照組者相比突變率升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時，或僅一個劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義的升高并經(jīng)重復(fù)試驗證實者，均可判為陽性結(jié)果，即受試物對L5178Y細胞TK系統(tǒng)有致突變性。6.8.2體外哺乳動物V79細胞基因突變試驗檢測消毒劑對體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞可否引起基因突變，以對消毒劑的致突變性做出評價。完全培養(yǎng)液最低必需培養(yǎng)液或培養(yǎng)液加小牛血清青霉和鏈霉素配制而成。6.8.2.2.2小牛血清：將過濾除菌后的小牛血清放入56℃水浴中，保溫30min以滅活補體，而后分裝，保存于-20℃?zhèn)溆谩?.8.2.2.4胰蛋白酶-EDTA溶液：分別用無鈣鎂PBS配制胰蛋白酶與EDTA溶液，胰蛋白酶溶液濃度溶液濃度為兩溶液按混合存放于備用。6.8.2.2.5受試物：最好能直接溶于無血清培養(yǎng)液內(nèi)。否則，先溶于二甲基亞砜（DMSO而后加于無血清培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO溶液量為0.5%（體積分?jǐn)?shù)）。硫代鳥嘌呤用碳酸氫鈉溶液配制為溶液保存于備用。GB／T38496—2020取磷酸氫二鈉溶于蒸餾水配成第一液；取磷酸二氫鉀49.07g溶于蒸餾水1000mL中，配成第二液；取第一液49.5mL加于第二液中混勻即為磷酸鹽緩沖液。6.8.2.2.10姬姆薩染液：取姬姆薩染料3.8g,置瑪瑙乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375mL,待完全溶解后，再加125mL甘油，放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫48h。保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過濾，兩周后使用，作為姬姆薩染液原液。使用時，取1份姬姆薩染液原液，與9份0.067mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)混合，配成其應(yīng)用液。以中國倉鼠肺(V79)細胞株進行試驗。為減少其自發(fā)突變，正式試驗前將野生型細胞接種于含THMG（見6.8.1.3)的MEM培養(yǎng)液內(nèi)并在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，以殺滅自發(fā)HGPRT位點突變體。遂后重新接種于MEM培養(yǎng)液中。6.8.2.4.1一般設(shè)4個試驗劑量組。對有細胞毒性的受試物，最高劑量組的細胞存活率為10%~20%,無細胞毒性受試物最高劑量不超過10mmol/L（或5mg/mL)。6.8.2.4.2同時應(yīng)設(shè)陰性（溶劑）對照組、陽性對照組和未處理對照組。陽性與陰性對照組的操作程序同實驗組，陽性對照組用陽性對照物代替受試物，陰性（溶劑）對照組用受試物溶劑代替受試物。6.8.2.4.3除未處理對照組外，各組均應(yīng)包括加S9混合液和不加該液的樣本。將5×105個細胞接種于含完全培養(yǎng)液的直徑為100mm的平皿中，除未處理對照組一皿外，其余每組二皿，共13皿。于二氧化碳培養(yǎng)箱中(36℃±1℃)培養(yǎng)24h。吸去6.8.2.5.1培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用無鈣鎂PBS洗2次。將含有細胞的培養(yǎng)皿分為兩大組，一組加S9混合液，另一組不加S9混合液。加S9混合液組，在培養(yǎng)皿中加入2mLS9混合液，對不加S9混合液組，則用2mL無血清培養(yǎng)液代替，再加一定量不同濃度受試物的供試液，最后用不含血清的培養(yǎng)液補足至10mL。并將培養(yǎng)皿置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h,處理結(jié)束后，吸去培養(yǎng)皿中液體部分，用無鈣鎂PBS洗滌細胞2次，再加入完全培養(yǎng)液10mL,在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19h~22h。陽性和陰性（溶劑）對照組也分加與不加S9混合液兩大組，操作方法同上。將培養(yǎng)物用胰蛋白酶-EDTA消化。待細胞脫落后，加入完全培養(yǎng)液，終止消化。混勻、計數(shù)并進行表達。表達時，以5×105個細胞接種于直徑為100mm的平皿中。培養(yǎng)3d后，分傳一次，仍接種5×105個細胞，培養(yǎng)3d后再進行突變體的選擇，并按6.8.1.5.5中式(7)和式(8)計算絕對集落形成效率（Ea)和相對集落形成效率（Er)。將6.8.2.5.3消化計數(shù)后的細胞，每平皿接種200個，每組5個平皿，于二氧1℃)培養(yǎng)7d。取出樣本，固定并進行姬姆薩染色后，計數(shù)各平皿的細胞集落數(shù)。并按6.8.1.5.5中式GB／T38496—2020(8)計算相對集落形成效率（犈r),以相對集落形成效率表示細胞的毒性。表達結(jié)束后，消化細胞，分別接種，每組5個平皿，每平皿種2×105個細胞。待細胞貼壁后加入6-TG,終末濃度為5μg/mL。放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d~10d。固定后進行姬姆薩染色，計數(shù)平皿內(nèi)集落數(shù)，并計算其突變頻率(MF)。按式(10)計算突變頻率：a式中：MF—突變頻率；犿—突變集落數(shù)，單位為細胞集落數(shù)(CFU);犈a—絕對集落形成效率；狀—接種細胞數(shù)。(10)對細胞，推薦可接受的自發(fā)突變頻率范圍為。6.8.2.6.2用適當(dāng)統(tǒng)計學(xué)檢驗方法處理，當(dāng)各劑量組MF與陰性（溶劑）對照組者相比，突變率升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時，或僅一個劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義的升高并經(jīng)重復(fù)試驗證實者，均可判為陽性結(jié)果，即受試物對V79細胞HGPRT系統(tǒng)有致突變性。6.8.3體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗用細胞遺傳學(xué)方法檢測體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體畸變，評價消毒劑的致突變性。完全培養(yǎng)液采用最低必需培養(yǎng)液(或最低必需培養(yǎng)液(等，并加入10%小牛血清以及青霉素(100IU/mL)和鏈霉素(100μg/mL)。無鈣鎂磷酸鹽緩沖液無鈣鎂見6.8.3.2.5受試物：最好能直接溶于無血清完全培養(yǎng)液內(nèi)。否則，先溶于二甲基亞砜(DMSO),而后加于完全培養(yǎng)液內(nèi)。所加DMSO溶液量應(yīng)低于1.0%（體積分?jǐn)?shù)）。6.8.3.2.6陽性對照物：加S9時選用環(huán)磷酰胺等，不加S9時選用絲裂霉素C等。取秋水仙素溶解于無菌除菌。GB／T38496—2020可選用中國倉鼠肺(CHL)細胞、中國倉鼠肺(V79)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或人外周血淋巴細胞等進行試驗。在一般情況下，本試驗推薦使用CHL細胞。6.8.3.4.1所設(shè)試驗劑量組應(yīng)不少于4個。最高劑量組的細胞存活率一般應(yīng)為10%~20%,無毒性受試物最高劑量組不超過10mmol/L（或5mg/mL)。6.8.3.4.2同時應(yīng)設(shè)陰性（溶劑）對照組、陽性對照組和未處理對照組，陽性與陰性對照組的操作程序同實驗組，陽性對照組用已知染色體斷裂劑替代受試物，陰性（溶劑）對照組用受試物的溶劑。6.8.3.4.3除未處理對照組外，各組均應(yīng)包括加S9混合液和不加該液的樣本。使用CHL細胞時，在試驗前一天，將其1×106個細胞接種于直徑為100mm平皿中，置36℃±1℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)待用。試驗時，吸出細胞培養(yǎng)平皿中的培養(yǎng)液，加入試驗所規(guī)定濃度的受試物和S9混合物(10%)以及不含小牛血清的完全培養(yǎng)液，放二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)作用2h。結(jié)束后，吸去完全培養(yǎng)液，用Hanks液洗細胞3次。加完全培養(yǎng)液，再置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24h收獲細胞。收獲細胞之前2h~4h,加入秋水仙素溶液（終末濃度為1μg/mL),阻斷細胞于有絲分裂中期相。用胰蛋白酶-EDTA溶液消化細胞，待細胞脫落，加入培養(yǎng)液并混勻以終止胰蛋白酶作用。離心棄去上清液后加入氯化鉀溶液低滲處理左右。每組各選100個染色體分散良好的中期分裂相細胞，進行染色體畸變分析，觀察和記錄染色體結(jié)構(gòu)的異常及數(shù)量異常。染色體結(jié)構(gòu)異常可有：斷裂、微小體、有著絲點環(huán)、無著絲點環(huán)、單體互換、雙微小體、裂隙、非特定性型變化（粉碎化等）。染色體數(shù)量異?？捎校悍钦扼w、多倍體、內(nèi)復(fù)制。用χ2檢驗或其他適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)檢驗方法，對所得試驗數(shù)據(jù)進行處理。當(dāng)各劑量組與陰性（溶劑）對照組相比，畸變細胞率升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時；或僅一個劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義的升高并經(jīng)重復(fù)試驗證實者，并經(jīng)重復(fù)試驗證實時，可判為該受試物在本試驗中具有致突變性。6.8.4小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗檢測消毒劑對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核形成的影響，評價消毒劑的染色體損傷毒性。GB／T38496—20205%羧甲基纖維素鈉配制成溶液或混懸液。6.8.4.2.2陽性對照物：常用環(huán)磷酰胺或絲選用體重為25的小鼠，雌雄各半。隨機分為5組，受試物至少設(shè)3個劑量組，每個劑量組用10只動物，雌雄各半。另設(shè)陰性（溶劑）和陽性對照組。劑量組一般取受試物的1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50等劑量，以得到劑量-反應(yīng)關(guān)系。高體重）。陰性（溶劑）對照組用受試物溶劑。h染毒法，即兩次染毒間隔24h,第二次染毒后24h取材。6.8.4.5.2用頸椎脫臼法處死動物，取股骨或胸骨。剝除肌肉，擦凈血污。切斷股骨或胸骨兩端，暴露骨髓腔。小牛血清，沖洗骨髓腔。用沖洗液常規(guī)涂片，晾干或熱風(fēng)吹干。將已干的涂片在甲醇中固定5然后液沖洗，晾干。6.8.4.5.5陽性與陰性對照組的操作程序同實驗組。6.8.4.5.6選擇細胞分布均勻、完整、著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域。在油鏡下計數(shù)含微核的嗜多染紅細胞(PCE)數(shù)。成熟紅細胞(NCE)呈粉紅色，而PCE呈灰藍色，微核多呈圓形、邊緣光滑、整齊，嗜色性與有核細胞核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍紫色。直徑通常為紅細胞的1/20~1/5。6.8.4.5.7每只動物計數(shù)1000個PCE。微核細胞率指含有微核的PCE數(shù)，以千分率表示。一個PCE中出現(xiàn)有兩個或多個微核，仍按一個計數(shù)。此外，還應(yīng)觀察PCE/NCE比例，作為對細胞毒性的指標(biāo)。一般計數(shù)200個PCE,同時記數(shù)所見到的NCE。當(dāng)PCE/NCE小于0.1時，提示對骨髓具有明顯抑制作用，應(yīng)降低受試物劑量，重新進行試驗。6.8.4.6.2用泊松分布、二項分布或其他適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)檢驗試驗方法處理。當(dāng)各劑量組與溶劑對照組相比，微核細胞率升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，或僅一個劑量組微核細胞率有統(tǒng)計學(xué)意義的升高，并經(jīng)重復(fù)試驗證實時，均可判為受試物具有體內(nèi)染色體損傷作用。6.8.5哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗用細胞遺傳學(xué)方法檢測實驗動物骨髓細胞染色體畸變率，評價消毒劑的致突變性。GB／T38496—2020見磷酸鹽緩沖液(成年小鼠（體重25g~30g),或大鼠（體重180g~220g)。動物總數(shù)不少于30只，雌雄各半。2mg/kg體重）。陰性（溶劑）對照組采用受試物溶劑。6.8.5.5.1用經(jīng)口灌胃方式，共染毒兩次，間隔24h。于第二次染毒后6h處死動物。處死動物前2h~4h腹腔注射0.04%秋水仙素溶液，劑量為4mg/kg體重。6.8.5.5.2用頸椎脫臼法處死動物，取出股骨，剔除肌肉等組織。6.8.5.5.3剪去股骨兩端，用注射器吸取5mL生理鹽水，從股骨一端注入，用10mL離心管從股骨另一端接取流出的骨髓細胞懸液。除上清液加氯化鉀溶液7mL,用滴管將細胞輕輕混勻，置36℃±1℃水浴中低滲處理7min。加入-冰醋酸固定液混勻離心(棄上清液再加固定液混勻固定棄去上清液。6.8.5.5.6用同法再固定1次~2次，棄上清液，加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。6.8.5.5.7用懸液滴片，晾干，以姬姆薩應(yīng)用液染色。6.8.5.5.8每組各選100個染色體分散良好的中期分裂相細胞，進行染色體畸變分析，觀察和記錄染色體結(jié)構(gòu)的異常和數(shù)量的異常。染色體結(jié)構(gòu)異常可有：斷裂、微小體、有著絲點環(huán)、單體互換、雙微小體、裂隙、粉碎化等。染色體數(shù)量的異?？捎校悍钦扼w、多倍體、內(nèi)復(fù)制等。6.8.5.5.9計算畸變細胞率?；兗毎蕿?00個中期分裂相細胞中有染色體畸變的細胞數(shù)。一個中期分裂相細胞出現(xiàn)兩種或多種畸變，仍按一個有染色體畸變細胞計。6.8.5.5.10陽性與陰性（溶液）對照組的操作程序同實驗組。只是陽性組選用環(huán)磷酰胺(40mg/kg體重）或絲裂霉素(1.5mg/kg~2.0mg/kg體重）作為受試物的替代物。陰性（溶劑）對照組用受試物溶劑作為受試物的替代物。用χ2檢驗或其他適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)檢驗方法對所得試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性（溶劑）對照組相比，畸變細胞率升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時；或僅一個劑量組畸變細胞率有統(tǒng)計學(xué)意義的升高，并經(jīng)重復(fù)試驗證實時，可判為該受試物在本試驗中具有致突變性。GB／T38496—20206.8.6程序外DNA修復(fù)合成試驗檢測受試物是否可引起體外哺乳動物細胞的原發(fā)DNA損傷。推薦用放射自顯影法進行測定。6.8.6.2.1完全培養(yǎng)液：用Eagle最低要求培養(yǎng)基(EMEM)85份加小牛血清15份，青霉素（終末濃度與鏈霉素終末濃度過濾除菌后保存于冰箱備用。6.8.6.2.2同步培養(yǎng)液：用不含精氨酸的EMEM培養(yǎng)基98份，加小牛血清2份，再加青霉素（終末濃度100IU/mL)與鏈霉素（終末濃度為100μg/mL)配制而成。6.8.6.2.8顯影液及定影液：包括柯達(Kodak)D-196顯影液、停顯液及F-5定影液。羥基脲(貯備液(枸櫞酸鈉溶液。可選用人成纖維細胞、大鼠原代肝細胞、外周血淋巴細胞等進行試驗，宜使用人胚肺成纖維細胞(2BS)。受試物可設(shè)4個劑量組。最高劑量組應(yīng)使細胞存活率在10%~20%之間。無毒性受試物最高劑量不超過10mmol/mL。同時應(yīng)有陽性對照組和陰性（未處理、溶劑）對照組。陽性對照組用陽性對照物代替受試物，陰性（溶劑）對照組用受試物溶劑代替受試物。6.8.6.5人胚肺成纖維細胞(2BS）放射自顯影法操作程序6.8.6.5.1將細胞增殖至所需數(shù)量后，用完全培養(yǎng)液制成單細胞懸液，濃度為0.5×105個/mL~1.0×105個/mL。將細胞懸液接種至有小蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板中，在36℃±1℃二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1d~3d,至細胞50%融合。每一劑量組和各對照組分別作2個~3個平行樣本。6.8.6.5.3在試驗的前一日下午，加入羥基脲(HU)貯備液使HU的終末濃度為10mmol/L。繼續(xù)在36℃±1℃下培養(yǎng)16h,然后將上述長有細胞的蓋片置于含有不同濃度的受試物、HU(10mmol/L)胸腺嘧啶核苷(6.8.6.5.4陽性及陰性對照組的操作程序同實驗組，只是陽性對照組用陽性對照物代替受試物，陰性（溶劑）對照組用受試物溶劑代替受試物。6.8.6.5.5處理結(jié)束后，用Hanks液洗滌3次，再用1%枸椽酸鈉溶液處理10min。將小蓋玻片用甲GB／T38496—2020醇-冰醋酸固定液固定30min,重復(fù)2次。干燥過夜，將有細胞的蓋玻片用少量中性樹膠，粘固于載玻片上，長有細胞的一面朝上。6.8.6.5.6在暗室中，將適量的NTB-2乳膠（或核-融化，再加入等量40℃蒸餾水，繼續(xù)在水浴中加溫，用玻璃棒輕輕攪拌10min~20min,使氣泡逸出。同時將準(zhǔn)備做自顯影處理的載玻片，置水浴箱平臺上預(yù)熱。而后，將附有樣本的載玻片垂直浸漬于乳膠液中約5s。提出玻片，拭去其背面乳膠并待其干固。6.8.6.5.7將干固的附有樣本的載玻片置于有變色硅膠干燥劑袋的曝光盒中，盒外包黑色避光紙，于4℃冰箱中曝光10d。曝光后，將玻片在D-19顯影液中顯影4min,在停顯液中漂洗30s,在F-5定影液中定影10min,再用水漂洗數(shù)小時。6.8.6.5.8細胞在顯影后用姬姆薩染液染色，脫水透明后，用蓋片封固。在油鏡下，計數(shù)各樣本細胞核的顯影銀粒數(shù)，每個樣本計數(shù)100個細胞，同時計數(shù)相當(dāng)面積的本底銀粒數(shù)，兩者之差為細胞核凈銀粒數(shù)。計算各實驗組和對照組“銀粒數(shù)／核”的均值及其標(biāo)準(zhǔn)差。用t檢驗或其他適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)檢驗方法處理，當(dāng)各試驗劑量組“銀粒數(shù)／核”均值比陰性（溶劑）對照組者升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系時；或僅一個劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義的升高，但經(jīng)重復(fù)試驗證實者，可判為該受試物誘導(dǎo)了DNA修復(fù)合成，具有DNA損傷作用。6.8.7小鼠精原細胞染色體畸變試驗利用細胞遺傳學(xué)方法，以哺乳動物體內(nèi)試驗檢測受試物引起的生殖細胞染色體損傷。6.8.7.2.1受試物：用水、植物油配成溶液，或用0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液。見姬姆薩染液見選用3月齡~4月齡，體重25g~30g的雄性小鼠。動物總數(shù)不少于25只。受試物至少設(shè)3個試驗劑量組，每個劑量組5只動物。另設(shè)陽性對照組和陰性（溶劑）對照組。陽性對照組用環(huán)磷酰胺(40mg/kg體重）或絲裂霉素C(1.5mg/kg體重~2mg/kg體重腹腔注射。6.8.7.5.1用經(jīng)口灌胃方式，共染毒兩次，間隔24h。于第二次染毒后6h處死動物。處死動物前腹腔注射秋水仙素溶液劑量為體重。6.8.7.5.2用頸椎脫臼法處死小鼠，取睪丸，去除脂肪。置含2.2%枸櫞酸三鈉溶液平皿中去除睪丸被膜，用針頭使曲精小管松散。一個動物的2個睪丸可分別或合并處理。GB／T38496—2020低滲液(枸櫞低滲結(jié)束后去除低滲液。加入預(yù)冷的固定液（甲醇-冰醋酸固定10min后，更換固定液，再第3次固定至少30也可在冰箱中過夜。用鑷子將已固定的曲精小管移到含醋加至離心所得細胞沉淀物中。滴管吹打后，滴2滴至用乙醇浸濕的玻片，分散后，熱風(fēng)干燥。自來水淋洗兩次。6.8.7.5.6以油鏡檢查染色體結(jié)構(gòu)的異常情況。每只動物做兩個睪丸，每個睪丸分析50個中期分裂相精原細胞。記錄觀察染色體型和染色單體型染色體的結(jié)構(gòu)異常。檢查染色體數(shù)目異常時，記錄非整倍體和多倍體。用χ2檢驗或其他適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)檢驗方法對所得試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。當(dāng)各劑量組與陰性（溶劑）對照組相比，畸變細胞率升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系時；或僅一個劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義的升高，經(jīng)重復(fù)試驗證實后，可判為該受試物對哺乳動物睪丸細胞具有致突變性。6.9亞慢性毒性試驗6.9.1.1檢測消毒劑較長期染毒對實驗動物的毒性作用及其靶器官，并確定其最大未觀察到有害作用劑量。6.9.1.2為慢性毒性和致癌試驗的劑量設(shè)計提供依據(jù)。一般用嚙齒類動物，首選大鼠。所用大鼠應(yīng)為4周齡~6周齡者。全部試驗至少用80只動物。將實驗動物隨機分為4組(3個劑量組和1個對照組每組20只動物，雌雄各半。選擇受試物劑量時，高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)，但不引起死亡，如果出現(xiàn)動物死亡應(yīng)不超過中間劑量組應(yīng)可觀察到輕微的毒性效應(yīng)；低劑量組應(yīng)不引起任何毒性效應(yīng)（屬未觀察到有害作用劑量）。至于具體的劑量選擇，可考慮高劑量為LD50的1/20~1/5,高、中、低3個劑量間的組距以3倍~5倍為宜，最低不小于2倍。另以受試物溶劑代替受試物進行試驗，作為陰性對照組。6.9.4.1采用灌胃方式或?qū)⑹茉囄飺饺腼暳辖?jīng)口染毒。6.9.4.2灌胃法每天灌胃一次，每周稱體重，并按體重調(diào)整受試物給予量。如受試物摻入飼料時，應(yīng)定期稱飼料消耗量，計算消毒劑攝入量。h處死實驗動物，檢測各項觀察指標(biāo)。6.9.5.1臨床觀察：觀察動物中毒表現(xiàn)，每周稱量體重一次，食物消耗量至少1次~2次。6.9.5.2血液學(xué)檢查：包括血紅蛋白含量、紅細胞數(shù)、白細胞及其分類計數(shù)、血小板數(shù)、網(wǎng)織紅細胞數(shù)等。GB／T38496—20206.9.5.3血液生物化學(xué)檢查：例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、尿素氮、肌酐、血清總蛋白和白蛋白、總膽固醇、總膽紅素等。必要時，可根據(jù)所觀察到的受試物毒性效應(yīng)，或與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的毒性作用，選擇其他一些生化指標(biāo)?！?00%)。6.9.5.5病理學(xué)檢查：實驗結(jié)束時，處死所有動物，進行系統(tǒng)解剖和肉眼觀察，并將主要器官和組織（如組動物尸檢未發(fā)現(xiàn)明顯病變時，先進行高劑量組和陰性對照組動物肝、腎、胃、腸及其他重要的和可能受損的臟器的組織病理學(xué)檢查。如發(fā)現(xiàn)病變，還應(yīng)對中、低劑量組動物相應(yīng)的器官進行組織病理學(xué)檢查。將各實驗組動物觀察指標(biāo)與陰性對照組加以比較并進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，注意各劑量組間的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系。評定受試物最小觀察到有害作用劑量和最大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。6.10致畸胎試驗檢測消毒劑對妊娠實驗動物有無致畸胎性，確定其未觀察到發(fā)育毒性的劑量。茜素紅溶液茜素紅氫氧化鉀加蒸餾水透明液甘油氫氧化鉀蒸餾水6.10.2.3透明液B：甘油與蒸餾水等量混合。試驗用大鼠或小鼠（必要時可用家兔）。用大鼠和小鼠試驗時，取健康、性成熟、未交配過的體重為的大鼠或體重為的小鼠至少設(shè)4組，其中3個為實驗組，1個為陰性對照組。每組至少有15只孕鼠。高劑量組可用雌鼠的1/10LD50作為試驗劑量；低劑量組，可用雌性動物的1/100LD50作為試驗劑量。其間設(shè)中劑量組。陰性對照組以受試物的溶劑代替受試物進行試驗。陽性對照組常用阿司匹林(270mg/kg體重~280mg/kg體重）、敵枯雙(1mg/kg體重）或維生素A(40000IU)。對于實驗室首次進行的動物品種或品系應(yīng)設(shè)陽性對照組。為了保證試驗方法的可靠性，每隔半年應(yīng)用陽性對照物檢查一次?；蚓拥漠?dāng)天定為孕期零天。如5d內(nèi)未交配，調(diào)換雌鼠。查出的孕鼠按上述隨機分組，并進行稱重和編號。20d稱重孕鼠，并根據(jù)體重調(diào)整受試物給予量。注意觀察并記錄孕鼠的毒性反應(yīng)。GB／T38496—20206.10.5.3大鼠于孕期第20天，小鼠于孕期第18天，用頸椎脫臼法處死。剖腹，取出子宮稱重，檢查活胎、吸收胎、早期死胎和晚期死胎數(shù)。6.10.5.4逐個記錄活胎鼠的性別、體重、身長和尾長。外觀檢查頭面部、軀干部、四肢等有無畸形，諸如門閉鎖等。6.10.5.5每窩取約1／2~2／3活胎鼠，用眼科鑷剝皮。取出內(nèi)臟（注意勿拉斷肋骨去掉后頸和兩肩胛骨之間的脂肪塊。將胎鼠放入茜素紅溶液染色。當(dāng)天搖動玻璃瓶2次~3次。待骨骼染成紅色時為待胎鼠骨骼已染紅，而軟組織的紫紅色基本褪去，可換置甘油中。6.10.5.6將染好的標(biāo)本連同甘油一并倒入含水平皿內(nèi)，在解剖顯微鏡下，用透射光源，先觀察胎鼠全身，然后逐步檢查：a）頭骨、胸骨、脊椎骨、肋骨和四肢等有無骨化不全、骨化遲緩和其他缺陷；c）觀察胸骨的發(fā)育和數(shù)目，有無胸骨缺失等；e）最后檢查四肢骨畸形。6.10.5.7每窩取約1／3~1／2活胎鼠浸入固定液2周，作內(nèi)臟檢查。將已固定的胎鼠用水沖凈，仰放于石蠟板上。剪去四肢和尾，用刀片在頭頸部常規(guī)共切4刀，再用剪刀剖開胸、腹腔。著重檢查：b）是否出現(xiàn)右位心、心臟過大、肺過大或過小等畸形；c）消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)各器官的大小、形狀以及位置；d）有無腎盂積水，雙側(cè)有無睪丸，以及子宮發(fā)育不全等畸形。6.10.6.1主要觀察動物畸胎出現(xiàn)率，同時觀察其他指標(biāo)，如著床數(shù)、活胎數(shù)、晚期死胎數(shù)、早期死亡數(shù)，以及活胎體重、身長、尾長等。6.10.6.2觀察全部結(jié)果的劑量-反應(yīng)關(guān)系，確定受試物的母體毒性、發(fā)育毒性及致畸性。求出受試物的最小致畸劑量和最大無致畸作用劑量。對致畸強度應(yīng)以致畸指數(shù)表示。式中：TI—致畸指數(shù)；TDmin—最小致畸劑量。致畸指數(shù)小于或等于10為基本不致畸；10~100為致畸；大于100為強致畸。檢測受試物長期染毒對實驗動物所產(chǎn)生的毒性作用，確定其最小觀察到有害作用劑量，最大未觀察到有害作用劑量及毒性作用的靶器官。GB／T38496—2020試驗選用剛離乳的大鼠。在試驗結(jié)束時，每個劑量組每種性別的動物應(yīng)不少于10只。中間需要活殺動物檢查時，應(yīng)相應(yīng)增加實驗動物數(shù)量。將實驗動物隨機分在3個劑量組和1個陰性對照組。陰性對照組除不接觸消毒劑外，其他與實驗組相同，若在試驗中對受試物使用溶劑或賦形劑時，陰性對照組應(yīng)給予相應(yīng)劑量的溶劑或賦形劑。試驗劑量根據(jù)亞慢性試驗結(jié)果選擇。高劑量應(yīng)引起明顯的毒