GB-T 39914-2021 主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè) 玉米

主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測(cè)玉米國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 1 1 13.2縮略語 2 2 2 2 35.3檢測(cè)平臺(tái) 3 35.5檢測(cè)條件 46儀器設(shè)備、試劑和溶液配制 46.1儀器設(shè)備 4 56.3溶液配制 5 57.1引物合成 5 8 8 97.5數(shù)據(jù)分析 8品種純度檢測(cè)程序 8.2引物篩選和合成 8.4擴(kuò)增產(chǎn)物分離 8.5數(shù)據(jù)分析 9結(jié)果計(jì)算與表示 9.1真實(shí)性鑒定 9.2純度測(cè)定 10結(jié)果報(bào)告 ⅡGB/T39914—2021 附錄A(規(guī)范性附錄)溶液配制 附錄B(資料性附錄)等位基因擴(kuò)增片段信息 表1真實(shí)性鑒定引物 表2PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 表3純度測(cè)定候選引物 表B.1已知品種主要等位基因擴(kuò)增片段信息 Ⅲ1GB/T3543.1農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程總則GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格品種真實(shí)性驗(yàn)證varietyve2一條互補(bǔ)結(jié)合在模板DNA鏈上的短單鏈，能提供3'-OH末端作為DNA合成的起始點(diǎn)，延伸合能夠組合在一起電泳的，具有不同顏色或相同顏色而擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小不同的熒光標(biāo)記的一組CTAB:cetyltrimethylammoniumbrodNTPs:deoxyribonucleSDS:sodiumdodecylsu玉米的不同品種，其基因組存在著能夠世代穩(wěn)定遺傳的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)345編號(hào)引物名稱引物序列(5′—3)熒光6編號(hào)引物名稱染色體引物序列(5'—3)熒光反向：GGAACTGAAGAACAGAA反向：GGCCATGATACAGCAAG反向：GTTTCCTATGGTACAG7表1(續(xù))編號(hào)引物名稱染色體引物序列(5′—3)熒光正向：TGATAGGTAGTTAGCA反向：GAGCATAGAAAAAGTTGAGGT正向：CACTCTCCCTCTAAAA反向：CTGTGCTCGTGCTTCT反向：TGCACAGAATAAACATAGG反向：CTTCGTACCATCTTCCC8原濃度10×緩沖液29表2(續(xù))原濃度2Taq酶引物2#每一種類的濃度。7.4.2.3.1在電泳正極槽(下槽)加入1×TBE緩沖液600mL,負(fù)極槽(上槽)加入經(jīng)65℃預(yù)熱的1×TBE緩沖液600mL,拔出樣品梳，7.4.2.3.2電泳的適宜時(shí)間，參考二甲苯青指示帶移動(dòng)的位置和擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段大小范圍(參見表B.1)加以確定。二甲苯青指示帶在4.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所移動(dòng)的位置與150bp擴(kuò)增入顯影液中，輕輕晃動(dòng)待條帶清晰后取出，再迅速放入固定液中定影5min取出，在雙蒸水中漂洗a)對(duì)于連帶(pull-up)峰，即因某一位置某一顏色熒光的峰值較高而引起同一位置其他顏色熒光7.5.1.4采用混合樣檢測(cè)，選擇少量的對(duì)照),校準(zhǔn)不同電泳板間的數(shù)據(jù)偏差后再讀取擴(kuò)增片段大小。甄別后純合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/X,雜合位點(diǎn)數(shù)據(jù)記錄為X/Y(其中X、Y分別為該位點(diǎn)兩個(gè)等位基因擴(kuò)增片a)讀取擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小數(shù)據(jù)的，檢測(cè)樣品與參照樣品(附錄B)同時(shí)在同一電泳板上電泳；8.1DNA提取8.2引物篩選和合成——對(duì)于鑒定自交個(gè)體，識(shí)別特征為該等位基因具有母本而父本缺失，篩選1對(duì)能檢測(cè)雜合位點(diǎn)——對(duì)于鑒定異交個(gè)體，識(shí)別特征為該等位基因具有母本而父本錯(cuò)誤，在具備父母本對(duì)照或其8.2.2本標(biāo)準(zhǔn)推薦了8對(duì)品種純度測(cè)定引物(見表3),作為優(yōu)先篩選的候選引物。篩選時(shí)，可用至少含20粒的小樣品進(jìn)行試驗(yàn)，依據(jù)5.2.2的要求，確定適宜的引物或引物組合。效果的，可選擇表1另外32對(duì)引物或其他引物進(jìn)行篩選。編號(hào)引物名稱染色體引物序列(5′—3)范圍/bp雜合度反向：GGAACTGAAGAACAGAA檢測(cè)結(jié)果用檢測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品比較的位點(diǎn)差異數(shù)目表示，檢測(cè)結(jié)果的容許差距不能大于2個(gè)等b)通過對(duì)引物，采用通過對(duì)引物，采用電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)與DNA指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)篩查并鑒定，檢測(cè)樣品屬于XXX品種，或者屬于XXX、XXXX其中的一個(gè)。10.1.4屬于下列情形之一的，需在檢驗(yàn)報(bào)告中注明：-—送驗(yàn)樣品低于5.4.1.1規(guī)定數(shù)量的； 與DNA指紋數(shù)據(jù)比對(duì)平臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)的：——檢測(cè)樣品遺傳不穩(wěn)定嚴(yán)重的位點(diǎn)(引物編號(hào))清單；——檢測(cè)采用了其他SSR引物的名稱及序列。10.2.1按照GB/T3543.1的檢驗(yàn)報(bào)告要求，可以選擇下列方式之一進(jìn)行品種純度檢測(cè)結(jié)果的填報(bào)：a)通過編號(hào)為的引物，檢測(cè)了個(gè)個(gè)體，采用電泳方法，檢測(cè)出自交個(gè)b)通過編號(hào)為的引物，檢測(cè)了個(gè)個(gè)體，采用電泳方法，檢測(cè)出自交個(gè)體和其他類型雜株個(gè)體個(gè)，品種純度為%。10.2.2屬于下列情形之一的，需在檢驗(yàn)報(bào)告中注明：——送驗(yàn)樣品低于5.4.2.1規(guī)定數(shù)量的；——異常個(gè)體僅檢測(cè)自交個(gè)體的；——檢測(cè)樣品因遺傳不穩(wěn)定嚴(yán)重的位點(diǎn)(引物編號(hào))清單；—-—檢測(cè)采用了其他SSR引物的名稱及序列。Na?EDTA·2H?O186.1g溶于800mL水中，加固體NaOH調(diào)pH至8.0,加水定容至1000mL,濃鹽酸(36%～38%)25mL,加水定容至500mL。A.1.4CTAB提取液至1000mL,4℃貯存。A.1.7TE緩沖液1A.1.8TE緩沖液2用TE緩沖液1分別配制正向引物、反向引物終濃度均為40μmol/L的儲(chǔ)存液，等體積混合成A.3.140%PAGE膠尿素450g、10×TBE緩沖液100mL和40%PAGE膠112.5mL,加水定容至1000mL。2%二甲基二氯硅烷。0.25g過硫酸銨溶于1mL超純水中。10×TBE緩沖液500mL,加水定容至5000mL。50×TAE緩沖液100mL,加水定容至5000mL。A.4銀染硝酸銀2g,加水定容至1000mL。固體NaOH30g和甲醛5mL,表B.1列出了40對(duì)引物在已知玉米品種中擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度范圍、主要等位基因擴(kuò)增片段大小與頻引物參照樣品綿單1號(hào)鄭單958農(nóng)華101遼單527先玉335鄭單958蠡玉16綿單1號(hào)京玉7號(hào)鄭單958引物參照樣品正大619鄭單958先玉335鄭單958蠡玉16屯玉27正大619奧玉28正大619中科4號(hào)鄭單958先玉335鄭單958奧玉28京科968引物參照樣品鄭單958中科4號(hào)農(nóng)華101綿單1號(hào)萬糯1號(hào)先玉335鄭單958萬糯1號(hào)鄭單958奧玉28正大619鄭單958鄭單958正大619正大619蠡玉16蠡玉16鄭單958鄭單958農(nóng)華101蠡玉6號(hào)農(nóng)華101引物參照樣品萬糯1號(hào)鄭單958鄭單958中科4號(hào)京科甜126先玉335中科4號(hào)鄭單958鄭單958正大619綿單1號(hào)農(nóng)華101先玉335中科10農(nóng)華101鄭單958遼單527先玉335引物參照樣品鄭單958資玉3號(hào)先玉335鄭單958正大619農(nóng)華101鄭單958中科4號(hào)先玉335鄭單958先玉335鄭單958引物參照樣品先玉335鄭單958鄭單958鄭單958正大619鄭單958鄭單958中科4號(hào)先玉335鄭單958農(nóng)華101鄭單958先玉335鄭單958正大619農(nóng)華101農(nóng)華101農(nóng)華101鄭單958鄭單958奧玉28表B.1(續(xù))引物參照樣品先玉335先玉335先玉335先玉335中科4號(hào)鄭單958鄭單958中科10蠡玉6號(hào)先玉335蠡玉16農(nóng)華101先玉335先玉335鄭單958鄭單958引物參照樣品鄭單958鄭單958先玉335正大619農(nóng)華101遼單527農(nóng)華101先玉335先玉335遼單527鄭單958先玉335中科4號(hào)先玉335鄭青貯1號(hào)鄭單958鄭單958農(nóng)華101中科4號(hào)中科4號(hào)引物參照樣品先玉335鄭單958鄭單958先玉335鄭單958鄭單95