臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和體外診斷系統(tǒng) 感染性疾病相關(guān)酵母樣真菌抗微生物藥物的體外活性檢測(cè)肉湯微量稀釋參考方法 征求意見(jiàn)稿

本文件描述了檢測(cè)酵母樣真菌抗真菌藥物的敏感性的方法，包括引起感染的念珠菌屬和新型隱球菌。這里描述的參考方法尚未用于雙相型真菌的酵母相菌研究，如皮炎芽生菌和/或莢膜組織胞漿菌莢法)[1][5];第二種途徑通過(guò)光度法確定MIC(EUCAST方法)[2][10]。MIC反活性，并在考慮到其它因素下可對(duì)臨床管理目的進(jìn)行解釋，如藥物的藥理學(xué)或抗真菌耐藥機(jī)制。另外方法和EUCAST衍生方法的解釋性分類折點(diǎn)可查詢相應(yīng)機(jī)構(gòu)提供的最新解釋表[5][15]。推薦常規(guī)敏感性試驗(yàn)方法或診斷檢驗(yàn)器械與此參考方法進(jìn)行比較，以保證驗(yàn)證或注冊(cè)ISO和IEC維護(hù)的用于標(biāo)準(zhǔn)化工作的術(shù)語(yǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)—ISO在線瀏覽平臺(tái)：指受試物活性部分所占比例，通過(guò)生物分析方法與相同物質(zhì)的參考品比注：效價(jià)可表達(dá)為受試物中組分以毫克每克（mg/g）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、或以國(guó)際單位每克（IU/g）的活性含量、或以體積分?jǐn)?shù)或質(zhì)量分?jǐn)?shù)的百分含量或摩爾數(shù)每升2最低抑菌濃度minimuminhibitory參考菌株referencestrains有特定分類編號(hào)，具有穩(wěn)定、確定的抗真菌藥物敏感性表型和/或基因型的特征明確的真菌注：參考菌株是從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得并用于質(zhì)量控制，其通常以貯是一種容器中加入適當(dāng)體積抗真菌（3.1）溶液，該抗真增加，再加入適當(dāng)體積的含一定接種量（3.9）菌液肉湯（3注：接種量以每毫升的菌落形成單位（CFU/3抗真菌藥物相比會(huì)導(dǎo)致MIC升高。這種處理可能會(huì)影響這些藥物的微量稀釋板并通過(guò)光度計(jì)讀數(shù)的實(shí)驗(yàn)室宜確保測(cè)試使用處理過(guò)的稀釋板給出與表5中所示相同的質(zhì)量使用處理過(guò)的稀釋板[2]通過(guò)肉眼判讀方法[5]提供的結(jié)果和光度判讀法兩種測(cè)試方法用于臨床分離株比4的保存條件，否則受試物應(yīng)保存于密閉容器中，避光、-20℃、使用干燥劑。易吸濕的試劑宜分裝成小價(jià)，通過(guò)公式（1）和公式（2）計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)液品宜通過(guò)分析進(jìn)行比較以確?？拐婢幬飿悠吩诔^(guò)程中未發(fā)生吸附損除非原液有在規(guī)定貯存條件下的穩(wěn)定性信息5(最高濃度和中間溶液)兩性霉素B(AmphotericinB)培養(yǎng)基阿尼芬凈(Anidulafungin)培養(yǎng)基卡泊芬凈(Caspofungin)培養(yǎng)基氟胞嘧啶(Flucytosine)培養(yǎng)基氟康唑(Fluconazole)培養(yǎng)基培養(yǎng)基伊曲康唑(Itraconazole)培養(yǎng)基酮康唑(Ketoconazole)培養(yǎng)基米卡芬凈(Micafungin)培養(yǎng)基泊沙康唑(Posaconazole)培養(yǎng)基里氟康唑(Ravuconazole)培養(yǎng)基（Rezafungin）培養(yǎng)基伏立康唑(Voriconazole)培養(yǎng)基考菌株來(lái)說(shuō)，應(yīng)能夠確定所有可能得出的終點(diǎn)MIC值。倍比稀釋系列以1mg/L為中心濃度，用RPMI-1640葡萄糖肉湯配制。宜遵從表2和表物溶液有來(lái)自廠家在指定貯存條件下的穩(wěn)定性信息，所有工作液均應(yīng)當(dāng)天配制當(dāng)天使用。6步驟源+==1726354458364272181095步驟源+==142332415067897每個(gè)測(cè)試菌株還宜設(shè)置一個(gè)只加入200μl無(wú)抗真菌藥物培養(yǎng)基作為未接種充裝好的微量稀釋板可以立即使用，也可以放在密封塑料袋中迅速冷凍貯存(CLSI法，肉眼判讀:4.6.1概述每個(gè)分離菌株都宜轉(zhuǎn)種到非抑制性瓊脂培養(yǎng)基以確保純度8用渦旋混合器混合已調(diào)整好的酵母菌懸液，用滅菌蒸餾水1:10稀釋，得到兩倍濃度測(cè)試接種量應(yīng)定期對(duì)微量稀釋板的陽(yáng)性對(duì)照孔進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，以確保脂平板（如沙保弱葡萄糖瓊脂）表面35±2℃)孵育24h后，進(jìn)行菌計(jì)數(shù)，可接受菌懸液菌落數(shù)量應(yīng)該在5～125之間。對(duì)于多數(shù)抗真菌藥物-酵母菌組合，微量稀釋板在(35±2)℃的大氣環(huán)境中孵育（24±2）h。某些新在24h孵育后可以讀數(shù)。這些信息的更新見(jiàn)CLSI文件M60ED29種的或陰性生長(zhǎng)對(duì)照孔（如有）沒(méi)有生長(zhǎng)、接種菌液純度已確立，才可進(jìn)行結(jié)果判某些抗真菌藥和某些分離株，可能發(fā)生拖尾生長(zhǎng)（在抗真菌藥物濃度一定范圍內(nèi)出現(xiàn)部分生長(zhǎng)抑由于此原因，24h讀數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)的，生長(zhǎng)較慢的新型隱球?qū)τ谌庋叟卸∕IC，宜使用反光鏡讀取裝置從底部一面檢查微量板的各孔。可以證實(shí)讀取終點(diǎn)前輕輕搖動(dòng)微量板中的生長(zhǎng)物有所幫助。對(duì)于氟胞嘧啶、唑類藥物、棘白菌素類藥物，將孔中生性生長(zhǎng)對(duì)照比較，MIC記錄為該藥物相比于對(duì)照顯著抑制（至少50%）生長(zhǎng)的最低濃度。對(duì)于兩性霉取。培養(yǎng)基對(duì)照孔的背景讀數(shù)宜從其他各孔讀數(shù)中減掉。對(duì)于氟胞嘧啶、唑類藥物、棘白菌素類藥物，MIC記錄為該藥物相比于對(duì)照顯著抑制（至少50%）生長(zhǎng)的最低濃度。對(duì)于兩性霉素B，MIC是相本文件任何一種途徑給出MIC結(jié)果的臨床解釋宜依度法讀取確定的MIC解釋宜使用來(lái)自EUCAST最新指南[17]試驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量通過(guò)伴隨使用的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株（見(jiàn)表4和表5）來(lái)監(jiān)測(cè)。貯存質(zhì)控菌株宜凍干或在-60℃或低于-60℃冷凍保存。質(zhì)控菌株的使用未經(jīng)處理的稀釋板和處理過(guò)的稀釋板的質(zhì)量控制范圍已顯示為相似，對(duì)近平滑念珠菌ATCC?22019和克柔念珠菌ATCC?6258這兩株已用于所有國(guó)際質(zhì)量控范圍。這些范圍與肉眼判讀產(chǎn)生的范圍相似，但往往比目測(cè)低一個(gè)log2稀釋度。使用經(jīng)處理的稀在世界某些地區(qū)，某些抗真菌藥物-酵母霉菌屬使用了額外的質(zhì)量控制菌株（例如參考文獻(xiàn)[2]和近平滑念珠菌（Rezafungin）4.0-16（Rezafungin）讀（卡泊芬凈）的質(zhì)量控制范圍根據(jù)獨(dú)立的多實(shí)驗(yàn)室按A.1概述拌,邊用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）調(diào)節(jié)pH到7.0（25℃)。添加葡萄糖（取決于判讀方法）。加蒸餾L-天冬酰胺（無(wú)水）L-天冬氨酸L-胱氨酸·2HClL-谷氨酸L-谷氨酰胺甘氨酸L-組氨酸（游離堿）L-羥脯氨酸L-異亮氨酸L-亮氨酸L-賴氨酸·HClL-甲硫氨酸L-苯丙氨酸L-脯氨酸L-絲氨酸L-蘇氨酸L-色氨酸L-酪氨酸·2NaL-纈氨酸生物素D-泛酸氯化膽堿肌醇煙酰胺PABA(對(duì)氨基苯甲酸)鹽酸吡哆辛核黃素鹽酸硫胺氯化鉀硫酸鎂(無(wú)水)氯化鈉磷酸氫二鈉(無(wú)水)葡萄糖還原型谷胱甘肽酚紅鈉（含谷氨酰胺和酚紅，但不含碳酸氫鹽）用戶宜檢查供應(yīng)商提供的RPMI成分的濃度如上表所述。表A.2含0.2%葡萄糖和含2%葡萄糖RPMI-1640培養(yǎng)基成分（完整培養(yǎng)基）[2][5]2×濃度RPMI-1640aMOPSbb3-(N-嗎啡啉)丙磺酸，0.165mol/L終濃度。a)通過(guò)加0.5ml0.048mol/LBaCl2(1.175%w/vBaCl2×2H2O)到99.5ml0.18mol/LH2SO4(體積分?jǐn)?shù)b)用分光光度計(jì)用1cm光徑和匹配的比色杯測(cè)定濁度標(biāo)準(zhǔn)吸光度來(lái)驗(yàn)證其光密度正確性。0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)在625nm吸光度宜在0.08~c)分裝4mL~6mL到用于生長(zhǎng)或稀釋肉湯培養(yǎng)接種物的相同規(guī)格螺口管中。e)臨用前在機(jī)械渦旋混合器上強(qiáng)力搖勻此濁[1]CLSIM27-A3,ReferenceMethodforBrothDilutionAntifuconcentrationsofantifungalagentsstandardmethodssetforthbyFungiUsingtheMethodsofEuropeanCommitteeonAntimicrobialHydrophilicandHydrop[7]Arthington-SkaggsBresultsandinvcandidiasis.Antimicrob.AgentsChemother.2000,44pp.2081-2085(AFST)oftheESCMIDEuropeanCommitteedilutionminimuminhibitoryconcent