血站核酸檢測

關于血站核酸檢測血站核酸檢測的意義核酸檢測（NAT）可以有效地縮短病毒特異抗原和抗體免疫測定的“窗口期”，從而減少輸血風險，提高輸血安全。第2頁,共62頁，星期六，2024年，5月乙型肝炎病毒（HBV）感染檢測中，NAT除可縮短HBV感染檢測的窗口期外，還可以減少HBV急性感染恢復期、慢性隱匿性HBV感染以及變異病毒株感染的漏檢。丙型肝炎病毒（HCV）感染檢測中，可將HCV感染檢測的窗口期縮短，減少免疫靜默感染的漏檢。人類免疫缺陷病毒（HIV）感染檢測中，可將HIV感染檢測的窗口期縮短。第3頁,共62頁，星期六，2024年，5月檢測窗口期WindowPeriod第4頁,共62頁，星期六，2024年，5月第5頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸研究的歷史

1869米舍爾（FriedrichMiescher）從膿球分離出細胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為“核素”(nuclein)。1944美國微生物學家埃弗里（O.T.Avery）等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1953沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA雙螺旋FrancisCrick

第6頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸研究的歷史

1960年代中期桑格(Sanger)的DNA測序法1972伯格(PaulBerg)–重組DNA技術引起人腫瘤的猴病毒基因與噬菌體lambda的重組1973博耶（HerbertBoyer）和科恩（StanleyCohen）-使用重組DNA技術首次得到了重組DNA微生物(基因工程技術)1983穆利斯（KaryMullis)–PCR技術第7頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸的種類DEOXYRIBONUCLEICACID（DNA）RIBONUCLEICACID（RNA）——ribosomeRNA(rRNA)transferRNA(tRNA)messengerRNA(mRNA)第8頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸的分子組成

元素組成CHONP（恒定，9~10%）基本結(jié)構單位——核苷酸磷酸核苷（戊糖、堿基）第9頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸的理化性質(zhì)核酸分子具有強烈的紫外吸收DNA變性是雙鏈解離為單鏈的過程DNA的增色效應Tm值變性的核酸可以復性或形成雜交雙鏈復性退火第10頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸分子復性和雜交示意圖第11頁,共62頁，星期六，2024年，5月第12頁,共62頁，星期六，2024年，5月磁珠提取的原理：第一步：細胞的裂解：破碎細胞，并向溶液中加入磁珠第二步：結(jié)合核酸：pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復多次）第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來第13頁,共62頁，星期六，2024年，5月第14頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸檢測基本原理核酸檢測：一系列直接檢測病原體核酸的技術的總稱，對靶核酸直接擴增或?qū)ζ涓綆У男盘枖U增，使看不見的極微量的核酸變成直觀的光電或可視信號。第15頁,共62頁，星期六，2024年，5月NAT檢測技術方法PCR擴增技術轉(zhuǎn)錄介導的擴增方法（TMA、NASBA）其它NAT技術（bDNA、LAMP、LCR、SDA等）第16頁,共62頁，星期六，2024年，5月PCR原理DNADNA第17頁,共62頁，星期六，2024年，5月TMA的原理Transcription-MediatedAmplification轉(zhuǎn)錄介導的擴增技術模擬DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的自然過程DNA模板在反應中作為中介利用2個引物和2種酶(RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶）RNA聚合酶與DNA模板的啟動子序列結(jié)合等溫擴增（41.5℃）轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄第18頁,共62頁，星期六，2024年，5月TMA的原理特異性靶標捕獲特異性捕獲探針與病毒核酸分子及內(nèi)標物雜交結(jié)合，并將其固定在磁珠表面。對體系進行重復的洗滌，去除血液樣品中除病毒核酸外的其他成分。轉(zhuǎn)錄介導的擴增借助逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA多聚酶的共同作用，在等溫條件下，經(jīng)過一小時的擴增得到約10億個目標產(chǎn)物片斷。雙動力學化學發(fā)光檢測試劑消除未結(jié)合的檢測探針，雙動力學化學發(fā)光檢測，分別檢測內(nèi)標與病毒分子信號。第19頁,共62頁，星期六，2024年，5月第20頁,共62頁，星期六，2024年，5月理想的核酸擴增實驗室設計A第21頁,共62頁，星期六，2024年，5月理想的核酸擴增實驗室設計B第22頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸擴增檢測實驗室設計的一般原則各區(qū)獨立注意風向因地制宜方便工作第23頁,共62頁，星期六，2024年，5月關于“區(qū)域”合并如使用擴增和產(chǎn)物分析同時完成的實時熒光PCR儀進行核酸擴增檢測，擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可以合并。如使用核酸提取、擴增及產(chǎn)物分析等均在一臺儀器上完成的全自動核酸檢測分析儀，標本制備區(qū)、擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。第24頁,共62頁，星期六，2024年，5月符合基本要求的核酸擴增檢測實驗室的條件（1）試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)和擴增及產(chǎn)物分析區(qū)等三個或四個區(qū)域在物理空間上，必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論是在空間還是在使用中，應始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。（2）各區(qū)的可移動的儀器設備及各種物品包括實驗記錄本、記號筆、試管架及清潔用具等必須專用。（3）應在標本制備區(qū)、擴增及產(chǎn)物分析區(qū)等相對有可能出現(xiàn)“污染物”的區(qū)域安裝排風扇或其它排風和有效的裝置，以使空氣按試劑準備區(qū)標本制備區(qū)擴增（及產(chǎn)物分析）區(qū)方向流動。第25頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸擴增實驗室的工作流程試劑準備區(qū)

標本制備區(qū)擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)第26頁,共62頁，星期六，2024年，5月試劑貯存準備區(qū)

核酸擴增實驗室中最為“潔凈”的區(qū)域，不應有任何核酸的存在，包括試劑中所帶的標準品和陽性對照。所有實驗用潔凈物品如離心管、吸頭等的存放和準備處。商品試劑盒自制試劑：一次較大量配制，然后分裝成小瓶保存，每次檢測時，取出一小瓶使用，未用完的即棄掉，不再使用。儀器設備主要有加樣器、天平、離心機和冰箱等，最好配備超凈工作臺。第27頁,共62頁，星期六，2024年，5月標本制備區(qū)

儀器設備主要有混樣設備、核酸提取儀、生物安全柜、加樣器、高速臺式（冷凍）離心機、加熱模塊或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不應放在實驗室門口等易受人員走動影響的地方，也不應直對分體式空調(diào)。主要是用于血液樣本的混樣、核酸樣本的提取。加樣器吸頭必須帶濾芯。使用加熱模塊時，如在模塊孔中填入二氧化硅細砂，然后將標本管置于細砂中溫育，可得到較為一致的溫育溫度。第28頁,共62頁，星期六，2024年，5月擴增及產(chǎn)物分析區(qū)

擴增反應體系的配制和提取核酸的加入，可在標本制備區(qū)也可在本區(qū)內(nèi)進行，關鍵是要防止產(chǎn)物的污染。如果空間允許的話，也可在一個獨立的區(qū)域內(nèi)進行。加樣時，先加提取的核酸模板樣本，每加完一個即蓋好蓋子，然后加陽性質(zhì)控核酸模板，再就是標本制備陰性質(zhì)控和僅含按樣本一樣稀釋的主反應混合液的擴增陰性質(zhì)控，這樣做的目的是，最大可能地測出以前擴增產(chǎn)物的交叉污染。第29頁,共62頁，星期六，2024年，5月擴增及產(chǎn)物分析區(qū)熱循環(huán)儀的電源應專用，并配備一個不間斷電源（UPS）或穩(wěn)壓電源。每次擴增后，可使用可移動紫外燈對擴增熱循環(huán)儀進行照射。擴增儀應定期進行校準。第30頁,共62頁，星期六，2024年，5月第31頁,共62頁，星期六，2024年，5月工作流程第32頁,共62頁，星期六，2024年，5月第33頁,共62頁，星期六，2024年，5月關注采集、保存、運輸?shù)年P鍵點留樣方式、采血管采血后什么時間離心采血后保存溫度、時間離心后保存溫度、時間（運輸）檢測前的保存溫度、時間長期保存的樣本第34頁,共62頁，星期六，2024年，5月第一步：標本的采集-采血管無菌真空采血管一、血清管普通血清管帶分離膠的血清管二、抗凝管EDTA2K或3K抗凝管EDTA2K抗凝間分離膠（PPT)枸櫞酸鈉抗凝管……第35頁,共62頁，星期六，2024年，5月第一步：標本的采集-留樣方式最佳方式：旁袋1管5ml用于核酸檢測2管5ml用于酶免疫測定等3管用于長期保存留樣旁路采樣1管5ml用于核酸檢測2管5ml用于酶免疫測定等3管用于長期保存留樣小辮留樣(不可取)1管5ml用于核酸檢測2管5ml用于酶免疫測定等第36頁,共62頁，星期六，2024年，5月第二步：標本的采集-離心離心條件800-1600g20min離心時間4小時以內(nèi)以免RNA的降解第37頁,共62頁，星期六，2024年，5月第三步：標本的運送應采用不易破碎的容器裝載標本溫度2-8°C符合生物安全標準第38頁,共62頁，星期六，2024年，5月第四步：標本的接收保存確認標本數(shù)量運輸狀態(tài)標本狀態(tài)：溶血、脂血保存：用于檢測的樣本管：檢測前保存4小時內(nèi)離心，離心后2天內(nèi)進行檢測的可存放2-8°C。用于留樣備查的樣本：3個月以內(nèi)存放于-20°C以下，3個月以上置于-70°C以下。第39頁,共62頁，星期六，2024年，5月樣本匯集在Star上進行準備工作：將采血管開蓋后裝載到專用32孔樣品架上。采血管上條形碼一律面向條碼掃描器，以方便掃描條碼。按照要求，將TIP頭、PCR板、24深孔板、洗脫管、磁套、廢棄管放置于平臺相應位置。第40頁,共62頁，星期六，2024年，5月樣本匯集第41頁,共62頁，星期六，2024年，5月樣本匯集第42頁,共62頁，星期六，2024年，5月樣本匯集第43頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸提取同樣在Star核酸提取儀上進行，緊跟Pooling之后，利用自動移液配置裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液等，利用磁性分離功能自動完成核酸樣本的裂解、提取、純化、PCR試劑配制、PCR上樣等實驗操作。第44頁,共62頁，星期六，2024年，5月第45頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸擴增第46頁,共62頁，星期六，2024年，5月結(jié)果確認

陰性反應：進入合格血液的放行程序。陽性反應：單檢分項目檢測呈陽性反應單檢混合項目檢測呈陽性反應混樣分項目檢測呈陽性反應混樣混合項目檢測呈陽性反應第47頁,共62頁，星期六，2024年，5月混樣分項目檢測呈陽性反應按照試劑說明書進行雙孔拆分檢測檢出陽性標本陽性反應標本陰性反應標本進入血液的隔離程序，填寫相關報表，將標本及血液篩查檢測報告送衛(wèi)生部臨床檢驗中心進入合格血液的放行程序全部標本為陰性反應進入合格血液的放行程序，實驗室需查找原因并完成分析報告第48頁,共62頁，星期六，2024年，5月質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制室間質(zhì)量評價第49頁,共62頁，星期六，2024年，5月第50頁,共62頁，星期六，2024年，5月遼寧省血液中心實驗室工作調(diào)整工作模式:早8晚4標本接收--采血當天EIA檢測--采集后第2天,當天出最終結(jié)論報告.核酸檢測:全血EIA(合格)→NAT(第3天)血小板:EIA與NAT平行檢測(第2天)采用依據(jù):快篩、陽性率低確保報告時限血小板30小時全血54小時7+1檢測模式第51頁,共62頁，星期六，2024年，5月標本質(zhì)量的控制采血管選擇采樣方式旁袋采樣（理想）血袋導管采樣(被稀釋的可能、規(guī)定順序-風險降到最低)標本正確標識措施：動作連續(xù)不能中斷清場計算機控制（PDA實物核查、及時傳輸采集信息）離心時間4小時內(nèi)第52頁,共62頁，星期六，2024年，5月計算機控制—保證標本、血液同源標本采集人員采用PDA對血袋、標本管等實物進行核查第53頁,共62頁，星期六，2024年，5月離心處理一、標本采集后離心第54頁,共62頁，星期六，2024年，5月離心處理二、標本接收后實驗室再離心第55頁,共62頁，星期六，2024年，5月江蘇省血液中心

核酸檢測實驗室的設置－應關注的細節(jié)各實驗區(qū)可以移動的物品最好用不同顏色進行標記。以防各區(qū)混用。樣品制備室最好多配備一臺4℃樣品冰箱，用于混樣后樣品的臨時保存；陰陽性對照試劑盒的保存。樣品制備室最好配備開蓋機，用于真空采血管的去帽。在樣品制備室，實驗耗材、試劑準備區(qū)域和樣品處理區(qū)域最好分開。第56頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸檢測實驗室的設置－應關注的細節(jié)各區(qū)還需配備：無粉手套，專用工作服，一次性鞋套、口罩，一次性吸水紙，紗布塊。5～5.5g/100ml的次氯酸鈉溶液，７０％的乙醇溶液等。在樣本制備區(qū)，生物安全柜不應放在實驗室門口等易受人員走動影響的地方，也不應直對分體式空調(diào)?；鞓觾x的加樣吸頭必須帶濾芯。樣品制備區(qū)和核酸檢測區(qū)的儀器還應配備ＵＰＳ電源。第57頁,共62頁，星期六，2024年，5月核酸檢測實驗室的設置－江蘇省血液中心核酸檢測實驗室簡介實驗分區(qū)：分4個室(區(qū))：試劑準備室(區(qū))，為藍色標記；標本制備室(區(qū))，為綠色標記；核酸擴增檢測室(區(qū))，為黃色標記；全